趙衛(wèi)國(guó)　塔娜　張立堅(jiān)　李保軍　趙小萍　尚麗平　王灝　穆建新

摘 要 為了解析油菜開花期性狀的遺傳機(jī)制，利用KN DH群體在冬性、半冬性和春性環(huán)境的開花期表型和KN 高密度遺傳連鎖圖譜，通過(guò)Wincart 2.5軟件的符合區(qū)間作圖法對(duì)油菜開花期性狀進(jìn)行QTL定位及候選基因鑒定。結(jié)果顯示，共鑒定到119個(gè)開花期QTL，單個(gè)QTL解釋表型變異最大是qFT-13DL16-4 ?（25.96%），最小的是qFT-13ZY2-1（2.48%）。利用元分析的方法將初步鑒定的QTL整合為consensus QTL，共獲得26個(gè)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL，包括7個(gè)開花期主效QTL。如cqFT-A2-3、cqFT-A2-4在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-C6-4、cqFT-C6-7、cqFT-C6-12、cqFT-C6-13在冬性和半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)， cqFT-C6-14在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。主效QTL置信區(qū)間共鑒定到15個(gè)與成花誘導(dǎo)相關(guān)的候選基因，如BnaA02g12260D（RGA1）、BnaA02g15390D（AGL12）、BnaA02g16710D（LKP2）和BnaC06g19930D（NUA）等，這些候選基因主要涉及赤霉素、光周期、生物鐘、春化作用響應(yīng)和花發(fā)育等功能?？梢?，油菜開花期主效QTL及其候選基因的鑒定為開花期基因的精細(xì)定位和圖位克隆奠定基礎(chǔ)，也為培育早熟、高產(chǎn)油菜品種提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 甘藍(lán)型油菜；雙單倍體株系；開花期性狀；QTL定位；候選基因鑒定

油菜是世界上重要的油料作物之一，也是中國(guó)食用植物油的主要來(lái)源，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。目前，中國(guó)食用植物油自給率嚴(yán)重不足，60%以上需要進(jìn)口［2］。高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的油菜品種是油菜育種的主要目標(biāo)。油菜開花期由多基因控制且受外界環(huán)境影響較大。在不同的氣候、生態(tài)環(huán)境，油菜開花期表現(xiàn)出較大的表型差異［3］。根據(jù)不同的生態(tài)環(huán)境，可將油菜分為冬性、半冬性和春性3種生態(tài)類型［4］。冬性油菜需要一定的低溫才能通過(guò)春化，春化持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；半冬性油菜對(duì)春化的要求相對(duì)較低，春化持續(xù)時(shí)間也相對(duì)較短；春性油菜開花幾乎不經(jīng)過(guò)低溫春化就能夠正常開花［5］。此外，油菜作為重要的倒茬作物，開花期過(guò)長(zhǎng)將會(huì)導(dǎo)致油菜成熟期的推遲，從而影響了下茬作物的正常栽培［6-7］。因此，必須嚴(yán)格控制油菜的開花期從而調(diào)節(jié)油菜的成熟期。在油菜品種選育過(guò)程中，開花期可作為油菜早熟品種選育的重要指標(biāo)。

數(shù)量性狀定位（QTL）是闡明數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)和識(shí)別QTL位點(diǎn)的有效途徑［8］。目前，科研工作者已經(jīng)成功對(duì)玉米花期［9］、油菜株高［10］、水稻粒形、粒質(zhì)量和粒長(zhǎng)［11-12］，小麥萌發(fā)期抗旱和耐鹽［13］等重要性狀進(jìn)行QTL定位研究，并且也獲得相關(guān)性狀的QTL。油菜開花期屬于數(shù)量性狀，不同的定位群體鑒定的開花期QTL數(shù)量和在染色體上的分布具有較大差異。Ferreira等［14］對(duì)以甘藍(lán)型冬、春油菜構(gòu)建的DH群體開花期進(jìn)行QTL定位，鑒定到3個(gè)開花期QTL分別位于A09、C02和C06 染色體上；Butruille等［15］以冬、春油菜的雜交和回交群體作為定位群體，鑒定到的開花期QTL主要位于A02、A03、A07、A08、A09、C02 和 C05 染色體上；Zhao等［16］對(duì)油菜DH群體的株高、開花期和成熟期進(jìn)行QTL鑒定，檢測(cè)到7個(gè)開花期顯著性QTL；蔡長(zhǎng)春等［17］對(duì)油菜開花期進(jìn)行QTL定位，鑒定到分別位于A04和A06染色體上的2個(gè)主效QTL。這些研究結(jié)果充分表明油菜開花期性狀由不同染色上的多個(gè)位點(diǎn)控制，表現(xiàn)出開花期性狀調(diào)控的復(fù)雜性。同時(shí)，許多作物開花期QTL的定位也為本研究甘藍(lán)型油菜開花期的QTL定位提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

