欽東煜 康亞偉 馬天江 宋華勇

肝癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤,多發(fā)于40歲以上中年男性人群,具有惡性程度高、預后差等特點,后期可并發(fā)上消化道出血、肝性腦病、肝破裂、肝腎衰竭等危重癥,現已成為僅次于肺癌的第二大癌癥殺手[1]。我國是肝癌大國,近年來發(fā)病人數持續(xù)增長,年發(fā)病人數超40萬,其防治任務嚴峻且迫切。目前,對于早期肝癌臨床治療通常采用根治性肝切除術,可有效提升患者生存率,但其僅適用于心肺功能正常的未轉移患者,中晚期及轉移患者僅能采用化療及放療,但毒副作用強、長期抑制率低,生存率仍有待提升[2]。龍膽苦苷是自傳統(tǒng)治肝中草藥龍膽中提取的中藥單體,具有抗炎、抗氧化、降血脂、調節(jié)免疫等多種生物學效應[3]。近年來有研究發(fā)現,龍膽苦苷可誘導卵巢癌HeLa細胞凋亡,抑制其生長及遷移,表現出良好的抗實體瘤活性[4]。然而,目前關于龍膽苦苷對于肝癌的治療作用鮮有報道,且缺乏對應的機制研究。本研究采用龍膽苦苷干預肝癌細胞,觀察其對該細胞增殖、遷移的影響,并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌細胞株Hep3B,人正常肝細胞株L-02,購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

龍膽苦苷(純度:99%,上海源葉生物科技有限公司),LipofectamineTM3000試劑盒、p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2) inhibitor質粒(深圳市豪地華拓生物科技有限公司),實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司),兔抗人ASPP2、Beclin1一抗[艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司]。Epoch酶標儀(德國Bioeck公司),DMi6000B熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞Hep3B、人肝細胞L-02分別置于DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(均含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗),37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)箱內飼養(yǎng),隔天換液,待細胞生長至貼壁,胰酶消化傳代,收集對數期細胞用于后續(xù)實驗。每次實驗均設置5個復孔。

1.4 qRT-PCR法檢測Hep3B、L-02細胞系ASPP2 mRNA表達量

取對數期Hep3B、L-02細胞,Trizol法提取總RNA,試劑盒反轉錄為cDNA并定量,根據qRT-PCR試劑盒說明書設置反應體系:雙倍核酸染料10 μL,cDNA 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,加入雙蒸水至總體積為25 μL。反應條件:94 ℃預變性4 min,95 ℃變性45 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,進行45個循環(huán),得出最終CT值,以U6為內參基因,2-△△CT法分析計算ASPP2相對表達強度。實驗所用引物:ASPP2:Forward primer:5'-TTCCCCACCCAGCTA-AGGTA-3';Reverse primer:5'-CTCATTTGCTTTAGAAC-GTCCAG-3';U6:Forward primer:5'-TGAGCGAGGAA-CAAGCCATT-3';Reverse primer:5'-CACTTGAGCAGGC-CCGATTC-3'。重復3次取均值。

1.5 細胞干預、轉染、分組[5]

取對數期Hep3B細胞,PBS重懸,以1×106個/mL接種至6孔板,待細胞再次生長至貼壁,根據LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作,將ASPP2抑制質粒ASPP2 inhibitor轉染至Hep3B細胞,隨機分為轉染組、龍膽苦苷+轉染組,轉染組置于DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),龍膽苦苷+轉染組培養(yǎng)基加入龍膽苦苷(20 μmol/L終濃度)。另取對數期Hep3B細胞分為空白組、龍膽苦苷組,空白組置于DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),龍膽苦苷組培養(yǎng)基另加入龍膽苦苷(20 μmol/L終濃度),干預48 h后進行后續(xù)實驗。

1.6 qRT-PCR檢測各組細胞ASPP2 mRNA表達量

取干預后各組細胞,操作同1.4。

1.7 MTT法檢測細胞增殖能力

取干預后各組細胞,PBS重懸,調整細胞密度為1×106個/mL,接種至96孔板,分別于培養(yǎng)24、36、72 h時,加入新備制MTT溶液20 μL(5.00 g/L),4 h后棄上清,加入DMSO,充分振蕩并溶解晶體后靜置,采用酶標儀測定490 nm處各孔吸光度值,重復3次取均值。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取干預后各組細胞,PBS重懸,調整細胞密度為1×105個/mL,接種至6孔板,待細胞鋪滿后,吸棄培養(yǎng)基,使用無菌移液槍頭經孔中央位置垂直畫出一直線劃痕,PBS沖洗邊緣細胞碎片,加入完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),置于顯微鏡下拍照記錄0 h及24 h后劃痕寬度,計算遷移率=(1-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。

