毛雪寶，王秀虹，邱彬，李美靈，馬丹，蔣金朋

咸寧市中心醫(yī)院（湖北科技學院附屬第一醫(yī)院）婦科，湖北咸寧 437100

當前宮頸癌已被列為全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在女性腫瘤死亡原因中居第四位[1]。流行病學資料顯示，約85%的宮頸癌發(fā)生在低收入地區(qū)和國家[2]。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，約95%的腫瘤組織中已鑒定出HPV 基因組，其中HPVE7和E6基因整合到宿主基因組被認為是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[3]。目前，接種HPV 疫苗是預防宮頸癌最直接有效的方法，但各國由于醫(yī)療負擔的不同尚未能實現(xiàn)有效推廣。宮頸癌早期臨床癥狀與宮頸炎十分相似，因而容易漏診，而當確診時往往已處于中晚期，預后不佳[4]。因此，探究高靈敏度和特異度的無創(chuàng)生物標志物對宮頸癌的早期篩查、診斷、治療和預后監(jiān)測具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有共價閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA，經(jīng)證實其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。circ_0010423 來源于親本基因磷酸酶張力蛋白同源物誘導激酶1（phosphatase and tensin homolog induced kinase 1，PINK1），位于人染色體chr1：20966384-20971165 區(qū)域，由其第3 和4 號外顯子頭尾剪接拼接形成，長度為284 bp。作為一種新的circRNA，目前尚無研究報道circ_0010423與宮頸癌的關(guān)系。研究組前期通過生物信息學分析基因表達綜合（Gene Expresion Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中有關(guān)宮頸癌的circRNA 微陣列表達譜發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 在宮頸癌中高表達。本研究驗證circ_0010423 在宮頸癌中的表達水平，分析臨床意義，并探討其與宮頸癌患者預后的關(guān)系，以期為改善該病的診療提供相關(guān)理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年1 月至2017 年12 月咸寧市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者的病歷資料。納入標準：經(jīng)病理檢查證實為宮頸癌；術(shù)后隨訪依從性好；病歷資料完整。排除標準：其他部位腫瘤伴宮頸轉(zhuǎn)移；因嚴重肝、腎、心及肺功能不全，凝血功能障礙，血糖、血壓控制不良等無法耐受手術(shù)；嚴重精神障礙；無手術(shù)治療意愿。根據(jù)納入、排除標準，共納入180 例宮頸癌患者，年齡33～74 歲，平均（56.08±12.07）歲，＜60歲77例，≥60歲103例；腫瘤大?。海? cm 125 例，≥4 cm 55 例；組織學類型：鱗狀細胞癌148 例，腺癌32 例；分化程度：高分化140 例，低分化40 例；高危型HPV 感染：無115 例，有65 例；宮頸浸潤：＜2/3 53 例，≥2/3 127 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無68例，有112 例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期119例；糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）：＜35 U/ml 87 例，≥35 U/ml 93 例；鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）：＜4 μg/L 46 例，≥4 μg/L 134例。取180 例宮頸癌患者的宮頸癌組織和癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 離心吸附柱法提取樣本中總RNA 取出液氮中保存的組織塊10～20 mg，加入300 μl 裂解液（含β-巰基乙醇），剪碎組織塊并用研磨杵徹底研磨。加入590 μl ddH2O 和10 μl 蛋白酶K，56 ℃放置15 min，13 000 r/min 離心5 min，取上清。上清中加入0.5 倍體積的無水乙醇，混勻后置于吸附柱中，13 000 r/min 離心60 s。首先吸附柱中添加350 μl去蛋白液RW1，13 000 r/min 離心60 s。隨后吸附柱中添加80 μl 的DNase Ⅰ工作液，37 ℃放置15 min，并加入350 μl 去蛋白液RW1，13 000 r/min離心60 s。然后吸附柱中加入500 μl 漂洗液RW，37 ℃靜置2 min，13 000 r/min 離心60 s。最后將吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入50 μl ddH2O，37 ℃靜置2 min，13 000 r/min 離心2 min，即得到總RNA，并測定純度與濃度。