QTL定位是獲得區(qū)間候選基因的先決條件。隨著甘藍(lán)型油菜基因組的公布，利用甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genoscope.fr/ brassicanapus/），通過(guò)QTL置信區(qū)間的物理距離與油菜基因組的線性關(guān)系，可獲得QTL區(qū)間潛在基因。由于甘藍(lán)型油菜與擬南芥同源及基因的保守性，利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)與甘藍(lán)型油菜候選基因進(jìn)行Blast比對(duì)，確定甘藍(lán)型油菜基因在擬南芥中的同源基因及功能注釋［18］。目前，已經(jīng)鑒定到油菜開花期基因BnCOA1與擬南芥CO基因同源［19］，BnFLC1與擬南芥FLC基因同源等［20］。因此，通過(guò)QTL區(qū)間及其區(qū)間的潛在基因進(jìn)行鑒定和功能解析，以期獲得油菜開花期的潛在候選基因。

目前，對(duì)油菜定位群體同時(shí)在冬性、半冬性和春性3個(gè)生態(tài)類型的開花期表型進(jìn)行QTL定位，相關(guān)研究還相對(duì)較少。本研究主要通過(guò)利用油菜KN Double haploid（DH）群體在3個(gè)生態(tài)環(huán)境（冬性、半冬性和春性生態(tài)環(huán)境）連續(xù)多年的開花期表型，并結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜對(duì)甘藍(lán)型油菜開花期性狀的QTL進(jìn)行定位、分析，在分子水平解析油菜開花期的調(diào)控機(jī)理，并獲得控制油菜開花期重要QTL及潛在候選基因。研究結(jié)果可為油菜開花期QTL的精細(xì)定位和基因的圖位克隆奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為培育早熟油菜新品種提供新的基因資源和指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2007年以春性甘藍(lán)型油菜純系KenC-8為父本，冬性甘藍(lán)型油菜純系N53-2為母本，通過(guò)人工雜交和小孢子培養(yǎng)構(gòu)建了由348份Double haploid（DH）系組成的KN DH群體。該研究以甘藍(lán)型油菜KN DH群體為試驗(yàn)材料，對(duì)其不同生態(tài)環(huán)境開花期表型進(jìn)行考察。

1.2 田間試驗(yàn)

以 KN DH 群體及其親本作為試驗(yàn)材料，2010-2013年和2015-2018年8個(gè)年份種植在冬性環(huán)境陜西省雜交油菜研究中心（大荔）試驗(yàn)田（編碼為 DL，經(jīng)緯度為 109.94°E，34.79°N）和陜西省雜交油菜研究中心（楊陵）試驗(yàn)田（編碼為YL，經(jīng)緯度為 108.07°E，34.28°N）；2012-2015年連續(xù)4 a種植在半冬性環(huán)境湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗(yàn)田（編碼為 WH，經(jīng)緯度為 113.68°E，30.58°N）， 2010-2012 年連續(xù) 3 a種植在春性環(huán)境甘肅省張掖油菜加代試驗(yàn)田（編碼為 ZY，經(jīng)緯度為100.45°E，38.93°N），并記錄每年試驗(yàn)的播種時(shí)間。以種植年份和地點(diǎn)編碼組合對(duì)各個(gè)種植環(huán)境進(jìn)行命名，如2013年種植在湖北武漢命名為13WH。KN DH群體在冬性環(huán)境試驗(yàn)每年3個(gè)重復(fù)，半冬性和春性環(huán)境試驗(yàn)每年皆2個(gè)重復(fù)。田間試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)排列，每個(gè)DH系播種2行，行距40? cm，株距20? cm，按照油菜正常的試驗(yàn)管理方式進(jìn)行管理。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

