李安　舒健虹　劉曉霞　路雪萍　焦?jié)O　王小利　趙德剛

摘 要 為探究干旱脅迫下不同枯草芽孢桿菌對玉米苗期葉片的生理調(diào)節(jié)作用，通過對干旱與正常水分下玉米根部接種R9-1、R59、R60等3 種不同植物根際的枯草芽孢桿菌及R59+R60組合菌種，測定玉米苗期葉片的抗氧化酶活性、細胞滲透物質、細胞膜氧化產(chǎn)物、H2O2、內(nèi)源激素、相對含水量等生理生化調(diào)節(jié)物質以及葉片的K、P、N含量。通過主成分分析與相關性分析發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌主要影響玉米苗期葉片的可溶性糖、脫落酸（ABA）、磷（P）含量、超氧化歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性、葉片游離脯氨酸（PRO）含量、葉片相對含水量，其中葉片相對含水量與其他生理表現(xiàn)因子呈顯著的負相關關系。干旱脅迫下，接種枯草芽孢桿菌的玉米苗期葉片抗氧化酶活性、細胞滲透調(diào)節(jié)物質、P、N含量顯著降低。接種R9-1、R59降低H2O2與ABA含量，接種R60、R59+R60提高ABA含量，接種R59、R60、R59+R60降低吲哚乙酸含量。隸屬函數(shù)綜合分析枯草芽孢桿菌對玉米的調(diào)節(jié)作用排名為：正常情況下R60＞ ?R59＞R9-1＞R59+R60＞CK1；干旱脅迫下R60＞R59+R60＞R59＞R9-1＞CK2。綜上所述，接種枯草芽孢桿菌玉米苗期葉片的生理表現(xiàn)為抗氧化酶活性、細胞滲透調(diào)節(jié)物質、P、N含量顯著降低，同時R59、R60、 ?R59+R60均有效提升玉米苗期葉片的相對含水量，說明接種枯草芽孢桿菌玉米苗期受干旱脅迫影響程度較小，所以接種枯草芽孢桿菌具有提升玉米苗期適應干旱脅迫的調(diào)節(jié)能力，從而保證自身的生長發(fā)育。

關鍵詞 玉米；枯草芽孢桿菌；隸屬函數(shù)；干旱脅迫

玉米是中國重要的糧飼作物，在全國大面積種植，可作為工業(yè)原料、食品、牲畜飼料，在中國糧飼生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構方面發(fā)揮著重要作用。干旱是制約農(nóng)作物生長的重要非生物因素之一，提高作物抗逆性是提高產(chǎn)量的一種有效方式。對于多數(shù)作物而言，干旱脅迫反應敏感的關鍵時期都是芽期和苗期［1］，研究發(fā)現(xiàn)利用植物根際促生菌提升植物抗逆性是一種有效的方式，其中Bacillus megaterium、Bacillus aryabhattai、Bacillus megaterium等菌種均促進玉米種子萌發(fā)［2］。處于干旱脅迫下，B.megaterium、B.aryabhattai、B.megaterium等菌種對玉米芽期的抗氧化酶系、滲透調(diào)節(jié)物質、細胞膜氧化產(chǎn)物均有顯著的調(diào)控作用，其中顯著降低了玉米芽尖的 MDA 含量，能有效減弱玉米芽期細胞受干旱的損傷［3］?？莶菅挎邨U菌（B.subtilis）是一種植物根際促生菌，其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶。因此，前人研究主要在枯草芽孢桿菌對植物病害生物防治方面的應用，目前發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在黃瓜［4-5］、辣椒［6-7］、水稻［8-9］、小麥［10-12］、玉米［13-14］等農(nóng)作物病害上存在較好防治效果［15］。生物防治機理是其產(chǎn)生的細胞素、酶類、活性蛋白質等物質能夠對霉菌、酵母、細菌具有一定的抑制作用；同時可通過溶菌作用是拮抗微生物生長，主要方式為吸附在病原真菌的菌絲上，并隨著菌絲生長而生長，而產(chǎn)生溶菌物質消解菌絲體，能使菌絲發(fā)生斷裂、解體、細胞質消解，有的菌絲原生質凝結；或者是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對病原菌孢子的細胞壁產(chǎn)生溶解作用，致使細胞壁穿孔、畸形等現(xiàn)象［4］。與此同時又能產(chǎn)生生長激素，如生長素（Auxin，）、赤霉素（Gibberellin）、細胞分裂素（Cytokinin）、脫落酸（Abscisic acid）和乙烯（Ethylene）等，促進植物生長，繼而改善農(nóng)作物生長發(fā)育［16-17］?；谏L激素在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用，為此探討枯草芽孢桿菌對玉米苗期處于干旱脅迫下的生理調(diào)節(jié)作用，為枯草芽孢桿菌作為添加劑的生物菌肥的開發(fā)與玉米抗旱性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材? 料

供試玉米（Zea mays L.）種子品種為‘金玉818，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧所提供。菌種由貴州省野外采集實驗室保存及生物商品菌肥篩選而來（表1）。盆栽土壤取自貴州省農(nóng)業(yè)科學院內(nèi)，理化數(shù)據(jù)（貴陽）如表2。

1.2 試驗方法

1.2.1 方? 法

將編號為B、C、D、E 4個菌種培養(yǎng)擴增，調(diào)節(jié)OD600值至0.9左右用于菌種試驗。將每組90粒玉米種子于10%次氯酸鈉溶液下消毒20 min，再用無菌水洗滌3～5 次，自然晾干，備用。

