胡哲夫,唐其柱,吳青青,馮一洲,周晨亮

心肌肥厚及纖維化常伴有成纖維細胞的過度增殖和膠原分子的合成、分泌。炎性反應和氧化應激等一直是心肌纖維化的元兇之一,其機制復雜且涉及多種炎性分子。既往研究表明,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)具有促炎、促氧化應激等多重作用[1-2]。崔勤濤等[3]應用LPS刺激引起H9c2細胞內發(fā)生強烈的氧化應激反應并使活性氧(ROS)顯著升高。3,3'-二吲哚甲烷(Diindolylmethane,DIM)屬于十字花科植物的天然成分提取物[4-6],其廣泛存在于多種常見的十字花科蔬菜中,如卷心菜、雪里紅、諸葛菜等。已有研究表明,DIM具有抗腫瘤、抗炎、抗增生等多種生理作用[4-7]。另有研究證實,DIM可弱化壓力負荷及其他機制誘導的心肌肥厚和纖維化反應[8]。因此本研究擬用LPS刺激H9c2細胞的增殖,并以DIM干預,來觀察DIM是否對LPS誘導的H9c2細胞增殖能力及氧化應激產生影響,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)H9c2細胞(典君生物科技發(fā)展有限公司提供);(2)藥品及試劑:3,3'-二吲哚甲烷(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,100 mg,純度>98%)、脂多糖(PEPROTECH公司),胰蛋白酶消化液(Gibco公司)、新生胎牛血清(Gibco公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(上海立菲公司)、雙抗(Hyclone公司), CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所);(3)儀器設備:細胞計數儀(Invitrogen公司,型號 C10227),流式細胞儀(美國BD FACScalibur公司, 型號 BD FACSCalibur 1),熒光酶標儀(Synergy HT公司,型號 Synergy H1),恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛公司,型號Thermo 311)。

1.2 實驗方法 2020年10—12月于代謝與相關慢病湖北省重點實驗室進行實驗。H9c2細胞培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養(yǎng)箱中,采用含有20%NCS和1% 雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),使用對數生長期的細胞。當H9c2細胞的生長密度達到約80%后,使用0.125%胰酶消化1 min左右并以1∶2的比例傳代,每次傳代時細胞密度控制在1×105/ml。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 H9c2細胞增殖能力:將H9c2細胞均勻接種至96孔板,每孔100 μl,置于溫箱培養(yǎng)24 h后,將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基饑餓24 h,采用不同濃度DIM(10、20、30 μmol/L)處理干預后,將培養(yǎng)基換為含有10 μl 的CCK-8無血清培養(yǎng)基100 μl,繼續(xù)在溫箱中孵育2 h后置于酶標儀下檢測(波長450 nm)。實驗分為8組:空白對照組(Control),DIM 10 μmol/L(DIMⅠ組),DIM 20 μmol/L(DIMⅡ組),DIM 30 μmol/L(DIMⅢ組),LPS 10 mg/ml(LPS組),LPS 10 mg/ml+DIM 10 μmol/L(LPS+DIMⅠ組), LPS 10 mg/ml+DIM 20 μmol/L(LPS+DIMⅡ組),LPS 10 mg/ml+DIM 30 μmol/L(LPS+DIMⅢ組)。

1.3.2 活性氧(ROS)檢測

1.3.2.1 ROS水平:將H9c2細胞均勻地接種至96孔板中,每孔100 μl ,置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,細胞密度達到80%后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h,采用不同濃度DIM(10、20、30 μmol/L)處理干預24 h后,將96孔板中的培養(yǎng)基換為含有10 μmol/L的DCFH/DA 的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育20 min,之后將培養(yǎng)基吸出,用PBS清洗3次,以排除未進入細胞內部的DCFH/DA干擾。最后再次加入PBS 100 μl ,置于酶標儀下檢測,激發(fā)光波長為485 nm,發(fā)射光波長為525 nm。ROS 水平(%) =干預組熒光值/對照組熒光值×100%,本實驗重復3次。實驗分為5組:空白對照組(Control),LPS組 10 mg/ml(LPS組),LPS 10 mg/ml+DIM 10 μmol/L(LPS+DIMⅠ組),LPS 10 mg/ml+DIM 20 μmol/L(LPS+DIMⅡ組),LPS 10 mg/ml+DIM 30 μmol/L(LPS+DIMⅢ組)。

