趙思捷,李淼靜,陳羽玲,賀揚(yáng)欣,王曉寧

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。MM細(xì)胞能分泌一系列細(xì)胞因子等產(chǎn)物,引起全身多器官系統(tǒng)的損害,以骨損害最為常見(jiàn),又稱為多發(fā)性骨髓瘤骨病(MM bone disease,MMBD)[2]。MMBD表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松、溶骨性病變及病理性骨折等,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后[3]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑6(cystatin E/M,CST6)屬于胱抑素超家族成員,具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性,在黑色素瘤、宮頸癌等惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),CST6能夠抑制破骨細(xì)胞功能和分化,是MMBD潛在的血清標(biāo)志物[5]。白介素17A(interleukin-17A,IL-17A) 主要由T輔助細(xì)胞17(T helper 17, Th17)分泌,參與病原體感染及自身免疫性疾病等病理生理過(guò)程[6]。研究表明,IL-17A能夠抑制機(jī)體免疫功能,促進(jìn)MM細(xì)胞增殖,加重MM患者骨破壞[7]。目前MMBD患者血清CST6、IL-17A水平及臨床意義尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)MMBD患者血清CST6、IL-17A水平,分析兩者與MMBD病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年2月—2020年1月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科診治MMBD患者80例為MMBD組,男40例,女40例,年齡41～77(58.48±6.17)歲;體質(zhì)量指數(shù)(23.18±2.23)kg/m2;免疫球蛋白分型:IgG型36例,IgA型20例,IgD型5例,輕鏈型19例;根據(jù)MM國(guó)際分期體系(International Staging System, ISS)標(biāo)準(zhǔn);Ⅰ期22例,Ⅱ期33例,Ⅲ期25例[8];骨轉(zhuǎn)移部位:脊柱45例,肋骨23例,其他12例;溶骨性病變≥2個(gè)者44例;骨病類型:骨質(zhì)疏松17例,溶骨性破壞35例,病理性骨折21例,其他7例。以同期診治的無(wú)骨病的MM患者50例為對(duì)照組,男26例,女24例,年齡40～78(58.67±6.26)歲;體質(zhì)量指數(shù)(23.24±2.17)kg/m2;免疫球蛋白分型:IgG型20例,IgA型14例,IgD型4例,輕鏈型12例;ISS分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期17例,Ⅲ期20例。2組在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、免疫球蛋白分型及ISS分期之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(XJTU1AF2023LSK-2020-132) ,患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①M(fèi)M診斷符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》標(biāo)準(zhǔn)[9];②MMBD的診斷符合《多發(fā)性骨髓瘤骨病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)[10];③初次診治;④臨床及隨訪資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有其他器官惡性腫瘤;②合并嚴(yán)重心、肺等臟器功能障礙;③合并骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及創(chuàng)傷性骨折;④近1個(gè)月有激素、雙磷酸鹽等治療史。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清CST6、L17A水平檢測(cè):患者入院后次日清晨治療前采集空腹肘靜脈血5 ml,離心留取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清CST6、IL-17A水平。人CST6試劑盒購(gòu)自上?？评咨锟萍加邢薰?貨號(hào)E3893;人IL-17A試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司,貨號(hào)JL19256。試驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 MMBD嚴(yán)重程度分級(jí):結(jié)合CT、MR或PET-CT等影像學(xué)檢查,參考《多發(fā)性骨髓瘤骨病診治指南》[9],對(duì)MMBD患者進(jìn)行分級(jí)。1級(jí):嚴(yán)重的彌漫性骨質(zhì)疏松;2級(jí):1個(gè)解剖學(xué)部位的1個(gè)或多個(gè)溶骨性損害;3級(jí):多個(gè)解剖學(xué)部位的多個(gè)溶骨性損害;4級(jí):嚴(yán)重溶骨性損害并發(fā)病理性骨折。

1.3.3 隨訪情況:所有患者出院后開(kāi)始隨訪,每3～6個(gè)月隨訪1次,采用門診復(fù)查及電話方式進(jìn)行隨訪,主要記錄患者生存情況及生存時(shí)間,隨訪截止至2023年2月1日。隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束。根據(jù)隨訪結(jié)束時(shí)患者生存情況,將患者分為生存亞組(n=55)和死亡亞組(n=25)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清CST6、IL-17A水平比較 MMBD組患者血清CST6水平為(2.11±0.27)μg/L,低于對(duì)照組的(8.25±1.34)μg/L (t=39.798,P<0.001)。血清IL-17A水平為(25.12±4.27)ng/L, 高于對(duì)照組的(12.30±3.21)ng/L (t=18.241,P<0.001)。