將消毒后的玉米分別置于80 mL不同的菌液（表3）中浸泡4 h作為試驗組，CK1（正常處理不接種菌）和CK2（干旱處理不接種菌）的玉米置于80 mL滅菌的菌體培養(yǎng)基中浸泡4 h作為對照組，然后將玉米在無菌條件下移至培養(yǎng)皿中，待試驗組玉米表面菌液與對照組玉米表面培養(yǎng)基自然風干后，播種于裝有滅菌土壤的同種規(guī)格的花盆中，每盆5粒，每組8個重復。玉米第1次出土時記錄玉米苗出土情況，直至玉米出土期結束，將各處理的多余玉米移除，保留每盆2株玉米苗即可。待玉米三葉期時向試驗組花盆中玉米根部周圍每株注入20 mL OD600為0.9左右的對應菌液（B、C、D、E），對照組（CK1，CK2）花盆中玉米根部周圍每株注入20 mL LB液體培養(yǎng)基，待玉米生長10 d后進行干旱處理。正常處理按土壤最大持水量80%，干旱處理按土壤最大持水量40%來控制水分，干旱20 d后取玉米葉片進行指標測量。測量指標分別為玉米苗期的葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性、葉片游離脯氨酸（PRO）含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、H2O2含量、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）含量、吲哚乙酸（IAA）含量、脫落酸（ABA）含量、相對含水量、鉀（K）含量、磷（P）含量、氮（N）含量等。

1.2.2 指標測量方法及計算公式 SOD活性、CAT活性、POD活性、PRO含量、MDA含量、可溶性糖含量、H2O2含量等均授權蘇州格銳思生物科技有限公司按表4所示試劑盒使用方法進行測定。

ACC含量、吲哚乙酸（IAA）含量、脫落酸（ABA）含量等由上海三黍生物科技有限公司采用LC-MS法測定。

相對含水量測定公式：相對含水量=（總鮮質量-干質量）/（葉片飽和吸水質量-干質量）×100%

K、P、N含量測定：采用硫酸-雙氧水消解，凱氏法測定植物全氮含量，鉬銻抗吸光光度法測定植物全磷含量，原子吸收分光光度計測定植物全鉀含量［18］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行統(tǒng)計分析，方差分析采用Spss 20軟件分析。

式中，Xij和 Xj分別表示第i處理第j個指標的隸屬值和所有株系第j 個指標的平均值; Xmin和Xmax表示第j個指標的最小值和最大值；計算隸屬函數(shù)值時，若指標與耐旱性呈正相關用公式（1） ，若指標與耐旱性呈負相關用公式（2） 。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑對干旱脅迫下玉米葉片表型特征的影響

由圖1可知，干旱條件下不同微生物菌劑對玉米表型影響各異，與對照相比，接種枯草芽孢菌劑后玉米對干旱脅迫的干旱癥狀明顯減弱，而對照（CK2）的葉片明顯萎蔫卷曲下垂，葉尖和葉基出現(xiàn)焦枯的癥狀。正常情況下接種不同枯草芽孢桿菌菌種后表型變化并不明顯。

2.2 干旱脅迫與正常情況下微生物菌劑對玉米苗期葉片抗氧化酶活性的影響

如圖2所示，干旱脅迫下玉米葉片SOD活性和POD含量比正常情況有一定程度的升高，接種枯草芽孢桿菌后，在干旱脅迫的情況下玉米葉片SOD、CAT和POD活性均顯著（P＜0.05）降低，不同菌種降低的程度不同；正常情況下與干旱脅迫不同的是除接種C顯著降低CAT活性與接種E顯著升高CAT活性外，其余接種的菌種對玉米苗期葉片CAT活性影響不顯著，而接種的菌種僅B對玉米苗期葉片POD活性差異不顯著，其余菌種均顯著降低POD活性，所以不同的菌種在干旱脅迫與正常情況下對玉米抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)存在差異，同時同種條件下不同的菌種對玉米抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)也存在差異。

2.3 干旱脅迫下微生物菌劑對玉米苗期葉片滲透壓調(diào)節(jié)物質積累的影響

如圖3所示，干旱脅迫下玉米苗期葉片細胞內(nèi)滲透壓物質積累較正常條件下均有不同程度增加。接種枯草芽孢桿菌后均顯著（P＜0.05）降低玉米苗期葉片滲透物質PRO含量與可溶性糖含量的積累，不同的菌種降低程度存在差異。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著提升玉米苗期葉片PRO含量的累積，而對于可溶性糖積累的影響除接種D不顯著外，接種B與C顯著降低，接種E顯著升高可溶性糖；上述可知不同的菌種在干旱脅迫與正常情況下對玉米苗期葉片滲透物質含量的調(diào)節(jié)存在差異，同時同種條件下不同的菌種對玉米苗期葉片滲透物質的調(diào)節(jié)也存在差異。

2.4 干旱脅迫下微生物菌劑對玉米苗期葉片活性氧累積的調(diào)節(jié)

由圖4可知，遭遇干旱時玉米苗期葉片活性氧累積會升高，處于正常情況下，接種B、D和E時玉米苗期葉片活性氧累積顯著（P＜0.05）高于對照組，接種C顯著降低玉米苗期葉片活性氧累積；處于干旱脅迫下接種D與E對玉米苗期葉片活性氧的影響不顯著，接種B與C顯著降低玉米苗期葉片活性氧累積。

2.5 干旱脅迫下微生物菌劑對玉米苗期葉片膜脂過氧化物的影響

MDA是干旱脅迫造成細胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一。如圖5所示，干旱脅迫下玉米苗期葉片MDA含量升高，接種不同的菌種對玉米葉片MDA含量的累積呈現(xiàn)出不同的影響，干旱脅迫下接種B菌種對玉米苗期葉片MDA含量的累積無明顯差異，接種C、D、E均顯著（P＜0.05）降低MDA含量的累積。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米苗期葉片MDA含量的累積，且不同菌種降低程度不同。