油菜初花期是以該材料中50%以上株系主花序第一朵花開為標(biāo)準(zhǔn)，記錄為該材料的初花期。將初花期和播種期之間的時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，記錄為該品系的開花期。在甘肅省張掖春性環(huán)境，由于KN DH群體是由春性和冬性親本構(gòu)建而來(lái)，KN DH群體母本N53-2和部分DH系對(duì)春化溫度和持續(xù)時(shí)長(zhǎng)要求差異導(dǎo)致不能正常開花或者初花期推遲過(guò)長(zhǎng)。將在油菜生長(zhǎng)期不能正常開花或者其他DH系收獲時(shí)還沒有達(dá)到初花期的標(biāo)準(zhǔn)，以同年其他品系成熟期作為初花期來(lái)計(jì)算這部分DH系的開花期［20］。利用Excel 2010軟件對(duì)開花期表型數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4 開花期的QTL定位與QTL整合

通過(guò)KN DH群體的高密度SNP遺傳連鎖圖譜，結(jié)合各生態(tài)環(huán)境油菜的開花期表型，利用Wincart 2.5軟件進(jìn)行QTL檢測(cè)分析［21］。軟件掃描以種植環(huán)境作為環(huán)境因子處理，采用復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM），通過(guò)逐步回歸方法選擇協(xié)因子，背景標(biāo)記數(shù)目設(shè)為5，窗口大小設(shè)為10 cM，掃描步長(zhǎng)設(shè)為1.0 cM進(jìn)行QTL檢測(cè)。以P=0.05分別對(duì)每個(gè)環(huán)境的表型進(jìn)行1 000次排布測(cè)驗(yàn)方法（permutation test）確定LOD閾值，最終將顯著性水平的LOD閾值估算為2.5。 當(dāng)LOD值≥LOD閾值時(shí)的QTL稱為顯著性identified QTL［22］。Identified QTL命名以“q性狀縮寫+種植年份地點(diǎn)編碼+染色體編號(hào)” ［23］，若該性狀在同一種植環(huán)境同一染色體上檢測(cè)到多個(gè)顯著性QTL，將依次以“-1，-2”等來(lái)區(qū)分，如qFT.12ZY2-1代表2012年在甘肅張掖試驗(yàn)點(diǎn)檢測(cè)到位于A02染色體上的第1個(gè)QTL。

利用BioMercator 4.2軟件對(duì)不同環(huán)境中 ?identified QTL進(jìn)行整合獲得consensus QTL［24］。將consensus QTL以“cq”+“性狀縮 ?寫+染色體編號(hào)”+“在該染色體上第幾個(gè)QTL”命名，如“cqFT.A2-1”表示開花期consensus QTL位于A02染色體第1個(gè)QTL。將在兩個(gè)種植環(huán)境表型變異≥10%或者一個(gè)種植環(huán)境表型 ?變異≥20%的consensus QTL 認(rèn)定為主效QTL［25］。

1.5 開花期QTL置信區(qū)間候選基因鑒定與分析

結(jié)合甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”參考基因組，將與QTL連鎖的50-mer SNP探針序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast，同源位點(diǎn)作為QTL區(qū)域候選基因。KN高密度SNP遺傳連鎖圖譜上所有的標(biāo)記用于確定遺傳連鎖圖和物理圖的線性關(guān)系［26］。如果1個(gè)SNP比對(duì)到參考基因組多個(gè)位點(diǎn)區(qū)域，僅選擇與該位點(diǎn)相一致的連鎖群位點(diǎn)，如果1個(gè)SNP在同一連鎖群上有多個(gè)同源位點(diǎn)，通過(guò)該位點(diǎn)上下游物理位置手動(dòng)進(jìn)行確認(rèn)［27］。將與QTL置信區(qū)間對(duì)應(yīng)一致的基因組區(qū)域內(nèi)的所有基因認(rèn)定為該QTL區(qū)域內(nèi)的候選基因［28］。結(jié)合擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)QTL區(qū)間的候選基因進(jìn)行同源基因鑒定和功能注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜KN DH群體在3個(gè)生態(tài)環(huán)境中開花期的表型鑒定