2.2 血清CST6、IL-17A與MMBD骨病分級(jí)的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清CST6與MMBD骨病分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.721,P<0.001);血清IL-17A與MMBD骨病分級(jí)呈顯著正相關(guān)(r=0.664,P<0.001)。

2.3 不同預(yù)后MMBD患者臨床病理特征比較 死亡亞組ISS分期Ⅲ期、MMBD骨病分級(jí)4級(jí)、病理性骨折比例及血清IL-17A水平高于生存亞組,而血清CST6水平低于生存亞組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2亞組其余資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 2亞組MMBD患者臨床病理特征比較

2.4 血清CST6、IL-17A對(duì)MMBD患者預(yù)后評(píng)估價(jià)值分析 繪制血清CST6、IL-17A對(duì)MMBD患者預(yù)后評(píng)估價(jià)值ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:血清CST6、IL-17A及二者聯(lián)合對(duì)MMBP患者預(yù)后評(píng)估的AUC分別為0.812、0.888、0.931,以二者聯(lián)合的AUC最大 (Z/P=5.147/<0.001,4.784/<0.001),見(jiàn)表2、圖1。

2.5 影響MMBD患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 以MMBD患者預(yù)后為因變量(賦值:1=死亡,0=生存,t=時(shí)間),將表1中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素(P<0.05)為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:ISS分期Ⅲ期,骨病分級(jí)4級(jí),血清IL-17A高是影響MMBD患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血清CST6高是影響MMBD患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 影響MMBD患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清CST6、IL-17A水平與MMBD患者生存預(yù)后的關(guān)系 MMBD患者80例隨訪中死亡25例,失訪3例。分別以ROC曲線中血清CST6、IL-17A對(duì)預(yù)后評(píng)估的最佳截?cái)嘀?.71 μg/L、26.14 ng/L為界,將MMBD患者分為CST6高表達(dá)亞組(n=39)和低表達(dá)亞組(n=41),IL-17A高表達(dá)亞組(n=38)和低表達(dá)亞組(n=42)。CST6高、低表達(dá)亞組MMBD患者的3年生存率分別為84.62%(33/39)、53.66%(22/41),Kaplan-Meier曲線顯示,CST6低表達(dá)亞組3年累積生存率低于CST6高表達(dá)亞組(Log-rankχ2=7.933,P=0.005)。IL-17A高、低表達(dá)亞組MMBD患者的3年生存率分別為44.74%(17/38)、90.48%(38/42),Kaplan-Meier曲線顯示,IL-17A高表達(dá)亞組3年累積生存率低于IL-17A低表達(dá)亞組(Log-rankχ2=22.802,P<0.001),見(jiàn)圖2。

3 討 論

MMBD是MM的嚴(yán)重并發(fā)癥,患者表現(xiàn)為骨痛、廣泛骨質(zhì)疏松及病理性骨折等,嚴(yán)重影響MM患者生存質(zhì)量及預(yù)后。MM發(fā)生時(shí),骨髓成骨細(xì)胞及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制、破骨細(xì)胞及其分化相關(guān)信號(hào)通路活性增加,引起骨吸收和骨形成平衡的失調(diào),導(dǎo)致MMBD的發(fā)生[11]。目前MMBD的診斷主要依賴影像學(xué)檢查,但影像學(xué)檢查具有滯后性,確診時(shí)疾病往往處于進(jìn)展期或終末期,患者臨床預(yù)后較差[2]。深入研究MMBD疾病機(jī)制,尋找能夠評(píng)估MMBD疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的血清標(biāo)志物,對(duì)于MMBD疾病診治及預(yù)防,具有重要的臨床意義。