2.6 微生物菌劑對玉米苗期葉片激素的影響

如圖6所示，在干旱脅迫與正常情況下接種微生物菌劑對玉米苗期葉片激素的調(diào)節(jié)情況，干旱脅迫下玉米葉片ACC與ABA含量均升高，而對IAA的影響程度不明顯。接種不同菌劑對玉米葉片ACC、ABA、IAA含量的影響程度不同。正常情況下，接種B、D、E顯著提高玉米葉片ACC含量，接種C對玉米葉片ACC含量差異不顯著；接種C、D、E顯著降低玉米葉片IAA含量，其余處理差異不顯著；接種B、E顯著升高葉片ABA含量，接種C、D顯著降低玉米葉片ABA含量。干旱脅迫下接種B顯著提高玉米葉片ACC含量，其余處理對葉片ACC含量影響差異不顯著；接種D、E兩種菌種顯著降低玉米IAA含量，接種B、C差異不顯著；接種B、C顯著升高玉米葉片ABA含量，接種D、E則顯著降低IAA含量。綜上所述，添加菌劑對玉米處于正常與干旱脅迫的情況下其葉片激素的含量有著不同程度的影響，存在降低與升高兩種模式。

2.7 微生物菌劑對玉米苗期葉片相對含水量的影響

如圖7所示，干旱脅迫下能夠降低玉米葉片相對含水量，接種不同的菌種對玉米苗期葉片的相對含水量影響不同。正常情況下，接種枯草芽孢桿菌B顯著降低玉米葉片相對含水量，其余各試驗組均與對照組差異不顯著。而處于干旱脅迫下，接種C、D、E? 3種菌種均顯著提高玉米相對含水量，接種B對玉米葉片相對含水量影響不顯著，說明處于干旱脅迫時接種C、D、E? 3種枯草芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)玉米葉片相對含水量。

2.8 微生物菌劑對玉米苗期葉片K、P、N含量的影響

如圖8所示，水分與接種枯草芽孢桿菌對玉米苗期的K含量影響不大，而干旱脅迫下玉米葉片N含量增加，接種不同的枯草芽孢桿菌對葉片N含量存在不同的影響，其中正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低了玉米苗期葉片N含量，干旱脅迫下也大致呈現(xiàn)出相同的趨勢。除干旱脅迫下接種B菌種對玉米葉片P含量影響不顯著外，正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米葉片P含量。說明干旱脅迫與正常情況下接種枯草芽孢桿菌對于玉米葉片常規(guī)營養(yǎng)指標存在影響，特別是N和P的影響。

2.9 玉米苗期受微生物菌劑影響指標的篩選及影響因數(shù)之間的相關性分析

對玉米葉片ACC、吲哚乙酸、脫落酸、抗氧化酶活性、細胞滲透物質、細胞膜氧化產(chǎn)物、N、P、K等指標進行主成分分析，本試驗提取3個主成分（表5和表6），其中第一主成分的特征值為 ?7.262，貢獻率為51.868%，對應特征向量中，數(shù)量較大的指標有可溶性糖、脫落酸、CAT等。第二主成分的特征值為2.737，貢獻率為 ?19.551%，對應的特征向量中主要表現(xiàn)在吲哚乙酸和P含量方面。第三主成分的特征值為1.504，貢獻率為10.740%，對應的特征向量中主要表現(xiàn)在SOD活性、相對含水量、POD活性方面。以上3個主成分的累計貢獻率為82.159%，基本包含了所測指標的全部信息。結合表7可看出，玉米苗期葉片各影響因數(shù)之間的相關性：葉片相對含水量與ACC、吲哚乙酸、脫落酸、抗氧化酶活性、細胞滲透物質以及細胞膜氧化產(chǎn)物等呈現(xiàn)顯著負相關關系，與P、K和H2O2等呈現(xiàn)負相關關系，其余各指標間均呈現(xiàn)正相關關系。綜合主成分分析和相關性分析結果，玉米苗期葉片的可溶性糖、脫落酸、P含量、SOD、PRO、CAT、POD、葉片相對含水量等8個指標在接種不同的枯草芽孢桿菌種容易受到影響。

2.10 枯草芽孢桿菌對玉米苗期葉片生理生化調(diào)節(jié)隸屬函數(shù)綜合評價

針對不同植物根際的枯草芽孢桿菌對玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用不同，通過隸屬函數(shù)均值綜合評價出不同植物根際的枯草芽孢桿菌對玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用（表8）。其中正常與干旱情況4組枯草芽孢桿菌均能夠提高玉米生長發(fā)育能力，根據(jù)對玉米各項指標的隸屬函數(shù)均值進行排名，正常情況：D1＞C1＞B1＞E1＞CK1；干旱脅迫下：D2＞E2＞C2＞B2＞CK2。

