江丹,熊金河,尚華,汪佳利,何芳

狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)最常見和最重要的并發(fā)癥,40%～60%的SLE患者在發(fā)病初期即合并LN,是導(dǎo)致SLE患者發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)和死亡的重要原因[1-2]。及時(shí)、準(zhǔn)確地評估LN腎臟預(yù)后,對促進(jìn)患者預(yù)后改善非常重要。炎性反應(yīng)在LN發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[3],研究表明,長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,LncRNA)、微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)等非編核糖核酸能通過調(diào)控炎性反應(yīng)參與LN發(fā)生發(fā)展[4]。lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA, lncRNA TUG1在SLE患者外周血中低表達(dá)[5]。miR-144是一種炎性相關(guān)miRNA,能通過影響靶蛋白穩(wěn)定性和狀態(tài)發(fā)揮抗炎作用[6]。有學(xué)者指出,miR-144在免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A腎病患者尿沉渣中高表達(dá)[7]。然而關(guān)于LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚未明確,基于此,現(xiàn)分析LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年6月遂寧市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的LN患者104例為LN組,男17例,女87例;年齡18～55歲,中位數(shù)26.00(19.00,34.00)歲;病程1～22年,中位數(shù)7.5(4.00,12.00)年;病理分型[8]:Ⅱ型8例,Ⅲ型20例,Ⅳ型24例,Ⅴ型28例,Ⅲ型+Ⅴ型11例,Ⅵ型+Ⅴ型13例;慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)分期[9]:1期40例,2期24例,3期28例,4期12例。另選取醫(yī)院同期體檢健康者40例為健康對照組,男7例、女33例;年齡18～55歲,中位數(shù)27.00(19.25,35.75)歲。2組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KYLLKS20230114) ,受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):① LN符合《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》[10]診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≥18歲;③行腎穿刺活檢術(shù);④CKD分期1～4期。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①藥物性狼瘡等繼發(fā)性LN;②確診時(shí)已經(jīng)處于CKD分期5期ESRD或已經(jīng)接受腎移植、透析治療;③合并惡性腫瘤;④合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紫癜、炎性腸病等其他自身免疫性疾病;⑤臨床資料和隨訪資料缺失;⑥妊娠及哺乳期婦女;⑦合并心、肝、肺等其他臟器嚴(yán)重功能損害。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)檢測:收集LN患者入院次日和健康對照組體檢時(shí)靜脈血3 ml,離心留取上層血清置于-80℃冰箱中保存待測。使用生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號B511321-0100)提供的TRIzol試劑盒提取血清總RNA,使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司提供的TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號 6160)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)的7500型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀,按照實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(貨號 10928042)說明書進(jìn)行擴(kuò)增。由新貝(上海)生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成引物,反應(yīng)總體積:cDNA 1 μl、上下游引物各2.5 μl、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 10 μl 、ddH2O加至總體積25 μl ;循環(huán)參數(shù):94℃ 3 min 1次,94℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s,共計(jì)35次。lncRNA TUG1上游引物5'-CTGAAGAAAGGCAATCCATC-3'、下游引物5'-GTAGGCTACTACAGGTCATTTG-3';GAPDH上游引物5'-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3'、下游引物5'-TGGGTGGAATCATATTGGAA-3';miR-144上游引物5'-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3'、下游引物5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3';U6上游引物5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGAAATT-3'、下游引物5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTCAG-3'。lncRNA TUG1以GAPDH為內(nèi)參,miR-144以U6為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計(jì)算血清lncRNA TUG1、miR-144相對表達(dá)量。

1.3.2 隨訪和分組:通過門診或電話方式對LN患者隨訪2年,隨訪截至2023年6月或ESRD發(fā)生。ESRD定義為估算腎小球?yàn)V過率(estimate glomerular filtration rate,eGFR)<1 5 ml·min-1·1.73 m-2或透析或腎移植[9]。根據(jù)是否發(fā)生ESRD將LN患者分為預(yù)后不良亞組和預(yù)后良好亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)比較 LN組患者血清lncRNA TUG1表達(dá)低于健康對照組,miR-144表達(dá)高于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與LN組血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)比較