對(duì)KN DH群體、父本KenC-8和母本N53-2在冬性、半冬性和春性生態(tài)環(huán)境多年的開花期表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1）。KN DH群體的父本KenC-8在3個(gè)生態(tài)環(huán)境的開花期早于母本N53-2，父本KenC-8的開花期皆短于母本N53-2。在冬性環(huán)境的陜西大荔和楊陵、半冬性環(huán)境的湖北武漢，父本KenC-8和母本N53-2的開花期差異較小，父本KenC-8比母本N53-2提前0.2～ ?3.0 d開花。在春性環(huán)境兩親本開花期差異較大，父本KenC-8比母本N53-2提前6.5～49.0 d開花。這是由于母本N53-2的冬性較強(qiáng)，需要較長(zhǎng)時(shí)間的低溫才能完全通過(guò)春化，從而導(dǎo)致母本N53-2初花期推遲，開花期延長(zhǎng)。

同時(shí)，對(duì)KN DH群體在冬性、半冬性和春性3個(gè)生態(tài)環(huán)境的開花期表型分析，該群體在冬性生態(tài)環(huán)境的開花期時(shí)間最長(zhǎng)（189.7～197.6? d），其次是半冬性環(huán)境（149.5～176.7 d），開花期最短的是在春性環(huán)境（92.2～94.7 d）。油菜在冬環(huán)境和半冬性環(huán)境，第一年的9-10月播種，第二年的3-4月開花，導(dǎo)致這兩個(gè)生態(tài)環(huán)境開花期時(shí)間較長(zhǎng)，而在春性環(huán)境當(dāng)年4月份種植，7月初就開始開花，因此在春性環(huán)境開花期較短。KN DH群體在春性環(huán)境的開花期變幅最大，變幅為 ?73.0 d（63.0～136.0 d），其次在冬性和半冬性的開花期變幅相差不大，分別為44.3 d（161.0～205.3 d）和45.5 d（138.5～184.0 d）。油菜KN群體開花期表型與兩親本開花期相比較，KN群體的開花期表現(xiàn)出超親的遺傳現(xiàn)象。此外，對(duì)KN DH群體3個(gè)生態(tài)環(huán)境開花期表型分布分析，發(fā)現(xiàn)油菜開花期表型基本服從正態(tài)或者近似的正態(tài)分布，表現(xiàn)出開花期屬于數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn) ?（圖1）。

2.2 油菜開花期性狀的QTL定位與分析

利用WinCart 2.5軟件對(duì)油菜KN群體3個(gè)生態(tài)環(huán)境的15個(gè)種植環(huán)境開花期表型數(shù)據(jù)，結(jié)合KN高密度SNP遺傳連鎖圖譜對(duì)油菜開花期性狀性狀進(jìn)行QTL定位于分析。首選是將開花期表型和高密度遺傳連鎖圖譜通過(guò)WinCart 2.5軟件進(jìn)行1 000次排布確定顯著性QTL的LOD閾值為2.5。通過(guò)WinCart 2.5軟件的初步掃描，共鑒定到119個(gè)identified QTL，主要分布在A03、A06、C06等11條染色體上（表2，圖2），其中69個(gè)identified QTL分布在A基因組上，50個(gè)分布在C基因組。C06染色體上的開花期QTL數(shù)量最多（32個(gè)），其次是A03染色體（28個(gè)），在A09和C05染色體上僅檢測(cè)到1個(gè)QTL。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)開花期QTL的表型變異最高的是位于C06染色體上的qFT-13DL16-4，其表型變異達(dá)到25.96%；其次是位于A02染色體上的qFT-13ZY2-3，其表型變異為23.84%；表型變異最小的則是位于A02染色體上的qFT-13ZY2-1，僅為2.48%。