3 討? 論

處于正常水分與干旱脅迫時植物存在不同的應答機制，其中正常水分情況下植物體內(nèi)活性氧代謝保持著動態(tài)平衡［19］，而干旱脅迫情況下的植物活性氧代謝呈現(xiàn)不平衡狀態(tài)。這種植物體內(nèi)活性氧代謝狀態(tài)部分依賴于SOD、POD、CAT等抗氧化酶與其他抗氧化物質組成的抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用?？购敌詮姷闹参矬w內(nèi)的 SOD、POD、CAT的活性一般較高，該調(diào)控作用在于有效清除植物體內(nèi)活性氧，阻抑膜脂過氧化，緩解植物因干旱脅迫受到的傷害［20］。本試驗中，干旱脅迫下玉米苗期葉片SOD、POD、CAT的活性均有不同程度的升高，這與前人研究一致，玉米苗期葉片SOD、POD、CAT活性在一定的程度下代表玉米受到干旱脅迫程度。處于干旱脅迫與正常情況下，玉米根部接種不同的枯草芽孢桿菌對玉米葉片抗氧化酶 SOD、POD、CAT的活性存在著不同程度的影響。根據(jù)已經(jīng)證實的結論，植物根際促生菌可產(chǎn)生有益于植物生長的化合物［21-22］，通過產(chǎn)生植物激素、固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體能力來提高植物的生長能力。而處于干旱脅迫時，接種植物根際促生菌后能夠促進根部的發(fā)育以及根部吸收的功能從而提高植物抗旱性，通過對辣椒接種植物根際促生菌后，辣椒的耐旱性明顯高于對照組，其主要是通過促進根部的發(fā)育來提高植物吸收水分的能力［23］。值得注意的是，在干旱脅迫的情況下玉米根部接種不同的枯草芽孢桿菌使得玉米葉片SOD、CAT和POD活性均顯著（P＜0.05）降低。可以得出枯草芽孢桿菌可以促進玉米苗期對水分的吸收，從而使得玉米苗期受干旱脅迫影響度降低。所以枯草芽孢桿菌一定程度上提高了玉米苗期對于干旱的耐受范圍。

植物應對干旱脅迫的另一種應答方式為細胞滲透勢調(diào)節(jié)，植物可通過細胞內(nèi)水分減少、細胞體積縮小、細胞內(nèi)溶質增加等3種方式進行植物細胞滲透勢的調(diào)節(jié)［24］。其中細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質的積累是細胞滲透勢在干旱脅迫下多呈現(xiàn)為降低趨勢的原因之一。而植物滲透調(diào)節(jié)物質其中一大類為有機溶劑，如可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等［25］。本試驗發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下玉米可溶性糖和脯氨酸的積累量均比正常水分高，表明植物細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質的積累是反映植物受干旱脅迫的影響程度。而接種不同枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)出不同的影響結果，具體表現(xiàn)為干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌均顯著（P＜0.05）降低玉米苗期葉片PRO含量和可溶性糖含量的積累。而植物體內(nèi)的可溶性糖含量在干旱脅迫情況下普遍上升，這是對干旱脅迫適應的一種表現(xiàn)［26］。本試驗中干旱脅迫時接種枯草芽孢桿菌能夠降低植物滲透調(diào)節(jié)物質含量，表明接種菌種后玉米受干旱脅迫的影響程度降低。

干旱脅迫促進了植物細胞膜脂過氧化作用，且隨著脅迫程度的加深呈先上升后下降的趨勢。這與植物體內(nèi)抗氧化酶活性升高作用有關［27］。細胞內(nèi)H2O2是造成植物細胞膜氧化的關鍵因素之一，其含量在一定程度可代表植物受到干旱脅迫的水平。本試驗中，遭遇干旱時玉米苗期葉片活性氧累積升高，處于干旱脅迫下接種D與E對玉米苗期葉片活性氧的影響不顯著，接種B與C顯著降低玉米苗期葉片活性氧，在一定程度緩解葉片的膜脂過氧化作用。MDA是活性氧氧化植物細胞膜主要產(chǎn)物之一，代表著植物受干旱脅迫的程度，其含量與H2O2含量呈正相關關系，本試驗中干旱脅迫下接種B菌種對玉米苗期葉片MDA含量的累積無明顯差異，接種C、D、E均顯著降低MDA含量的累積。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米苗期葉片MDA含量的累積，且不同菌種降低程度不同，可以推斷接種C、D、E能夠在一定程度下避免部分玉米葉片的膜脂氧化作用，可描述為增強玉米苗期的抗旱性。

干旱脅迫影響玉米的生長發(fā)育，值得注意的是，植物內(nèi)源激素中ABA、ACC和吲哚乙酸在植物的生長發(fā)育與分化方面發(fā)揮著至關重要的作用［28］，如干旱脅迫下根部合成的ABA可被傳遞給植物葉片，減少葉片氣孔開度，降低蒸騰作用，增加植株保水能力［29］。本試驗為此探討干旱脅迫下接種不同植物根際來源的枯草芽孢桿菌對玉米ABA、ACC和吲哚乙酸的影響情況。呈現(xiàn)出正常情況接種B、E顯著升高玉米葉片ABA含量，而接種C、D則顯著降低ABA含量，E由C、D組成，其顯著升高玉米葉片ABA含量原因可能在于微生物間的協(xié)作關系，具體關系仍需進一步探究。鑒于植物生長發(fā)育是復雜的一系列反應，單方面因素難以評判是否對植物的生長發(fā)育的影響；而處于干旱情況時接種B、C顯著升高玉米葉片ABA含量，更能夠促使葉片蒸騰作用減小，鑒于ABA在植物體內(nèi)的作用，接種B、C后玉米苗期根部受到干旱的影響反應較強；而接種D、E則降低ABA含量，說明接種后受到外界干旱的影響較小，推測因為接種D、E能較好地促使玉米苗期根系對水分的吸收，從而玉米苗期自身生理反應不強烈，ABA含量較低。ACC作為合成乙烯的前體物質，合成后的乙烯在植物生長發(fā)育及應對防御反應中也起著重要的調(diào)控作用，值得注意的是對于玉米應對干旱脅迫的調(diào)控反應是ACC含量的升高，接種不同的枯草芽孢桿菌使得玉米ACC含量的反應不同，其中正常情況下接種B、D、E顯著提高玉米葉片ACC含量，接種C對玉米葉片ACC含量差異不顯著；干旱脅迫下接種B顯著提高玉米葉片ACC含量，其余處理對葉片ACC含量影響差異不顯著；綜上，接種枯草芽孢桿菌在植物應對外界條件脅迫時能從調(diào)控植物ABA、ACC等激素方向影響玉米應對干旱時的防御調(diào)控。本試驗中接種D、E兩種菌種顯著降低玉米IAA含量，接種B、C差異不顯著?；趶埫魃龋?0］的研究表明，植物IAA含量隨著水分下降而減少，且下降的比例與品種的抗旱性有關，抗旱性強的下降多，因此利于增強玉米苗期抗旱性。