1.9 MDC染色檢測各組細胞自噬小體

取干預后各組細胞,PBS重懸,調整細胞密度為1×106個/mL,接種至24孔板,經MDC染色觀察各組細胞自噬,根據試劑盒說明書要求設計實驗步驟,孔內加入MDC染液400 μL(50 μmol/L)標記自噬小體,標準條件下孵育30 min后PBS清洗,置于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄,綠色光點細胞即為發(fā)生自噬細胞,選取5個不重復視野,計算各組細胞自噬陽性率。

1.10 Western blot法檢測細胞ASPP2、Beclin1蛋白表達量

取干預后各組細胞,PBS清洗,加入RIPA液裂解細胞,轉移至離心管內,冰上離心10 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm),BCA法測定總蛋白并定量。取40 μg蛋白樣本,加入5倍蛋白上樣緩沖液,金屬浴沸騰5 min,離心取上清,恒壓80 V行SDS-PAGE電泳分離,濕轉至膜,加入BSA封閉液,2 h后加入兔抗人ASPP2、Beclin1一抗(1∶500),4 ℃冰箱冷藏過夜,洗膜后混合IgG二抗(1∶2 000),常溫孵育2 h,洗膜后加入ECL發(fā)光液,移至暗盒顯色,凝膠成像分析儀掃描并分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參蛋白,分析Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相對表達水平。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同細胞系中ASPP2 mRNA表達量比較

Hep3B細胞、L-02細胞ASPP2 mRNA表達量分別為(0.93±0.07)、(0.43±0.05),與L-02細胞系比較,Hep3B細胞系ASPP2 mRNA表達量降低(P<0.05)。

2.2 各組細胞ASPP2 mRNA表達量比較

與空白組比較,龍膽苦苷組ASPP2 mRNA表達量升高,轉染組ASPP2 mRNA表達量降低(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,龍膽苦苷+轉染組ASPP2 mRNA表達量降低(P<0.05);與轉染組比較,龍膽苦苷+轉染組ASPP2 mRNA表達量升高(P<0.05),見表1。

表1 各組細胞ASPP2 mRNA表達量比較

2.3 各組細胞增殖能力比較

與空白組比較,龍膽苦苷組24、48、72 h三個時間點吸光度值降低(P<0.05),轉染組24、48、72 h 三個時間點吸光度值升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,龍膽苦苷+轉染組24、48、72 h 三個時間點吸光度值升高(P<0.05);與轉染組比較,龍膽苦苷+轉染組24、48、72 h 三個時間點吸光度值降低(P<0.05),見表2。

表2 各組MTT實驗吸光度值比較

2.4 各組細胞遷移能力比較

與空白組比較,龍膽苦苷組遷移率降低(P<0.05),轉染組遷移率升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,龍膽苦苷+轉染組遷移率升高(P<0.05);與轉染組比較,龍膽苦苷+轉染組遷移率降低(P<0.05),見表3。

表3 各組細胞遷移率比較

2.5 各組細胞自噬陽性率比較

與空白組比較,龍膽苦苷組自噬陽性率降低(P<0.05),轉染組自噬陽性率升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,龍膽苦苷+轉染組自噬陽性率升高(P<0.05);與轉染組比較,龍膽苦苷+轉染組自噬陽性率降低(P<0.05),見表4。

表4 各組細胞自噬陽性率比較

2.6 各組細胞ASPP2、Beclin1蛋白表達比較

與空白組比較,龍膽苦苷組ASPP2蛋白表達升高,Beclin1蛋白表達降低(P<0.05),轉染組ASPP2蛋白表達降低,Beclin1蛋白表達升高(P<0.05);與龍膽苦苷組比較,龍膽苦苷+轉染組ASPP2蛋白表達降低,Beclin1蛋白表達升高(P<0.05);與轉染組比較,龍膽苦苷+轉染組ASPP2蛋白表達升高,Beclin1蛋白表達降低(P<0.05),見表5,圖1。