1.3.2.2 ROS時間點檢測:方法同上,以空白對照組為參照,分別檢測各組在30、60、120 min后H9c2細胞內ROS含量變化。實驗分為3組:空白對照組(Control),LPS組(10 mg/ml),LPS+DIM組(LPS 10 mg/ml+DIM 30 μmol/L)。

1.3.3 炎性指標檢測: 采用RT-PCR檢測白介素(IL)-1β、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、血紅素加氧酶-1(HO-1),以不同濃度DIM(10、20、30 μmol/L)處理12 h后,棄去培養(yǎng)基,以TRIzol 1 ml提取細胞內總RNA,采用紫外分光光度法測定其含量與純度。取約5 μl總RNA逆轉錄為cDNA,以GAPDH 為內參進行PCR 擴增。細胞內mRNA表達cDNA第一鏈的合成參照 PCR試劑盒進行。GAPDH的擴增引物均由上海生物工程公司合成。PCR反應條件為:Cycle 94℃ 2 min, 35 Cycles 94℃ 40 s、65℃ 40 s、 72℃ 1 min,Cycle 72℃ 5 min。實驗分為4組:空白對照組(Control),LPS組(10 mg/ml),LPS+DIM組(LPS 10 mg/ml+DIM 30 μmol/L),DIM組(DIM 30μmol/L)。各引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4 蛋白印跡檢測:使用細胞裂解液冰上裂解細胞10 min,收集并提取蛋白。首先校正GAPDH后,每組10 μl進行10%SDS-PAGE 凝膠電泳,后將蛋白以100 V,90 min轉移至PVDF膜上,用一抗封閉液進行封閉,后用TBST洗膜,一抗孵育過夜后加入羊抗兔二抗進行顯色反應。使用Odyssey圖像分析軟件檢測各組蛋白的相對密度值作為蛋白水平,均以GAPDH作為內參。實驗分為6組:空白對照組(Control),單加LPS組(10 mg/ml),低劑量組(LPS 10 mg/ml+DIM 10 μmol/L),中劑量組(LPS 10 mg/ml+DIM 20 μmol/L),高劑量組(LPS 10 mg/ml+DIM 30 μmol/L),單DIM組(10 μmol/L)。

2 結 果

2.1 各組H9c2細胞增殖能力比較 與未加任何處理因素的空白對照組比較, 3組(DIM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組)單加不同濃度梯度(10～30 μmol/L)的DIM培養(yǎng)H9c2細胞24 h后,其增殖活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但LPS (10 mg/ml)可使細胞增殖活性明顯增加(P<0.01),而DIM在10～30 μmol/L濃度范圍內可顯著弱化上述現象(P<0.01),且呈現濃度依賴性,見表2。

表2 不同濃度梯度DIM對H9c2細胞增殖能力的影響

2.2 H9c2細胞內ROS水平比較 與空白對照組比較,LPS刺激H9c2細胞2 h后,H9c2細胞內ROS含量明顯上升 (P<0．05);與LPS組比較,加入10～30 μmol/L的DIM后H9c2細胞內ROS含量下降,隨著藥物濃度的增加下降趨勢更明顯 (P<0.01),見表3。

表3 不同濃度DIM刺激對H9c2細胞ROS水平的影響

2.3 不同時間DIM干預H9c2細胞內ROS水平的比較 與空白對照組比較,加入LPS 30 min后H9c2細胞內ROS含量開始上升,120 min后更明顯(P<0．05);加入DIM(30 μmol/L)后,ROS均有不同程度的降低,隨DIM作用時間增加細胞增殖活性減低,且差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0．05),見表4。

表4 LPS與DIM刺激H9c2細胞不同時間點的ROS水平比較

2.4 DIM對H9c2胞內相關炎性因子水平的影響 與空白對照組比較,加入LPS 刺激后,H9c2細胞內IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、HO-1含量顯著上升(t/P=73.960/<0.001、31.480/<0.001、17.140/0.001、6.487/0.001、14.270/0.001),加入DIM(30 μmol/L)后,上述指標均有不同程度的降低(t/P=9.783/<0.001、3.541/<0.008、4.609/0.002、7.620/<0.001、3.705/0.006),而單加DIM則無顯著改變(P>0.05),見表5。

