章鑫煦,傅菁嵐,劉鎮(zhèn)宇

(1.中南大學(xué)職工醫(yī)院內(nèi)科,湖南 長沙 410083;2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,廣東 廣州 510120;3.常德市第一人民醫(yī)院,湖南 常德 415000)

糖尿病足潰瘍(DFU)是因糖尿病引發(fā)了神經(jīng)和血管病變,導(dǎo)致皮膚組織缺血壞死,或者由于承重點(diǎn)的受壓造成破損,皮膚不完整,露出皮下脂肪、肌肉組織,形成了潰瘍,是糖尿病的常見并發(fā)癥[1]。DFU的截肢率及死亡率均較高,分別高達(dá)33%、29%[2],給患者及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。糖脂代謝異常、炎性反應(yīng)等在DFU的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[3]。以往研究已經(jīng)證實(shí),維生素D與糖尿病及其并發(fā)癥之間存在密切關(guān)系,能通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素,改善胰島素抵,抑制炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫等途徑產(chǎn)生影響[4];而25羥維生素D[25(OH)D]水平是判定機(jī)體維生素D水平的有效指標(biāo)[4]。維生素D通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[5];過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)與2型糖尿病、胰島素抵抗、糖耐量受損等存在因果關(guān)系[6];血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)在新生血管的形成過程中起作用,高血糖能誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)降低。目前,關(guān)于維生素D對影響DFU患者VDR、PPARγ及VEGF-C表達(dá)的研究報(bào)道少見,本研究初步探討維生素D治療DFU的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2018～2020年我院收治的100例DFU患者,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組與觀察組,每組50例。對照組中男30例,女20例;年齡35～70歲,平均(56.22±7.19)歲;糖尿病病程4～15歲,平均(7.48±1.53)歲,體重指數(shù)(BMI)22～28 kg/m2,平均(25.70±2.14)kg/m2;腰臀比0.37～0.54,平均(0.45±0.08)。觀察組男28例,女22例;年齡36～69歲,平均(57.46±7.38)歲;糖尿病病程4～16歲,平均(8.15±1.77)歲;BMI 23～28 kg/m2,平均(26.05±2.07)kg/m2,腰臀比數(shù)0.38～0.56,平均(0.46±0.09)。兩組基線資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),有可比性。

1.2病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn):①診斷符合《中國糖尿病足防治指南(2019版)》[7]及國際糖尿病足工作組《糖尿病足潰瘍減壓指南(2019版)》[8];②患者年齡≥18歲;③Wagner糖尿病足分級(jí)≥3級(jí);④患者的診療依從性較好;⑤患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他因素導(dǎo)致的足部潰瘍;②合并影響DFU愈合的疾病,如自身免疫性疾病、骨髓炎等;③合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、急性并發(fā)癥等;④合并免疫系統(tǒng)紊亂、骨髓炎和腫瘤等影響DFU愈合的疾病折者;⑤接受放療化療者,或長期使用抗凝血藥、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素者;⑥近3個(gè)月使用過維生素D制劑,對維生素類藥物過敏者;⑦精神異?；蛞庾R(shí)障礙。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批。

1.3治療方法;對照組給予潰瘍清創(chuàng)術(shù),均使用胰島素控制血糖(HbA1c≤8%),改善足部微循環(huán),減輕患肢負(fù)重,傷口敷料,局部外敷抗生素,負(fù)壓封閉引流;進(jìn)行糖尿病健康宣教,飲食指導(dǎo),運(yùn)動(dòng)指導(dǎo)。觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上加用維生素D2注射液(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H11020643,批號(hào):1844572、1912652),15 mg/次,1次/周,連續(xù)治療12 w。