2.2 LN亞組患者臨床/病理特征比較 隨訪2年,LN患者104例中發(fā)生ESRD 36例(34.62%)。2亞組患者性別、年齡、腎穿刺時(shí)病程、并發(fā)疾病、病理分型等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。預(yù)后不良亞組患者CKD 3～4期比例、血肌酐、血尿素氮、miR-144高于預(yù)后良好亞組,eGFR、lncRNA TUG1和誘導(dǎo)治療后完全緩解比例低于預(yù)后良好亞組(P<0.05或P<0.01),見表2。

表2 預(yù)后不良亞組及預(yù)后良好亞組LN患者臨床/病理特征比較

2.3 LN患者血清lncRNA TUG1與miR-144表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)TargetScan網(wǎng)站預(yù)測,lncRNA TUG1與miR-144存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖1)。Pearson相關(guān)性分析顯示,LN患者血清lncRNA TUG1與miR-144表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.797,P<0.001)。

圖1 lncRNA TUG1與miR-144的結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.4 LN患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析 以LN患者預(yù)后不良為因變量(賦值:是為“1”,否為“0”),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,CKD分期4期和miR-144升高為LN患者腎臟預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,誘導(dǎo)治療后完全緩解和eGFR、lncRNA TUG1升高為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05),見表3。

表3 LN患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的價(jià)值 繪制血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的ROC曲線,并計(jì)算AUC,結(jié)果顯示:血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)與二項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的AUC分別為0.772、0.773、0.911,二項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測的AUC最大(Z=3.239、3.247,P均=0.001),見表4、圖2。

圖2 血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum lncRNA TUG1 and miR-144 expression predicting poor renal prognosis in LN patients

表4 血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的價(jià)值

3 討 論

SLE是由環(huán)境、遺傳、性激素等多因素引起的一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病,以體內(nèi)存在大量自身抗體、反復(fù)復(fù)發(fā)與緩解、全身多系統(tǒng)多臟器受累為主要臨床特點(diǎn),能通過循環(huán)、原位免疫復(fù)合物沉積途徑、非免疫復(fù)合物途徑或腎血管病變損傷引起腎臟損傷導(dǎo)致LN[10]。盡管近年來LN診治取得一定進(jìn)展,患者預(yù)后得以較大的改善,但現(xiàn)階段誘導(dǎo)治療方案對增殖性LN完全緩解率仍然較低,且LN具有反復(fù)復(fù)發(fā)的特點(diǎn),導(dǎo)致較多患者仍然會(huì)發(fā)展為ESRD,增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[11]。LN異質(zhì)性高,不同患者臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)和預(yù)后具有個(gè)體差異,因此有必要尋找簡便方法對LN患者腎臟預(yù)后進(jìn)行判斷,對促進(jìn)LN患者腎臟預(yù)后改善具有重要意義。

研究證實(shí)炎性級聯(lián)反應(yīng)在LN中發(fā)揮重要作用,SLE引起的循環(huán)免疫復(fù)合物或原位形成的免疫復(fù)合物沉積能激活補(bǔ)體系統(tǒng),引起炎性細(xì)胞浸潤和炎性介質(zhì)釋放,損傷腎小球足細(xì)胞、腎血管、腎小管間質(zhì)等導(dǎo)致LN,隨著腎損害加重最終導(dǎo)致ESRD[12]。新近研究表明,表觀遺傳參與LN發(fā)生發(fā)展,其中l(wèi)ncRNA能直接或通過海綿miRNA調(diào)控基因表達(dá),進(jìn)而參與LN過程[13]。lncRNA TUG1是位于人染色體22q12.2上的一個(gè)lncRNA,既往研究多報(bào)道其在惡性腫瘤中的作用,近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1還在哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫疾病中發(fā)揮重要作用[14-15]。盧發(fā)菊等[16]實(shí)驗(yàn)報(bào)道,lncRNA TUG1能靶向miR-199a-3p減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎性反應(yīng)。Wang等[17]實(shí)驗(yàn)報(bào)道,上調(diào)lncRNA TUG1能靶向核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶1途徑減輕膿毒癥誘導(dǎo)腎臟炎性反應(yīng),進(jìn)而抑制急性腎損傷發(fā)生。上述研究表明,lncRNA TUG1與腎臟損傷有關(guān)。同時(shí)既往Cao等[5]研究指出,SLE患者外周血lncRNA TUG1低表達(dá)。因此推測lncRNA TUG1可能參與LN過程。本研究結(jié)果顯示,LN患者血清lncRNA TUG1表達(dá)降低,血清lncRNA TUG1表達(dá)升高為LN患者腎臟預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素,這說明血清lncRNA TUG1表達(dá)升高能降低LN患者腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。其原因可能是lncRNA TUG1高表達(dá)能靶向抑制核因子-κB信號通路活化,抑制腎臟炎性細(xì)胞浸潤和炎性介質(zhì)釋放,避免炎性級聯(lián)反應(yīng)對腎臟的損傷,從而降低LN患者腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)[18]。