2.3 油菜開花期性狀的QTL整合與分析

在不同環(huán)境檢測(cè)到部分identified QTL置信區(qū)間具有重疊區(qū)域，通過(guò)利用BioMercator4.2軟件對(duì)identified QTL進(jìn)行整合。119個(gè)開花期 ?identified QTL被整合為76個(gè)consensus QTL（表2，圖3），大大縮小QTL置信區(qū)間，提高了QTL的準(zhǔn)確性。在consensus QTL中，26個(gè)consensus QTL能夠在多個(gè)種植環(huán)境中檢測(cè)到，屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL；50個(gè)consensus僅在1個(gè)種植環(huán)境表達(dá)，屬于環(huán)境特異表達(dá)QTL。在26個(gè)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL中，14 個(gè)consensus QTL能夠在多個(gè)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)（表2），如 cqFT-A3-1和cqFT-A6-6在冬性、半冬性和春性環(huán)境都能夠穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-A3-2和cqFT-A10-2在半冬性和春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-C3-2和cqFT-C6-3在冬性和半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)；12 個(gè)consensus QTL僅在一個(gè)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，如 cqFT-A2-3和cqFT-A2-4僅在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-A6-7和cqFT-A6-8只在半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，僅有cqFT-A6-5在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)。

更為重要的是在A02和C06染色體上鑒定到7個(gè)開花期主效QTL，包括cqFT-A2-3、cqFT-A2-4、cqFT-C6-4、cqFT-C6-7、cqFT-C6-12、cqFT-C6-13和 cqFT-C6-14，其在2個(gè)種植環(huán)境的QTL表型變異達(dá)到10%以上或在一個(gè)種植環(huán)境達(dá)到20%以上（表2）。位于A02染色體上主效QTL cqFT-A2-3和cqFT-A2-4（圖4），其加性效應(yīng)都為正值，表明該QTL的貢獻(xiàn)率主要來(lái)自母本N53-2，并發(fā)現(xiàn)這2個(gè)主效QTL僅在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)。位于C06染色體上主效QTL（圖4），其加性效應(yīng)都為負(fù)值，表明該QTL的貢獻(xiàn)率主要來(lái)自父本KenC-8。主效QTL cqFT-C6-4、cqFT-C6-7、cqFT-C6-12和cqFT-C6-13 在冬性和半冬性環(huán)境都能夠穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-C6-14僅在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)。主效QTL的獲得及其QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)親本的確定對(duì)于下一步選擇正確親本進(jìn)行開花期近等基因系的構(gòu)建和該位點(diǎn)重要基因的圖位克隆，以及利用該位點(diǎn)進(jìn)行適宜花期材料的創(chuàng)制具有重要的指導(dǎo)作用。

2.4 油菜開花期主效QTL置信區(qū)間候選基因鑒定

根據(jù)甘藍(lán)型油菜KN DH群體的高密度遺傳連鎖圖與甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”基因組間的共線性關(guān)系，從7個(gè)油菜開花期主效QTL置信區(qū)間中鑒定出15個(gè)與成花誘導(dǎo)相關(guān)的候選基因（表3）。這些基因涉及油菜不同的開花路徑，包括赤霉素、光周期、生物鐘、春化作用響應(yīng)和花發(fā)育等。主效QTL cqFT.A2-3和cqFT.A2-4在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，其置信區(qū)間均鑒定到 BnaA02g12130D（FT） 和BnaA02g12260D ?（RGA1），這2個(gè)基因均參與調(diào)控開花整合子和赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在主效QTL cqFT.A2-4的置信區(qū)間鑒定到BnaA02g15390D（AGL12）、BnaA02g16710D（LKP2）、Bna02g20160D（SNZ），這3個(gè)基因主要參與了油菜的光周期和生物鐘路徑中的開花誘導(dǎo)過(guò)程。位于C06 染色體的主效QTL cqFT.C6-4、 cqFT.C6-7、cqFT.C6-12和cqFT.C6-13在冬性和半冬性環(huán)境能夠穩(wěn)定表達(dá)， cqFT.C6-14能夠在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)（圖4）。除了cqFT.C6-13，其他主效QTL區(qū)間均鑒定到BnaC06g24850D（MMP）和BnaC06g27090D （TSF），BnaC06g24850D的擬南芥同源基因主要調(diào)控花的發(fā)育，BnaC06g27090D的擬南芥同源基因主要受到光周期的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)擬南芥的開花誘導(dǎo)；在cqFT.C6-4、cqFT.C6-13和cqFT.C6-14的置信區(qū)間鑒定到BnaC06g32640D （AGL12），其擬南芥同源基因功能涉及光周期和生物鐘誘導(dǎo)途徑；cqFT.C6-4、cqFT.C6-7和 cqFT.C6-14的置信區(qū)間還鑒定到BnaC06g19930D（NUA），其擬南芥同源基因功能主要是對(duì)春化作用的響應(yīng)?？傊?，油菜開花期在春性環(huán)境主要受到赤霉素的誘導(dǎo)途徑，在冬性環(huán)境和半冬性環(huán)境主要受到光周期、生物鐘和春化作用響應(yīng)的誘導(dǎo)開花路徑。此外，在這些QTL置信區(qū)間還鑒定到如BnaC06g25500D（AP1）、BnaC06g19420D（SAR3）和BnaC06g27170D ?（ARF8） 等參與花發(fā)育調(diào)控路徑。