1.4觀察指標(biāo):于治療前后對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。①創(chuàng)面愈合指標(biāo):創(chuàng)面面積,創(chuàng)面深度,創(chuàng)面評分;采用專用標(biāo)尺對創(chuàng)面長度及寬度進(jìn)行測量,計(jì)算創(chuàng)面面積;使用無菌棉簽探測創(chuàng)面最深處,采用專用標(biāo)尺此時(shí)無菌棉簽長度即創(chuàng)面深度;采用《貝茨-詹森標(biāo)準(zhǔn)傷口評估量表》進(jìn)行創(chuàng)面評分,評分內(nèi)容包括肉芽組織、滲液量、壞死組織量、傷口潛行、周圍皮膚顏色、 滲液類型、壞死組織類型及邊緣表皮等8個(gè)項(xiàng)目,每個(gè)項(xiàng)目分值1～ 5 分,總評分8～40分,評分越高表示創(chuàng)面情況越差;②取患者空腹靜脈血5 ml,3 000 r/min條件下離心10 min獲取血清;采用日立7600系列全自動(dòng)生化分析儀檢測血清25(OH)D水平及糖脂代謝指標(biāo):空腹血糖(FBG),糖化血紅蛋白(HbA1c),空腹胰島素(FINS),胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),三酰甘油(TG),總膽固醇(TC),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。③采用RT-PCR、Western印跡(Western)檢測潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白的表達(dá)水平;RT-PCR方法:按試劑盒說明書要求對RNA進(jìn)行提取及濃度定量測定;使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對cDNA進(jìn)行合成,嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作。以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用試劑盒要求的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將擴(kuò)增產(chǎn)物采用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)水平。Western印跡方法提取總蛋白,按照1∶4的比例將PBS緩沖液與總蛋白進(jìn)行混合,混合液于100 ℃條件下進(jìn)行10 min的變性。經(jīng)12% PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上,脫脂奶粉封閉 1～2 h,加入β-actin 孵育過夜,洗膜后加入標(biāo)記的二抗孵育1 h,堿性磷酸酶法顯色、曝光。分別用 VDR、PPARγ、VEGFC 灰度值與β-actin 灰度值的比值作為 VDR、PPARγ、VEGFC 相對表達(dá)量。④觀察不良反應(yīng)情況:治療12 w復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、血鈣等指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn);采用Pearson相關(guān)分析血清25(OH)D水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1兩組患者血清25(OH)D水平及創(chuàng)面愈合指標(biāo)的比較:治療前,兩組之間血清25(OH)D水平、創(chuàng)面面積、創(chuàng)面深度及創(chuàng)面評分的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后,觀察組的血清25(OH)D水平較治療前明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對照組的血清25(OH)D水平較治療前無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),兩組的創(chuàng)面面積、創(chuàng)面深度及創(chuàng)面評分均較治療前明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),觀察組的血清25(OH)D水平明顯高于對照組,創(chuàng)面面積、創(chuàng)面深度及創(chuàng)面評分明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 治療患者前后兩組血清25(OH)D水平及創(chuàng)面愈合指標(biāo)的比較

2.2兩組患者糖脂代謝指標(biāo)的比較:治療前,兩組之間FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TC、TG、HDL-C及LDL-C的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后,觀察組的HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG均較治療前明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),FBG、TC、HDL-C、LDL-C均較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),對照組的各項(xiàng)糖脂代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),觀察組的HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG均明顯低于對照,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前、后糖脂代謝指標(biāo)的比較

2.3兩組患者潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較:治療前兩組之間潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后觀察組潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平均較治療前明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),觀察組潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前、后潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

2.4血清25(OH)D水平與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性:血清25(OH)D水平與創(chuàng)面評分、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05),與VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平呈明顯正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 血清25(OH)D水平與糖脂代謝指標(biāo)、VDR、PPARγ、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.5兩組患者不良反應(yīng)的比較:兩組患者均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng),無明顯肝腎功能及血鈣異常等。

3 討論

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的慢性疾病,DFU是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,截肢率及死亡率均較高。因此,對DFU積極有效的防治,促進(jìn)潰瘍愈合,對肢體功能進(jìn)行保護(hù),對改善患者預(yù)后,提高患者生活質(zhì)量具有重要的臨床實(shí)踐意義。目前,外科清創(chuàng)、減輕負(fù)重、關(guān)注感染或血管重建等措施是臨床處處置DFU的主要治療方案,在一定程度上能降低截肢率,但是效果并不十分理想。國內(nèi)學(xué)者盧愛俊等[9]研究發(fā)現(xiàn),T2DM患者神經(jīng)性足潰瘍的病情越嚴(yán)重,血清25(OH)D水平越低。國外學(xué)者?aglar等[10]的研究表明,糖尿病足組患者的血清25(OH)D水平明顯低于新診斷T2DM患者,并提出補(bǔ)充維生素D能調(diào)節(jié)糖尿病足患者的不良免疫學(xué)變化。由此可知,維生素D在DFU的臨床治療中存在潛在效能。