CST6屬于2型胱抑素家族成員,由149個(gè)氨基酸組成,結(jié)構(gòu)上含有28個(gè)殘基的信號(hào)肽,其作為半胱氨酸蛋白酶的胞外多肽抑制劑,能夠抑制組織蛋白酶B、組織蛋白酶L等蛋白酶活性[12]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),乳腺癌等惡性腫瘤中CST6表達(dá)顯著下調(diào),其表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤侵襲和骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[13]。本研究中,MMBD患者血清CST6水平降低,與既往學(xué)者在CD138陽(yáng)性MM骨髓瘤細(xì)胞中應(yīng)用二代測(cè)序檢測(cè)的CST6 mRNA表達(dá)下調(diào)的結(jié)果一致[5]。MMBD患者血清CST6水平降低可能與表觀遺傳學(xué)調(diào)控異常有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),CST6基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)導(dǎo)致乳腺癌中CST6表達(dá)顯著降低,而應(yīng)用5-氮雜-2’-脫氧胞苷去甲基化后,腫瘤細(xì)胞中CST6表達(dá)顯著增加[4]。本研究中,血清CST6與MMBD骨病分級(jí)呈負(fù)相關(guān),提示CST6的表達(dá)下調(diào)參與MMBD的疾病進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn),MM中CST6能夠抑制組織蛋白酶K切割鞘氨醇激酶1,抑制經(jīng)典和非經(jīng)典的核因子κB通路激活,抑制破骨細(xì)胞的分化成熟,而CST6表達(dá)下調(diào)促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致MMBD的發(fā)生[5]。尚有研究報(bào)道,CST6的表達(dá)下調(diào)能夠激活組織蛋白酶L,促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的去極化,激活破骨細(xì)胞,促進(jìn)骨小梁吸收及骨重塑過(guò)程[14]。本研究中,CST6低表達(dá)MMBD患者預(yù)后較差,提示血清CST6水平有助于評(píng)估MMBD患者的預(yù)后。筆者分析,一方面是CST6低表達(dá)的MM腫瘤細(xì)胞惡性程度較高,腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng),對(duì)化療藥物治療敏感性較差,導(dǎo)致MMBD患者不良預(yù)后。有研究表明,CST6的表達(dá)下調(diào)能夠激活T盒家族致癌轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá),促進(jìn)乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、腫瘤血管生成及化療耐藥性的形成,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[4]。另一方面,CST6的表達(dá)降低加重MMBD患者骨病的病情嚴(yán)重程度,導(dǎo)致患者不良預(yù)后。有學(xué)者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)CST6能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收過(guò)程,在MM小鼠模型中進(jìn)一步證實(shí),應(yīng)用重組CST6治療MM小鼠,能夠顯著抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MMBD的發(fā)生[13]。因此,CST6表達(dá)降低參與MMBD疾病的發(fā)生發(fā)展,是新的MMBD預(yù)后評(píng)估的血清標(biāo)志物。

IL-17A是IL-17受體家族的成員,參與宿主防御、細(xì)胞運(yùn)輸、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等過(guò)程,在感染性疾病、炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病及癌癥中發(fā)揮調(diào)控作用[15]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),IL-17A基因的rs2275913位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性與MM患者骨病嚴(yán)重程度有關(guān)[7],提示IL-17A是潛在的MMBD血清標(biāo)志物。本研究中,MMBD患者血清IL-17A水平升高,與既往研究報(bào)道一致[16]。MMBD患者血清IL-17A水平升高與骨髓微環(huán)境中CD4+T亞群Th17細(xì)胞活化有關(guān)。研究表明,MM腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子環(huán)境,促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的募集、活化和增殖,導(dǎo)致IL-17A水平增加[17]。本研究中,血清IL-17A水平與MMBD病情嚴(yán)重程度有關(guān)。分析其原因,IL-17A能夠刺激MM中的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞,上調(diào)活化T細(xì)胞核因子1的表達(dá),促進(jìn)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的破骨細(xì)胞樣分化,導(dǎo)致溶解性骨損傷,加重MMBD病情程度[18]。另外, IL-17A能夠通過(guò)上調(diào)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞焦亡的發(fā)生,抑制成骨細(xì)胞增殖,而成骨細(xì)胞的焦亡能夠釋放白介素-1β和核因子κB受體活化子配體,破壞骨代謝過(guò)程[19]。本研究中,IL-17A高表達(dá)MMBD患者預(yù)后較差,多因素分析提示IL-17A高表達(dá)是影響MMBD患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,表明檢測(cè)血清IL-17A水平對(duì)MMBD患者的預(yù)后有預(yù)測(cè)作用。分析其原因,一方面是IL-17A水平升高能夠結(jié)合MM腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體,激活核因子κB信號(hào)通路,促進(jìn)MM腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,導(dǎo)致MMBD患者不良預(yù)后[7]。另一方面,IL-17A水平升高提示MMBD患者中Th17細(xì)胞的過(guò)度活化,Th17細(xì)胞能夠激活骨髓微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞,促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成及骨破壞,加重MMBD骨病嚴(yán)重程度,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[20]。

綜上所述,MMBD患者血清CST6水平降低,IL-17A水平升高,兩者與MMBD患者病情嚴(yán)重程度有關(guān),均參與MMBD疾病進(jìn)展。ISS分期、骨病分級(jí)、血清IL-17A是影響MMBD患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血清CST6是影響MMBD患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。通過(guò)檢測(cè)血清CST6和IL-17A水平,有助于臨床醫(yī)生評(píng)估MMBD病情程度及預(yù)后評(píng)估。本研究也存在不足之處,本研究為單中心回顧性研究,樣本量有限,有待今后設(shè)計(jì)前瞻性多中心大樣本臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙思捷:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫;李淼靜:提出研究思路,論文審核;陳羽玲:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;賀揚(yáng)欣:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改;王曉寧:論文撰寫