表5 不同濃度DIM刺激對細胞各炎性因子水平的影響

2.5 DIM抑制H9c2發(fā)生炎性反應的機制 LPS可顯著上調H9c2細胞內p-ERK、p-JNK、p-P38的表達量,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001);而當DIM(10、20、30 μmol/L)和LPS共同刺激HUVEC 24 h之后,p-ERK、p-JNK、p-P38表現為下調趨勢,且趨勢隨著DIM的濃度升高,蛋白密度下調越明顯,與LPS組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。而單加DIM(30 μmol/L)則對p-ERK、p-JNK、p-P38的表達無顯著影響(P均>0.05),見圖1。

圖1 各組H9c2細胞內p-ERK、p-JNK、p-P38的表達比較

3 討 論

本結果表明,H9c2細胞在經典促炎介質LPS的作用下可顯著增殖并發(fā)生細胞活性的變化，而DIM與LPS同時作用于H9c2細胞時,可有效抑制LPS誘導的H9c2細胞增殖、氧化反應及炎性反應,且呈現明顯的濃度依賴性。另一方面,RT-PCR結果也證實DIM可以減少相關炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等表達水平,蛋白印跡試驗也表明DIM可對抗LPS的促炎作用并降低p-ERK、p-JNK、p-P38的蛋白表達水平。通過該試驗,證實了DIM在LPS誘導的H9c2細胞氧化應激和增殖中發(fā)揮了重要的改善作用。

既往研究表明[15],LPS可在心肌細胞中激活TLRs從而激活NF-κB信號通路從而引起炎性反應爆發(fā),而被激活的NF-κB因子可進一步促進下游的IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌從而形成惡性循環(huán)。IL-6一直被視為膿毒癥和炎性反應的經典標志物,其升高具有典型的代表性意義,可作為細胞內炎性反應程度的重要標志分子。Zhou等[16]研究團隊的一項成果表明,DIM亦通過調節(jié)NF-κB/TGF-β/Smad信號通路減輕放射性肺損傷中的炎性反應和纖維化,而該信號通路也是心臟組織發(fā)生上皮間質轉化的典型通路之一,表明DIM在抑制心肌纖維化等領域可能具有一定的潛在研究價值。而DIM在早期已被證實具有良好的抗炎作用,其可弱化LPS的促炎效果進而降低上述炎性因子的表達水平。氧化應激是炎性損傷的基本病理過程,伴隨大量的炎性因子釋放和活性氧產生。本研究顯示,DIM對LPS誘導的H9c2細胞具有保護作用,可抵抗氧化應激。但已有相關研究證明[17-18],MAPK信號通路在各種原因導致的氧化應激及炎性損傷中發(fā)揮重要調控作用。本研究結果顯示,與空白對照組比較, LPS干預后,P38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平增加, 而DIM可顯著降低P38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平,表明DIM可能通過抑制MAPK信號通路關鍵蛋白的活化而起到對H9c2細胞氧化應激及炎性損傷的保護效應,而且呈現出濃度依賴性。

綜上所述,DIM對LPS誘導的H9c2細胞增殖和氧化反應具有一定程度的抑制作用,有力地說明了DIM對心肌組織的潛在保護作用,另一方面,DIM可通過抑制相關炎性因子的產生從而發(fā)揮抗炎作用,為DIM將來的臨床應用提供了基礎實驗依據。通過本實驗進一步鞏固了DIM治療炎性反應和膿毒癥相關疾病的治療地位,但本次實驗屬于細胞水平,未進行在體研究,心肌纖維化的其他標志物也尚未檢測,因此存在一定的局限性,DIM其他的多重機制仍需要進一步研究,今后需進一步完善深入的機制研究,為DIM防治心血管及其他相關疾病提供更廣闊的前景。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

胡哲夫:課題設計,論文撰寫;唐其柱:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;吳青青:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;周晨亮:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;馮一洲:進行統(tǒng)計學分析