相對含水量與自身的光合作用、蒸騰作用和水分利用效率關系密切，是衡量干旱脅迫下植物葉片水分狀況與反應組織代謝活動的一個重要指標［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)，處于正常水平下的玉米葉片相對含水量受接種的枯草芽孢桿菌的影響較小，僅有B菌劑顯著降低玉米葉片相對含水量；而在干旱脅迫下，接種C、D、E? 3種菌劑處理顯著提高玉米葉片的相對含水量，使得玉米苗期應對干旱的調(diào)節(jié)能力增強。P、K是作物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素，是作物體內(nèi)許多重要有機化合物的組成部分，又以多種形式參與作物體內(nèi)各種生長過程。影響作物N、P、K很多，包括土壤和作物特性，但其中最重要的是土壤水分，本研究中水分條件與接種枯草芽孢桿菌對于玉米苗期葉片K影響均較小，N和P含量受水分條件與接種枯草芽孢桿菌的影響較大。其中干旱脅迫下N和P含量分別增加與降低，此研究結果與王凱等［33］研究干旱脅迫對科爾沁沙地榆樹幼苗C、N、P化學計量特征的影響結果相似。處于干旱脅迫下N素量增加可能由于植物對于N素的應用降低，而正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌N含量顯著降低，推測因素是接種枯草芽孢桿菌后促進玉米幼苗的生長，對N素的利用度增加。其次，研究表明植物內(nèi)生菌對植物對N素的代謝有著重要的作用，其機制在于接種植物內(nèi)生菌后，能有效增加植物硝酸還原酶（NR）與谷氨酰胺合成酶（GS）的活性［34-38］，這兩種酶在植物N素代謝過程中起著重要的調(diào)控作用，其活性增強能有效促進植物的生長于發(fā)育。同時植物內(nèi)生菌通過分泌維生素從而影響著植物對N素的代謝。王珂等［39］研究表明維生素能提高小麥葉片硝酸還原酶的活性，從而促進植物對N素的代謝，這無疑是促進了植物的生長與發(fā)育［40］。處于干旱脅迫下P含量降低可能由于土壤干旱限制了無機磷的吸附與溶解［41］，導致植物從土壤中吸收P減少；同時干旱導致木質部形成栓塞［42］，P隨蒸騰作用向上運輸可能受阻，導致P在細根中積累，其他器官P含量下降。正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌致使玉米苗期葉片P含量呈下降趨勢，推測是由于接種枯草芽孢桿菌的玉米幼苗生長發(fā)育較快，核糖體合成蛋白質需要消耗大量P，所以接種枯草芽孢桿菌能夠加強玉米在苗期的代謝，促進玉米的生長發(fā)育，至于植物促生菌對于植物P代謝方面的機制尚缺少更細致研究。

針對不同植物根際的枯草芽孢桿菌對玉米苗期的各生理生化調(diào)節(jié)作用不同。通過隸屬函數(shù)均值綜合評價出不同植物根際的枯草芽孢桿菌對玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用。其中正常與干旱情況4種枯草芽孢桿菌處理均能夠提高玉米苗期生長發(fā)育能力，根據(jù)對玉米各項指標的隸屬函數(shù)均值進行排序，正常情況：D1＞C1＞B1＞E1＞CK1；干旱脅迫下：D2＞E2＞C2＞B2＞CK2。所以接種枯草芽孢桿菌均可以增強玉米苗期抗旱性，不同根際的枯草芽孢桿菌效果不同。

綜上所述，接種不同的枯草芽孢桿菌的玉米苗期葉片從抗氧化酶活性、細胞滲透物質、細胞膜氧化產(chǎn)物、內(nèi)源激素、相對含水量以及N、P、K等各個方面調(diào)控玉米以應對干旱脅迫。

參考文獻 Reference：

［1]焦志麗.馬鈴薯干旱危害及提高抗旱性的研究［D］.黑龍江：東北林業(yè)大學，2012.

JIAO ZH L.The researchof potato drought damageand improve its drought resistance methods ［D］.Heilongjiang：Northeast Forestry University，2012.

［2]劉曉霞，李 安，舒健虹，等.干旱脅迫下不同枯草芽孢桿菌對玉米萌發(fā)的影響［J］.耕作與栽培，2021，41（4）：18-23.

LIU X X，LI A，SHU J H.et al.Effects of different Bacillus subtilis on maize germination under drought stress［J］.Tillage and Cultivation，2021，41（4）：18-23.

［3]李 安，舒健虹，劉曉霞，等.干旱脅迫下枯草芽孢桿菌對玉米種子抗旱性及生理指標的影響［J］.作物雜志，2021（6）：217-223.

LI A，SHU J H，LIU X X .et al.Effects of Bacillus subtilis on drought resistance and physiological? indexes of maize seeds under drought stress［J］.Crops，2021（6）：217-223.