3 討? 論

開花期作為作物的重要農(nóng)藝性狀之一，研究油菜開花期對(duì)培育優(yōu)質(zhì)早熟油菜品種具有重大意義。許多研究者通過(guò)構(gòu)建DH系、F2：3家系等不同類型群體對(duì)油菜開花期進(jìn)行QTL定位，鑒定到許多主要QTL，為進(jìn)一步解析開花期的遺傳機(jī)理奠定基礎(chǔ)［29］。本研究利用一個(gè)包含348個(gè)株系的KN DH群體，通過(guò)將該群體在冬性、半冬性和春性生態(tài)環(huán)境的多年開花期表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KN DH群體及親本在不同生態(tài)條件下，油菜開花期的表型差異較大。在冬性和半冬性環(huán)境兩親本開花期差異較小，在春性環(huán)境父本墾C-8早于母本N53-2提前開花，且開花期差異較大。KN DH群體在冬性和半冬性環(huán)境下由于經(jīng)過(guò)寒冷的冬季延長(zhǎng)了植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致開花期較長(zhǎng)，不同DH系之間開花期變幅差異較小，KN DH群體開花期在春性環(huán)境相對(duì)較短，變幅相差較大（73.0 d）。油菜開花期表現(xiàn)出超親的遺傳特點(diǎn)，而且對(duì)不同DH系的開花期頻數(shù)分布分析表現(xiàn)出正態(tài)或近似正態(tài)分布的特點(diǎn)。這些結(jié)果表明開花期屬于數(shù)量性狀遺傳，且受到種植環(huán)境的影響，該結(jié)論與前人研究結(jié)果一致［30-31］。

QTL定位是研究數(shù)量性狀最有效的方法之一［32］。關(guān)于甘藍(lán)型油菜重要農(nóng)藝性狀的QTL定位和分析的研究已有大量研究，其中對(duì)開花期QTL定位是油菜作物研究的熱點(diǎn)之一［33］。Mei等［29］利用F2：3群體和遺傳連鎖圖獲得了6個(gè)開花期QTL，其中位于C03染色體上的2個(gè)主效QTL的表型變異超過(guò)30%。Wei等［34］對(duì)油菜開花期的QTL進(jìn)行定位，共檢測(cè)到17個(gè)QTL，其中位于A10和C01染色體上的3個(gè)主效QTL解釋的表型變異均超過(guò)20%。魏雅琪等［31］以油菜的F2：3群體為材料進(jìn)行開花期QTL定位，獲得了5個(gè)位于A02、A06、C02、C03、C06的半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。Luo等［35］對(duì)以春油菜為材料的DH群體進(jìn)行開花期QTL定位，鑒定到12個(gè)開花期QTL。這些研究的定位群體只是包含了兩個(gè)生態(tài)環(huán)境，而且由于定位群體和遺傳連鎖圖譜的差異，開花期QTL數(shù)量和分布差異較大。在本研究中，油菜KN DH群體的種植地點(diǎn)的生態(tài)類型包含了冬性、半冬性和春性環(huán)境，油菜開花期表型數(shù)據(jù)全面，得到的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。通過(guò)對(duì)KN DH群體在冬性、半冬性和春性環(huán)境近10年的開花期性狀進(jìn)行QTL定位解析，共鑒定到119個(gè)QTL，解釋表型變異在2.48%～25.96%。本研究獲得的位于A02、C02、C03和C06染色體上的QTL與前人研究鑒定的QTL所在染色體結(jié)果一致［33，36］。然而，本研究與前人研究獲得的QTL是否屬于相同位點(diǎn)，下一步工作還需要借助油菜參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析才能獲得結(jié)果。