1.2.2 隨機引物法進行互補DNA 合成 取微型離心管，依次加入1 μl 隨機引物（50 ng/μl）、1 μl dNTP mix（10 mmol/L）、2 μg 總RNA 以及適量ddH2O 至總體積為13 μl，充分混勻，65 ℃反應5 min，然后放置冰上至少1 min。隨后向離心管中依次加入4 μl 5×SSIV Buffer、1 μl 100 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 μl 核糖核酸酶抑制劑以及1 μl Super-Script?Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μl），充分混勻，23 ℃反應10 min，53 ℃反應10 min，80 ℃反應10 min，即得到互補DNA，并放置-20 ℃保存。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（poIymerase chain reaction，PCR）法檢測circ_0010423、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metaIIoproteinase，MMP）2、MMP9mRNA 水平 取微型離心管，依次加入12.5 μl 2×TB Green Premix Ex Taq ⅡROX plus buffer、1 μl 上游引物（10 μmol/L）、1 μl 下游引物（10 μmol/L）、2 μl 互補DNA（＜100 ng）以及8.5 μl ddH2O至總體積為25 μl，充分混勻。95 ℃反應30 s，一個循環(huán)；95 ℃反應5 s，60 ℃反應45 s，40 個循環(huán)；72 ℃反應5 min，4 ℃反應20 min，一個循環(huán)。引物由生工生物工程公司合成，circ_0010423 上游：5'-GTCGACTACCCTGATGTGCT-3'，下游：5'-GTAAGTGACTGCTCCATACTCC-3'；MMP2上游：5'-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3'，下游：5'-GGTCACATCGCTCCAGACT-3'；MMP9上游：5'-TGTACCGCTATGGTTACACTCG- 3'，下游：5'-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；GAPDH上游：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3'，下游：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。以GAPDH為內(nèi)參對照，并使用2-ΔΔCt法計算樣本中circ_0010423、MMP2及MMP9mRNA 表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5.0 軟件制圖。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗分析circ_0010423 表達與預后的關(guān)系；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的診斷價值，并計算曲線下面積（area under the curve，AUC）；相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)性分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織中circ_0010423 表達水平的比較

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組織中circ_0010423 表達水平為（0.611±0.154），明顯高于癌旁組織的（0.394±0.107），差異有統(tǒng)計學意義（t=15.253，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達水平的比較

有高危型HPV 感染、宮頸浸潤≥2/3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO 分期為Ⅲ～Ⅳ期的宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達水平分別明顯高于無高危型HPV 感染、宮頸浸潤＜2/3、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；不同年齡、腫瘤大小、分化程度、組織學類型及CA125、SCC-Ag 水平宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423表達水平的比較

2.3 circ_0010423 表達與宮頸癌患者預后的關(guān)系

以腫瘤組織中circ_0010423 表達水平的均數(shù)（0.611）為界，將宮頸癌患者分為circ_0010423 高表達患者95 例與circ_0010423 低表達患者85 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，circ_0010423 高表達患者5 年生存率明顯低于circ_0010423 低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.493，P＜0.01）。（圖1）

圖1 circ_0010423高表達（n=95）與circ_0010423低表達（n=85）宮頸癌患者的生存曲線

2.4 宮頸癌組織中circ_0010423 與MMP2、MMP9表達的相關(guān)性

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組織中MMP2、MMP9mRNA 表達水平分別為（1.03±0.18）、（4.62±0.80），分別明顯高于癌旁組織中的（0.34±0.09）、（1.55±0.23），差異均有統(tǒng)計學意義（t=13.290、21.584，P＜0.01）。宮頸癌組織中circ_0010423 與MMP2、MMP9的表達水平均呈正相關(guān)（r=0.703、0.855，P＜0.01）。

2.5 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的診斷價值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，circ_0010423 單獨檢測診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的AUC 大于CA125和SCC-Ag 單獨檢測，但三者聯(lián)合檢測時AUC 最大。（表2、表3）

表2 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 單獨及聯(lián)合檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值