［4]李 晶.黃瓜枯萎病高效拮抗枯草芽孢桿菌的篩選及生防機制研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學，2010.

LI J.Screening of antagonistic Bacillus subtilis against Fusarium oxysporium and its biocontrol mechanism ［D］.Harbin：Harbin Institute of Technology，2010.

［5]黃海嬋，裘娟萍.枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2005（14）：12-13，16.

HUANG H CH，QIU J P.Research progress on the control of plant diseases by Bacillus subtilis［J］.Journal of Zhejiang Agricultural Sciences，2005（14）：12-13，16.

［6]劉培福.枯草芽孢桿菌D221發(fā)酵條件優(yōu)化及對辣椒根腐病防治效果初探［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2011.

LIU P F.Studies on optimization of fermentation conditions and biocontrol effects against fusarium solan of Bacillus subtilis D221［D］.Harbin：Northeast Agricultural? ?University，2011.

［7]肖小露.枯草芽孢桿菌BS193對辣椒疫病的生防作用及其抗菌機制初探［D］.福州：福建農(nóng)林大學，2017.

XIAO X L.Biological control and mechanism of? Bacillussu btilis BS193 against pepper Phytophthora blight（Phytophthora capsici）［D］.Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University，2017.

［8]龐永彬.枯草芽孢桿菌防治水稻稻瘟病效果研究［J］.農(nóng)民致富之友，2017（11）：88.

PANG Y B.Study on the effect of Bacillus subtilis on controlling rice blast［J］.Friends of Farmers to Riches，2017（11）：88.

［9]李君保，冉文秀.枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治水稻穗頸瘟田間試驗探討［J］.農(nóng)業(yè)與技術，2019，39（9）：16-18.

LI J B，RAN W X.Field trials of Bacillus subtilis wettable powder for controlling rice panicle blast［J］.Agriculture and Technology，2019，39（9）：16-18.

［10]張 穎，尹素改，許玉彬，等.小麥內(nèi)生枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）T10菌株對小麥紋枯病的生防作用［J］. ?河南大學學報（自然科學版），2014，44（4）：456-460.

ZHANG Y，YIN S G，XU Y B，et al.Biocontrol efficacy of wheat endophytic bacteria? Bacillus? subtilis? T10S train? against wheat sharp eyespot［J］.Journal of Henan University（Natural Science），2014，44（4）：456-460.

［11]劉 剛.枯草芽孢桿菌NJ-18和氟酰胺聯(lián)合拌種防治小麥紋枯病效果好［J］.農(nóng)藥市場信息，2013（22）：39.

LIU G.The combined seed dressing of Bacillus subtilis NJ-18 and fluoroamide is effective in preventing wheat sharp eyespot［J］. Pesticide Market Information，2013（22）：39.

［12]張 軍，張 凱，王向陽.井岡霉素·枯草芽孢桿菌混合劑對小麥全蝕病的防效研究［J］.安徽農(nóng)學通報，2013， ?19（15）：84，123.

ZHANG J，ZHANG K，WANG X Y.Study on the control effect of Jinggangmycin and Bacillus subtilis mixture on wheat rot disease［J］.Anhui Agricultural Science Bulletin，2013，19（15）：84，123.

［13]毛騰霄，葉華智，秦玉花.枯草芽孢桿菌BS-8D防治玉米紋枯病的田間試驗效果及作用機理［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2016，55（20）：5252-5255.

MAO T X，YE H ZH，QIN Y H.The biocontrol of maize sheath blight and mechanism with Bacillus subtilis BS-8D strain in the field［J］.Hubei Agricultural Sciences，2016，55（20）：5252-5255.

［14]蘇 博，顧雙月，丁 婷.枯草芽孢桿菌DZSY21抗玉米紋枯病的研究［C］//中國植物病理學會2016年學術年會論文集，南京：2016：471-473.

SU B，GU SH Y，DING T.Research on the resistance of Bacillus subtilis DZSY21 to corn sheath blight［C］//Chinese Society of Phytopathology，Nanjing：2016：471-473.

［15]毛騰霄，葉華智，秦玉花.枯草芽孢桿菌防治玉米紋枯病的初步研究［J］.中國農(nóng)學通報，2016，32（5）：44-48.

MAO T X，YE H ZH，QIN Y H. Study on biocontrol of maize sheath blight （Rhizoctonia solani） with Bacillus subtilis strain［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2016，32（5）：44-48.

［16]劉 雪，穆常青，蔣細良，等..枯草芽孢桿菌代謝物質的研究進展及其在植病生防中的應用［J］.中國生物防治，2006（S1）：179-184.

LIU X，MU CH Q，JIANG X L.，et al.Research progress of the metabolic substances produced by Bacillus subtillis and their application on biocontrol of plant disease［J］.Chinese Journal of Biological Control，2006（S1）：179-184.

［17]SHILTS T，ERTRK U，PATEL N J，et al.Physiologi cal regulation of biosynthesis of indole-3-acetic acid and other indole derivatives by the citrus fungal pathogen Colletotrichum acutatum［J].Journal of Biological Sciences，2005，5（2）：205-210.

［18]CASSAN F，BOTTINI R，SCHNEIDER G，et al.Azospirillum brasilense and azospirillum lipoferum hydrolyze conjugates of GA20 and metabolize the resultant aglycones to GA1 in seedlings of rice dwarf mutants［J]Plant Physiol，2001，125（4）：2053-2058.

［19]蔣明義，楊文英，徐 江，等.滲透脅迫下水稻幼苗中葉綠素降解的活性氧損傷作用［J］.植物學報，1994（4）：289-295.