環(huán)境穩(wěn)定QTL，特別是主效QTL的鑒定對(duì)于下一步通過(guò)QTL位點(diǎn)聚合和分子標(biāo)記輔助選擇培育廣適性的早熟油菜新品種（系）具有重要指導(dǎo)作用，同時(shí)也有利于為下一步開花期主效QTL位點(diǎn)的近等基因系構(gòu)建和圖位克隆奠定基礎(chǔ)。本研究鑒定到76個(gè)consensus QTL，其中26個(gè) consensus QTL屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL，包括cqFT-A2-3和cqFT-A2-4僅在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-A3-1和cqFT-A6-6、cqFT-C6-4在3個(gè)生態(tài)環(huán)境都能夠穩(wěn)定表達(dá)，cqFT-A3-2和cqFT-A10-2在半冬性和春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)， cqFT-A3-9、 cqFT-C6-2、cqFT-C6-3、 cqFT-C6-7和cqFT-C6-13等在冬性和半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)。沒有檢測(cè)到在冬性、春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。此外，對(duì)于不同穩(wěn)定表達(dá)QTL，其加性效應(yīng)來(lái)源不同，如cqFT-A2-3、cqFT-A3-1、cqFT-A6-6等QTL的加性效應(yīng)為正值，其效應(yīng)主要來(lái)自母本N53-2，位于C06染色體上的環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL 如cqFT-C6-3、 cqFT-C6-4、 cqFT-C6-7、 cqFT-C6-10、 cqFT-C6-12和cqFT-C6-13等QTL的加性效應(yīng)皆為負(fù)值，其效應(yīng)主要來(lái)自父本KenC-8。因此，在利用某個(gè)QTL位點(diǎn)進(jìn)行近等基因系構(gòu)建時(shí)，要特別注意其效應(yīng)來(lái)自哪個(gè)親本，以免搞錯(cuò)供體親本和受體親本耽誤科研進(jìn)程。

油菜開花期的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，內(nèi)部基因調(diào)控和外部環(huán)境信號(hào)刺激共同作用才能促使油菜正常開花。在以往的油菜花期性狀QTL定位研究中，許多研究者只是對(duì)油菜開花期進(jìn)行了顯著性QTL檢測(cè)［32-33，35］，而對(duì)于其QTL置信區(qū)間候選基因未進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。利用甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)與KN高密度SNP遺傳連鎖圖的線性比對(duì)，獲得了位于7個(gè)主效QTL區(qū)間的15個(gè)候選基因及擬南芥同源基因。油菜和擬南芥具有共同的祖先，且擬南芥作為蕓薹屬十字花科的模式植物，由于擬南芥基因功能的保守性，在甘藍(lán)型油菜中的基因可能具有相似的功能。這15個(gè)候選基因主要涉及調(diào)控開花過(guò)程中赤霉素、光周期、生物鐘、花發(fā)育、春化作用等開花調(diào)控誘導(dǎo)途徑。半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL? cqFT.C6-7對(duì)應(yīng)的候選基因?yàn)镹UA（BnaC06g19930D）、MMP（BnaC06g24850D）和AGL12（BnaC06g32640D）等，參與調(diào)控花發(fā)育、春化和光周期等途徑。AGL12是SOC，F(xiàn)LC和LFY的上游正向調(diào)節(jié)子，可有效的促進(jìn)植物提早開花［36］。這些研究結(jié)果充分表明油菜開花期的遺傳機(jī)理較為復(fù)雜，受到多條路徑的共同調(diào)控。

4 結(jié)? 論

中國(guó)是世界上第二大油菜生產(chǎn)國(guó)。作為水稻、玉米等重要倒茬作物，解析油菜開花期性狀對(duì)于培育早熟油菜品種具有重要意義。本研究分析近10個(gè)年份的3個(gè)生態(tài)環(huán)境的油菜KN DH群體開花期表型，油菜開花期表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，受到生態(tài)環(huán)境條件的影響。共檢測(cè)到油菜開花期119個(gè)identified QTLs，表型變異最大的是qFT-13DL16-4（25.96%）；QTL整合后獲得26個(gè)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)consensus QTLs，其中包括在春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL cqFT-A2-3和cqFT-A2-4，在冬性和半冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL cqFT-C6-4、cqFT-C6-7、cqFT-C6-12和cqFT-C6-13，在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)主效QTL cqFT-C6-14。7個(gè)主效QTL區(qū)間的15個(gè)候選基因［BnaA02g12260D（RGA1），BnaA02g15390D（AGL12）、BnaA02g16710D（LKP2）和BnaC06g19930D（NUA）等］，其同源基因功能主要涉及了赤霉素、光周期、生物鐘、春化作用響應(yīng)和花發(fā)育等。 本研究下一步將對(duì)主效QTL區(qū)域的候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期挖掘出控制開花期的關(guān)鍵基因，為利用該基因位點(diǎn)加快培育優(yōu)質(zhì)早熟油菜品種，縮短育種周期奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和理論支持。