圖1 各組細胞ASPP2、Beclin1蛋白表達

表5 各組細胞ASPP2、Beclin1蛋白表達比較

3 討論

肝癌是起源于肝細胞或肝內膽管上皮細胞的一種實體腫瘤,可在肝臟內轉移蔓延,以彌漫性結節(jié)及散裝結節(jié)的形式呈現,后轉移至門靜脈誘發(fā)瘤栓,并通過血液轉移至全身各處,或通過淋巴轉移及直接侵犯臨近結腸、胃等組織器官[6]。肝癌起病隱匿,早期無明顯癥狀,中后期則表現為肝區(qū)疼痛、腹水、黃疸,及伴隨病灶轉移位置咯血、胸痛、肺梗塞等癥,最終發(fā)展為伴癌綜合征[7]。乙型、丙型肝炎病毒感染是我國肝癌發(fā)生的主要因素,此外,酗酒、慢性代謝疾病、黃曲霉毒素食物污染亦與其發(fā)生有關[8]。自噬是細胞在饑餓、氧化應激、內質網應激等誘導因素作用下,經溶酶體降解自身損傷細胞器及失活蛋白并重新利用的過程,自噬在肝癌中具有雙向作用,在癌變早期適度自噬可清除退化線粒體,抑制活性氧產生,從而保護染色體穩(wěn)定性,抑制癌癥發(fā)生,過度自噬則有利于肝癌組織循環(huán)利用胞內物質,促進疾病進展[9]。因此,抑制肝癌細胞過度自噬是治療肝癌的關鍵。

中醫(yī)治療癌癥有低毒性、多靶點、改善免疫功能等多種獨特優(yōu)勢。肝癌在中醫(yī)中歸屬于“肝積”、“肥氣”、“鼓脹”等癥范疇,主要病因為飲食勞倦、內傷七情,以致正氣、臟腑虧虛,蘊熱成毒,病邪亂入、癌毒膠著、脾虛生痰、痰毒瘀結于肝,久之發(fā)為肝積,故治療應以清熱解毒、瀉火祛邪為主[10]。中藥龍膽取自龍膽科植物龍膽、條葉龍膽及三花龍膽干燥根和根莖,性寒,味苦,歸肝經、膽經,可清熱、瀉肝、除濕,清代醫(yī)家張錫純謂,其可降胃氣、堅胃質、補胃酸,滋肝血、益膽汁,因肝膽有熱而致病者,皆能愈之[11]。龍膽苦苷是一種天然植物單萜,可通過抑制轉氨酶活性,保護肝細胞膜并促進異物排出,從而減輕肝臟免疫性損傷[12]。孟松等[13]體外細胞實驗顯示,龍膽苦苷可有效抑制人胰腺癌PANC-1細胞的增殖并誘導其凋亡,提示其對消化系統(tǒng)癌癥具有抑制作用。本研究結果顯示,與空白組比較,龍膽苦苷組24、48、72 h三個時間點吸光度值,遷移率及自噬陽性率均降低,提示龍膽苦苷可抑制肝癌細胞增殖、遷移及自噬。

Beclin1是一種自噬特異性蛋白,其可與PI3KCⅢ激酶結合,提升其活性從而招募自噬調控蛋白Atg家族成員,促進自噬小體形成[14]。ASPP2是細胞凋亡調控蛋白家族最早被發(fā)現的成員,其可與p53結合并增強促凋亡蛋白轉錄,從而發(fā)揮抑癌功效[15]。ASPP2亦是Beclin1的負向調控蛋白,可通過抑制核因子抑制蛋白磷酸化,從而抑制其復合物誘導的Beclin1轉錄;ASPP2也可直接同Beclin1結合,減少Beclin1-PI3KCⅢ激酶復合物的形成,影響自噬小體形成[16]。Mao等[17]研究認為,ASPP2在肝細胞癌HCC細胞中可抑制Beclin-1蛋白表達,ASPP2下調提升細胞自噬能力,從而增強HCC細胞生存性及抗化學特性,提示ASPP2或可成為預測肝癌患者預后的一種新型生物標志物。本研究結果顯示,與L-02細胞系比較,Hep3B細胞系ASPP2 mRNA表達量降低,提示ASPP2在Hep3B細胞中異常低表達;與空白組比較,轉染組ASPP2蛋白表達降低、Beclin1蛋白表達升高,且與龍膽苦苷聯用可減弱轉染對肝癌細胞增殖、遷移的影響,提示龍膽苦苷可抑制肝癌細胞增殖、遷移,其作用機制可能與調控ASPP2-自噬途徑有關。

綜上所述,龍膽苦苷可抑制肝癌細胞增殖、遷移,其作用機制可能與促進ASPP2表達從而抑制自噬相關。