表3 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 單獨及聯(lián)合檢測對宮頸浸潤的診斷價值

3 討論

circRNA 是一類內(nèi)源性、保守的單鏈RNA，由于沒有5'帽和3'poly-A 尾結(jié)構(gòu)，使得其穩(wěn)定表達于各種組織和細胞外液中[6]。隨著高通量測序和生物信息學的發(fā)展，越來越多的circRNA 在各種物種、組織及細胞系中被鑒定出來[7]。目前一些circRNA 已被證明可參與腫瘤相關(guān)的生物學過程，包括增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等[8-9]。例如，circ_P4HB 通過調(diào)節(jié)miRNA-1184/溶質(zhì)載體家族7成員 11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）通路保護肺腺癌免于鐵死亡并促進惡性進展[10]。circ_NFATC3 作為腫瘤抑制因子通過調(diào)節(jié)JUN 氨基末端激酶（JUN N-terminal kinase，JNK）、c-Jun、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）和雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路抑制肝細胞癌進展[11]。此外，宮頸癌中circ_0000745 下調(diào)通過降低E-鈣黏蛋白表達來增強細胞增殖、遷移和侵襲的能力[12]，而circ_0087429 上調(diào)則可抑制細胞增殖、遷移和侵襲的能力[13]。因此，針對circRNA 作為腫瘤候選生物標志物和潛在治療靶點的研究具有十分廣闊的應用前景和科學意義[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中circ_0010423 表達水平高于癌旁組織，與GSE169057 和GSE166466芯片報道結(jié)果一致。通過分析circ_0010423 表達與宮頸癌臨床特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，circ_0010423表達與高危型HPV 感染有關(guān)，提示circ_0010423 可能參與HPV 介導的宮頸癌致癌過程；circ_0010423表達與FIGO 分期有關(guān)，說明circ_0010423 可以影響宮頸癌進展，與已發(fā)表的調(diào)控宮頸癌進展相關(guān)的circRNA 具有相似性，如circ_ABCB10[15]、circ_0087429[13]、circ_CLK3[16]等；此外，circ_0010423 表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸浸潤有關(guān)，說明circ_0010423 可以影響宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移。MMP2 和MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，是一種細胞外基質(zhì)蛋白水解酶，與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中MMP2、MMP9mRNA表達水平均高于癌旁組織，該結(jié)果與既往文獻報道一致[18]。并且circ_0010423 與MMP2、MMP9表達水平均呈正相關(guān)，進一步說明circ_0010423 可以調(diào)控宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移。以上證據(jù)表明，circ_0010423 在宮頸癌進展中具有重要作用。

通過生存曲線分析circ_0010423 表達與宮頸癌患者預后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 高表達患者5 年生存率低于circ_0010423 低表達患者，說明circ_0010423 表達與預后有關(guān)，可以作為宮頸癌預后監(jiān)測的一個重要指標。眾所周知，腫瘤預后與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高侵襲轉(zhuǎn)移患者往往預示預后不良。因此，早期監(jiān)測宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移從而合理制訂治療方案對提高患者預后具有重大意義。本研究通過ROC 曲線比較circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的診斷價值發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 單獨檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的診斷效能高于CA125 和SCC-Ag 單獨檢測，但三者聯(lián)合檢測時診斷效能最高，說明circ_0010423 聯(lián)合CA125 和SCC-Ag 是診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的潛在標志物。

眾多研究表明，miRNA參與調(diào)控宮頸癌進展，如miRNA-93-5p[19]、miRNA-18a[20]、miRNA-485-5p[21]及miRNA-132 等[22]。circRNA 可作為競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控miRNA表達從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[23]。為了進一步從分子機制層面解釋circ_0010423與宮頸癌進展有關(guān)，研究組采用生物信息學工具（https://circinteractome.nia.nih.gov/mirna_target_sites.html）發(fā)現(xiàn)一批miRNA 可能受circ_0010423 調(diào)控，其中包括miRNA-1290、miRNA-149、miRNA-296-5p、miRNA-331-3p、miRNA-432、miRNA-503、miRNA-524-3p、miRNA-525-3p、miRNA-564、miRNA-589、miRNA-639 及miRNA-885-3p。這些miRNA 中miRNA-149[24]、miRNA-296-5p[25]、miRNA-331-3p[26]、miRNA-432[27]及miRNA-503[28]已被證實可以抑制宮頸癌進展。據(jù)此推測，circ_0010423 可能通過調(diào)控上述miRNA 參與宮頸癌進展，但仍有待細胞實驗與動物模型驗證。

綜上所述，circ_0010423 在宮頸癌中表達上調(diào)，與高危型HPV 感染、宮頸浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期及預后有關(guān)。circ_0010423 聯(lián)合CA125 和SCC-Ag 有作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤診斷標志物的潛力。