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QTL Mapping and Candidate Gene Identification of Brassica napus at Flowering Stage

ZHAO Weiguo1，TA Na1， ZHANG Lijian2， LI Baojun2， ZHAO Xiaoping2， SHANG Liping2， WANG Hao2 and? MU Jianxin2

Abstract This study aimed to investigate the genetic mechanism of Brassica napus at flowering period using? the double haploid （DH） population and KN population KN high-density genetic linkage map.The phenotype data at flowering period under winter， semi-winter and spring environments were analyzed by using composite interval mapping （CIM） of Wincart 2.5 software to locate the QTL for flowering-related traits and identify candidate genes.The results revealed a total of 119 associated with flowering stage，with qFT-13DL16-4 explaining up to 19.63% of the phenotypic variation （PV） and qFT-13ZY2-1 exhibiting the minimum PV （2.48%）.Furthermore， these QTLs were integrated into a consensus QTL by meta-analysis， resulting in the identification of 26 environment-stable expression QTLs， including seven major QTLs.For example， cqFT-A2-3 and cqFT-A2-4 were stably expressed under the spring ecological environment， cqFT-C6-4， cqFT-C6-7， cqFT-C6-12， and cqFT-C6-13 were stably expressed in winter and semi-winter ecological regions， and cqFT-C6-14 was stably expressed in the winter ecological region.In conclusion， this study provides a foundation for fine mapping and map-based cloning of causal genes and offers guidance for the cultivation of new early maturing and high-yield rapeseed varieties in the future.Fifteen candidate genes involved in flowering regulation were identified within QTL confidence intervals，including BnaA02g12260D（RGA1）， BnaA02g15390D（AGL12）， BnaA02g16710D（LKP2） andBnaC06g19930D（NUA）， and these candidate genes are involved in the regulatory pathways， such as gibberellin， photoperiod， circadian clock， vernalization response and flower development.In conclusion，this study lays a foundation for fine mapping and map-based cloning of causal genes and offers guidance for the cultivation of new early maturing and high-yield rapeseed varieties in the future.

Key words Brassica napus; Double haploid population; Flowering trait; QTL analysis; Candidate gene

Received2021-12-30Returned 2022-08-30

Foundation item The Key Research and Research Plan of Shaanxi Province （No.2020ZDLNY04-01）; The Youth Innovation Team of Shaanxi University and Collaborative Innovation Center Project of Shaanxi Tea Industry（No.23JY001）;High Level? Talent Project of? Ankang University （No.2021AYQDZR12，No.2016AYQDZR12）.

First author ZHAO Weiguo， male， associate professor.Research area：biotechnology and molecular breeding of B.napus.E-mail：Zhaoweiguo0517@126.com

Corresponding?? author WANG Hao， male， research fellow.Research area：biotechnology and molecular breeding of B.napus.E-mail：wangzhuoyuan846@sohu.com

（責(zé)任編輯：成 敏 Responsible editor：CHENG Min）

收稿日期：2021-12-30修回日期：2022-08-30

基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020ZDLNY04-01）；陜西高校青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和陜西省茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（23JY001）;安康學(xué)院高層次人才引進(jìn)項(xiàng)目（2021AYQDZR12，2016AYQDZR12）。

第一作者：趙衛(wèi)國(guó)，男，副教授，研究方向?yàn)橛筒松锛夹g(shù)與分子育種。E-mail：zhaoweiguo0517@126.com

通信作者：王 灝，男，研究員，研究方向?yàn)橛筒松锛夹g(shù)與分子育種。E-mail：wangzhuoyuan846@sohu.com