本研究與王少婷等[11]的研究結(jié)果基本相符;提示補(bǔ)充維生素 D可以顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合,改善糖尿病足患者糖代謝和胰島素抵抗。國外研究顯示,創(chuàng)面愈合DFU患者的血清25(OH)D水平是創(chuàng)面不愈合患者的3倍作用,高水平血清25(OH)D是DFU患者創(chuàng)面愈合的保護(hù)因素[12]。體外研究顯示,維生素D能夠通過上調(diào)糖尿病足角蛋白細(xì)胞中LL-37和β防御素-2的表達(dá),對角化細(xì)胞增殖和遷移進(jìn)行誘導(dǎo),促進(jìn)組織形成,改善局部血供,從而對潰瘍愈合起到促進(jìn)作用[13]。IR增加是糖尿病及其并發(fā)癥的主要臨床特點(diǎn),血清25(OH)D水平降低能促進(jìn)IR增加,維生素D缺乏時(shí)免疫應(yīng)答會(huì)減弱,炎癥反應(yīng)增強(qiáng),并誘發(fā)血管功能不良及加重IR;維生素D通過增加胰島素受體的數(shù)量,增加靶器官對胰島素的敏感性,降低IR,進(jìn)一步降低FINS及HbA1c,提高血糖控制水平。林楚佳等[14]的一項(xiàng)調(diào)查研究顯示,227例糖尿病足患者中147例(64.8%)合并血脂異常;DFU患者下肢血管病變主要是由于組織灌注不良,導(dǎo)致缺血性潰瘍和壞疽;下肢動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致血管腔發(fā)生狹窄或阻塞,引起缺血性潰瘍、局部感染和微循環(huán)障礙,在DFU的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用;而血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究進(jìn)一步提示補(bǔ)充維生素D能促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合,改善糖脂代謝異常。

本研究與國外學(xué)者Razzaghi等[15]的研究結(jié)果相似。VDR是目前已知的受維生素D活性形式——25(OH)D調(diào)節(jié)的唯一受體,主要參與鈣磷調(diào)節(jié)。近期研究發(fā)現(xiàn),VDR也能在免疫細(xì)胞及其他類型細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),通過相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答。PPARγ是重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子。以往研究發(fā)現(xiàn),妊娠期糖尿病患者的血清PPAR-γ表達(dá)水平下調(diào),與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)[16]。PPARγ表達(dá)水平降低及炎癥因子水平增高是妊娠期糖尿病的重要誘因,且PPARγ表達(dá)水平降低可能是炎癥反應(yīng)激活的誘因。T2DM患者的血清PPARγ水平降低,PPARγ是HOMA-IR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能與PPARγ相關(guān)的負(fù)反饋有關(guān)。VEGF-C是一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,能與VEGFR-3及VEGFR-2結(jié)合,促進(jìn)血管的增生及生長;有研究顯示,糖尿病足患者病變皮膚組織中VEGF及相關(guān)mRNA表達(dá)下調(diào),其表達(dá)水平降低可導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合[17]。王明利等[18]的研究顯示,血管腔內(nèi)成形術(shù)能通過上調(diào)創(chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC軸的表達(dá),以促進(jìn)糖尿病足患者的創(chuàng)面愈合。羅麗婭等[19]的研究顯示, 維生素D可能通過VDR/PPARγ信號(hào)通路,促使巨噬細(xì)胞內(nèi)VDR、PPARγ、VEGFC表達(dá)增加,減輕高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究進(jìn)一步證明了維生素D能通過上調(diào)潰瘍皮膚組織中VDR、PPARγ、VEGFC表達(dá),促進(jìn)DFU患者的創(chuàng)面愈合,起到治療作用。

綜上所述,維生素D能促進(jìn)DFU創(chuàng)面愈合,改善糖脂代謝,可通過增加VDR、PPARγ、VEGF-C的表達(dá)起到治療DFU的作用。但是還需要大樣本、多中心的前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證。