JIANG M Y，YANG W Y，XU J，et al.Active oxygen damage effect of chlorophyll degradation in rice seedlings under osmotic stress［J］.Journal of Integrative Plant Biology，1994（4）：289-295.

［20]高愛麗，趙秀梅，秦 鑫.水分脅迫下小麥葉片滲透調(diào)節(jié)與抗旱性的關系［J］.西北植物學報，1991，11（1）：58-63.

GAO A L，ZHAO X M，QIN X.Relationship between osmotic ad justment and drought resistance in wheat under water stress［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，1991，11（1）：58-63.

［21]GUO B，WANG Y，SUN X，et al.Bioactive natural products from endophytes：a review［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2008，44（2）：136-142.

［22]MALHADAS C，MALHEIR R，PEREIRA J A，et al.Antimicrobial activity of endophytic fungi from olive tree leaves［J］.Microbiol Biotechnology，2017，33（3）：1-12.

［23]MARASCO R，ROLLI E，VIGANI G，et al.Are drought-resistance promoting bacteria cross-compatible with different plant models？.［J］.Plant Signal，2013，8 （10）：26-41.

［24]MC CUE K F，HANSON D.Drought and salt tolerance：towards understanding and application.［J］.Trends Biotechnology，1990，8（90）：358-362.

［25]霍仕平，晏慶九，宋光英，等.玉米抗旱鑒定的形態(tài)和生理生化指標研究進展［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，1995，13（3）：67-73.

HUO SH P，YAN Q J，SONG G Y，et al.Progress in morphological and physiological and biochemical? indexes of drought resistance? identification of? maize［J］.Agricultural Research in the Arid Areas，1995，13（3）：67-73.

［26]左文博，吳靜利，楊 奇，等.干旱脅迫對小麥根系活力和可溶性糖含量的影響［J］.華北農(nóng)學報，2010，25（6）：191-193.

ZUO W B，WU J L，YANG Q，et al.Study on the influence of root of different wheat varieties under drought stress［J］.Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2010，25（6）：191-193.

［27]王 霞，侯 平，尹林克，等.土壤水分脅迫對檉柳體內(nèi)膜保護酶及膜脂過氧化的影響［J］.干旱區(qū)研究，2002（3）：17-20.

WANG X，HOU P，YIN L K，et al.Effect of soil moisture stress on the membrane protective enzyme and the membrane liquid peroxidation of tamarix［J］.Arid Zone Research，2002（3）：17-20.

［28]陸 軍，張吉先.植物內(nèi)源激素在樹木生長中的作用［J］.浙江林業(yè)科技，1992，12（5）：68-71.

LU J，ZHANG J X.Control on endogenous hormones in growth of trees［J］.Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology，1992，12（5）：68-71.

［29]MUNNS R.A leaf elongation assey detects an unknown growth inhibitor in xylem sap from wheat and barley［J］.Australian Journal of? Plant Physiology，1992，19（5）：127-135.

［30]張明生，謝 波，談 鋒.水分脅迫下甘薯內(nèi)源激素的變化與品種抗旱性的關系［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2002，35（5）：498-501．

ZHANG M SH，XIE B，TAN F.Relationship between changes on endogenous hormone of sweetpotato under water stress and drought resistance［J］.Chinese Agricultural Sciences，2002，35（5）：498-501

［31]SEGHATOLESLAMI M J，KAFI M，MAJIDI E .Effect of drought stress at different? growth? stages on? yield and? water? use? efficiency of? five? proso millet （Panicum miliaceum） genotypes［J］.Journal of Science & Technology of Agriculture & Natural Resources，2007，11（4）：1427-1432.

［32]劉義國，萬雪潔，張 艷，等.干旱鍛煉對小麥幼苗期形態(tài)指標的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2022，31（2）：157-163.

LIU Y G，WAN X J，ZHANG Y，et al.Effectof drought primingon morphological indicesof wheatSeedlings［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2022，31（2）：157-163.

［33]王 凱，沈 潮，孫 冰，等.干旱脅迫對科爾沁沙地榆樹幼苗C、N、P化學計量特征的影響［J］.應用生態(tài)學報，2018，29（7）：2286-2294.

WANG K，SHEN CH，SUN B，et al.Effects of drought stress on C，N and P stoichiometric characteristics of elm seedlings in Horqin sandy land ［J］.Journal of Applied Ecology，2018，29（7）：2286-2294.

［34]湯玉瑋，林振武，陳敬祥.硝酸還原酶活力與作物耐肥性的相關及其在生化育種上應用的探討［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1985，15（6）：39-45.

TANG Y W，LIN ZH W，CHEN J X.Relationship between nitrate reductase activity and crop fertility tolerance and its application in biochemical breeding ［J］.Scientia Agricultura Sinica，1985，15（6）：39-45.

［35]史應武，婁 愷，李 春.內(nèi)生真菌對甜菜主要農(nóng)藝性狀及氮糖代謝關鍵酶活性的影響［J］.作物學報，2009，35（5）：946-951.

SHI Y? W，LOU K，LI CH.Effects of endophytic fungus on sugar content and key enzymes activity in nitrogen and sugar metabolism of sugar beet （Beta vulgaris L.） ［J］.Acta Agronomica Sinica，2009，35（5）：946-951.

［36]歐陽雪慶，羅 霆，楊麗濤，等.甘蔗內(nèi)生固氮菌液浸種對甘蔗生長前期氮代謝相關酶活性的影響［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學，2010，41（5）：416-418.