miRNA也是表觀遺傳的重要一環(huán),能通過與靶基因完全或不完全互補(bǔ)調(diào)控基因表達(dá),進(jìn)而參與LN過程[19]。miR-144是位于人染色體17q11.2上的一個(gè)miRNA,是多種惡性腫瘤的抑制基因,近年研究發(fā)現(xiàn)miR-144也參與骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫疾病過程[20]。Min等[21]實(shí)驗(yàn)報(bào)道,上調(diào)miR-144能促進(jìn)白介素- 1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性因子和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腎細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡。Xu等[22]實(shí)驗(yàn)報(bào)道,上調(diào)miR-144能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,進(jìn)而促進(jìn)大鼠腎細(xì)胞凋亡。上述研究表明,miR-144對腎臟具有重要的保護(hù)作用。重要的是,IgA腎病同LN一樣也屬于免疫性腎病,由免疫系統(tǒng)功能紊亂引起免疫復(fù)合物沉積于腎臟所致[23]。而Duan等[7]研究指出,IgA腎病患者尿沉渣中miR-144高表達(dá)。因此推測miR-144可能參與LN過程。本研究結(jié)果顯示,LN患者血清miR-144表達(dá)升高,為LN患者腎臟預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這說明血清miR-144表達(dá)升高會(huì)增加LN患者腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。其原因可能是miR-144高表達(dá)能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂,促進(jìn)腎臟炎性細(xì)胞浸潤和炎性介質(zhì)釋放,加重腎臟功能和結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而增加LN患者腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)[24]。

本研究通過網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn),lncRNA TUG1與miR-144存在結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1與miR-144在LN患者血清中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA TUG1與miR-144可能共同影響LN病情進(jìn)展。最近馬洪波等[25]實(shí)驗(yàn)也報(bào)道,上調(diào)lncRNA TUG1能靶向吸附miR-144,進(jìn)而抑制LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng),進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示,CKD分期4期、誘導(dǎo)治療后完全緩解和eGFR也能獨(dú)立影響LN患者腎臟預(yù)后,其原因可能是CKD分期4期和eGFR降低反映LN患者腎臟損傷更嚴(yán)重,因此腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)更高;誘導(dǎo)治療后完全緩解提示誘導(dǎo)治療對LN有效,能更好地抑制炎性反應(yīng)發(fā)展,進(jìn)而降低腎臟預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。最后本研究通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)為0.55、1.38時(shí),預(yù)測LN患者腎臟預(yù)后不良的AUC為0.772、0.773;血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.911,大于lncRNA TUG1、miR-144單獨(dú)預(yù)測。說明檢測血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)有助于LN患者腎臟預(yù)后不良預(yù)測,且聯(lián)合檢測血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)能提升預(yù)測價(jià)值。但本研究結(jié)果還需多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,LN患者血清lncRNA TUG1表達(dá)降低,miR-144表達(dá)升高,二者可能共同影響LN腎臟預(yù)后,是LN患者腎臟預(yù)后不良的獨(dú)立影響因子。血清lncRNA TUG1、miR-144表達(dá)聯(lián)合檢測對LN腎臟預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值較高。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

江丹、何芳:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;熊金河、尚華:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;汪佳利:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析