OUYANG X Q，LUO T，YANG L T，et al.Effects of sett-soaking with sugarcane endophytic diazotrophsolution on N metabolism related enzymes activities at the earlygrowth stage of sugarcane ［J］.Guangxi Agricultural Sciences，2010，41（5）：416-418.

［37]BECKER T W，CARRAYOL E，HIREL B.Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase isoforms in maize leaves：localization，relative proportion and their role in ammonium assimilation or nitrogen transport［J］.Planta，2000（211）：800-806.

［38]GONZALEZ-MORO B，MENU-PETITE A，LACUESTA M，et al.Glutamine synthetase from mesophyll and bundle sheath maize cells：isoenzyme complement and different sensitivities to phosphino-thricin［J］.Plant cell Reports，2000，19（11）：1127-1134．

［39]王 珂，楊玉愛，袁可能.維生素（ B，C，PP）對小麥生理特性及生長的影響［J］.科技通報，1995（5）：301-305.

WANG K，YANG Y A，YUAN K N.Effects of sett-soaking with sugarcane endophytic diazotrophsolution on N metabolism related enzymes activities at the earlygrowth stage of sugarcane ［J］.Bulletin of Science and Technology，1995（5）：301-305.

［40]ZHOU D P，WU S H，JIANG Z F，et al.Functions and application-future of the endophytic fungi from orchid［J］.Acta Agriculturae Shanghai，2005，21（3）：110-113．

［41]BELNAP J.Biological Phosphorus Cycling in Dryland Regions［M］.Springer Berlin Heidelberg，2011：371-406.

［42]RONG L I，DANG W，CAI J，et al.Relationships between xylem structure and embolism vulnerability in six species of drought tolerance trees［J］.Chinese Journal of Plant Ecology，2016，40（3）：255-263.

Physiological and Biochemical Regulation of Bacillus subtilis Spores on Leaves at Seedling Stage of Maize under Drought Stress

LI An1，SHU Jianhong2，LIU Xiaoxia2，LU Xueping3，JIAO Yu4，WANG Xiaoli2? and? ZHAO Degang3

Abstract In order to explore the physiological regulation effects of different Bacillus subtilis on the leaves of maize seedlings under drought stress. The physiological and biochemical regulating substances，such as the antioxidant enzyme activity， cell permeation substances， cell membrane oxidation products， H2O2， endogenous hormones， relative water content， and K， P， N contents in the leaves of maize seedlings were evaluated by inoculating maize roots with different plant rhizosphere Bacillus subtilis， which include R9-1， R59， R60 and R59+R60 combination strains under drought and normal water conditions. The principal component and correlation analysis indicated that Bacillus subtilis mainly affected the soluble sugar， abscisic acid （ABA）， phosphorus （P） content， superoxide dismutase （SOD） activity， catalase （CAT） activity， peroxidase （POD） activity， free proline （PRO） content， relative water content of the leaves at seedling stageof maize. Importantly， there was a significantly negative correlation between the relative water content and other physiological performance factors. Under drought stress，the? antioxidant enzyme activity， cell osmotic adjustment substances， and P and N content in the leaves of maize seedlings obviously decreased after inoculated with Bacillus subtilis.By the way， the content of H2O2 and ABA reduced after R9-1， R59 inoculation， the content of ABA increased after R60， R59+R60 inoculation and the content of IAA decreased after R59， R60， and R59+R60 inoculation in the leaves of maize at seedling stage. The regulation effect of Bacillus subtilis on maize was estimated by the comprehensive analysis of membership function under different conditions. Under normal conditions，R60＞R59＞R9-1＞R59+R60＞CK1，under drought stress，? ?R60＞R59+R60＞R59＞R9-1＞CK2. Taken together， the antioxidant enzyme activity， cell osmotic regulation substances， and P， N content of? leaves at seedling of maize decreased after inoculation with Bacillus subtilis.Meanwhile， R59， R60， R59 + R60 was conducive to improve its relative water content. The results demonstrated that the maize seedling inoculated with Bacillus subtilis was less affected by drought. Therefore， the inoculation of Bacillus subtilis can enhance the adjustment ability of maize seedling to adapt drought stress and ensure its growth and development.

Key words Maize;Bacillus subtilis;Membership function;Drought stress

Received2022-02-16Returned 2022-06-05

Foundation item Guizhou High-level Innovative Talents Training Program[No.（2018）5634-2]; Guizhou Science and Technology Project［（No.2020）5005]; Guizhou Talents Training Project; Guizhou High-level Innovative Talents Training Project[No.（2016） 4003].

First author LI An， male，master student. Research area：screening of rhizosphere growth-promoting bacteria of gramineae and ecological fungus fertilizer.E-mail：1964352203@qq.com

Corresponding?? author ZHAO Degang， male， Ph.D，professor，doctoral supervisor. Research area：plant genetic engineering.E-mail：dgzhao@gzu.edu.cn

WANG Xiaoli， male， Ph.D，research fellow. Research area：grass molecular.E-mail：wangxiaolizhenyuan @126.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

收稿日期：2022-02-16修回日期：2022-06-05

基金項目：貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目［黔科合平臺人才（2018）5634-2］；貴州省科技計劃項目［黔科合平臺人才（2020）5005］；貴州省人才培養(yǎng)項目；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目［黔科合人才（2016）4003］。

第一作者：李 安，男，碩士研究生。研究方向為禾本科根際促生菌的篩選及生態(tài)菌肥。 E-mail：1964352203@qq.com

通信作者：趙德剛，男，博士，教授，博士生導師，研究方向為植物基因工程。E-mail：dgzhao@gzu.edu.cn

王小利，男，博士，研究員，研究方向為牧草分子。E-mail：wangxiaolizhenyuan @126.com