周會(huì)明　王志敏　古廣紅　孔雨非　李加豪　保龍倩　康晟菀　趙燕

摘 要 開展星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）的分離鑒定及其營(yíng)養(yǎng)生理與個(gè)體發(fā)育相關(guān)性研究，以期為加快其他珍稀菇類的馴化進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。從3株野生寄生菇屬子實(shí)體中分離獲得純培養(yǎng)菌絲體，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定其分類地位。以子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率為主要指標(biāo)，篩選最優(yōu)菌株及其基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物的種類、增加倍數(shù)及其加入方式對(duì)最優(yōu)菌株個(gè)體發(fā)育的影響。結(jié)果表明：兩種鑒定方法結(jié)果一致，3株真菌均為星孢寄生菇。菌株YAASM4665在9種篩選培養(yǎng)基上的農(nóng)藝性狀優(yōu)于其他菌株，最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為小麥粉15 g、米飯35 g、水50 mL，pH自然。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的水增加至80 mL或用50 mL土豆汁代替，加入0.50%的葡萄糖，用等質(zhì)量的黑豆粉代替小麥粉，營(yíng)養(yǎng)物增加1/2倍以及營(yíng)養(yǎng)物混合加入等單因素處理下，該菌株的農(nóng)藝性狀綜合表現(xiàn)較好，其中土豆汁培養(yǎng)基子實(shí)體濕質(zhì)量最大（4.86 g），黑豆粉培養(yǎng)基生物學(xué)效率最高（8.50%），基質(zhì)中加入2%的葡萄糖時(shí)最有利于延遲厚垣孢子的形成。厚垣孢子形成期與其他農(nóng)藝性狀存在一定程度的相關(guān)性，菌絲萌發(fā)期與子實(shí)體濕質(zhì)量是其主要影響因素?？傊?，星孢寄生菇個(gè)體發(fā)育受菌株遺傳特性和營(yíng)養(yǎng)因素的影響，厚垣孢子的形成不利于該菇子實(shí)體正常發(fā)育，菌絲萌發(fā)期對(duì)其綜合影響最大，可為其他菇類的馴化提供參考。

關(guān)鍵詞 星孢寄生菇；分離鑒定；菌株篩選；營(yíng)養(yǎng)生理；個(gè)體發(fā)育

星孢寄生菇隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycota）、傘菌目（Agaricales）、離褶傘科（Lyophyllaceae）、寄生菇屬（Asterophora）。該菇作為一種兼有寄生與腐生特性的大型真菌，比一般菇類更容易人工栽培出菇[1]，同時(shí)，其菌褶上除附著擔(dān)孢子外，菌蓋表面還存在獨(dú)特的厚垣孢子[2-3]。營(yíng)養(yǎng)生理是眾多野生菇類得以馴化的基礎(chǔ)，個(gè)體發(fā)育是菇類營(yíng)養(yǎng)生理在形態(tài)建成各階段的直接體現(xiàn)，獨(dú)特的生活史又是菇類對(duì)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中異常環(huán)境的最終表達(dá)。因此，星孢寄生菇獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)方式和生活史是探究菇類營(yíng)養(yǎng)生理與個(gè)體發(fā)育機(jī)理的理想材料，在絕大多數(shù)野生菇類仍處于未開發(fā)狀態(tài)且其生長(zhǎng)環(huán)境正遭受日益破壞之際，該研究對(duì)加速其他野生菇類種質(zhì)資源馴化栽培進(jìn)程意義重大。

國(guó)內(nèi)外對(duì)星孢寄生菇的研究較少，主要集中在出菇條件[4]、形態(tài)學(xué)[5-7]、種質(zhì)資源[8-10]、親緣關(guān)系[11-12]等方面，但針對(duì)其個(gè)體發(fā)育的研究卻極少，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該菇存在兩大孢子體系且擔(dān)孢子的形成受厚垣孢子迅速產(chǎn)生抑制[3]。rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是研究真菌屬內(nèi)種間及種群系統(tǒng)學(xué)的有效手段[13]。營(yíng)養(yǎng)生理的探究可弄清菇類營(yíng)養(yǎng)需求規(guī)律、生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)及其與基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系，并為其人工栽培打下基礎(chǔ)[14]。個(gè)體發(fā)育研究是菇類應(yīng)用與推廣的基礎(chǔ)，已成為杏鮑菇[15]、猴頭菇[16]、雙孢蘑菇[17]等眾多菇類的研究熱點(diǎn)，但沒(méi)有合適的研究材料已成為珍稀菇類的研究難點(diǎn)。目前，針對(duì)星孢寄生菇的營(yíng)養(yǎng)生理與個(gè)體發(fā)育關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以星孢寄生菇野生子實(shí)體的采集、分離、鑒定為基礎(chǔ)，基于生理特性試驗(yàn)篩選最優(yōu)菌株及其基礎(chǔ)培養(yǎng)基，探究菌株遺傳特性與營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)最優(yōu)菌株個(gè)體發(fā)育的影響，并弄清其厚垣孢子的形成與菇體農(nóng)藝性狀的關(guān)系，以期為其他珍稀食用菌的人工馴化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

星孢寄生菇菌株YAASM4665、YAASM4666、YAASM4667由滇西科技師范學(xué)院食用菌科研小組采集，菌種保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所。

1.2 菌種的分離鑒定

采集現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定星孢寄生菇子實(shí)體形態(tài)、大小及生長(zhǎng)環(huán)境。挑選生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用75%酒精棉球?qū)⑹植潦孟荆儆描囎訆A取酒精棉球?qū)襟w表面消毒，然后在酒精燈外焰無(wú)菌區(qū)用手快速撕開菌柄，采用組織分離法，在菌柄和菌蓋交界處用事先已滅菌的手術(shù)刀切取黃豆大小的菌肉組織迅速移入PDA（土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂 ?1.5%，pH自然）培養(yǎng)基斜面，然后置于25 ℃培養(yǎng)箱遮光培養(yǎng)獲得該菌的純菌絲體。參照卯曉嵐[18]主編的《中國(guó)大型真菌》對(duì)采集的新鮮子實(shí)體從形態(tài)特征與生長(zhǎng)環(huán)境兩個(gè)方面進(jìn)行初步鑒定。接種少量星孢寄生菇菌絲至YPD（蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5%，pH自然）液體培養(yǎng)基搖動(dòng)恒溫（25? ℃）培養(yǎng)10 d，采用CTAB法抽提DNA，使用0.8%瓊脂糖檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。以ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG-3′）為引物，對(duì)已提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測(cè)序以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等[19]。

1.3 最優(yōu)菌株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選

根據(jù)星孢寄生菇具有與蟲草屬真菌蛹蟲草（Cordyceps militaris）均能生長(zhǎng)于活體的特性[20]，以小麥粉為對(duì)照，采用組培瓶培養(yǎng)法，設(shè)計(jì)9種不同處理的小麥粉與熟米飯培養(yǎng)基質(zhì)（表1），配方1～5加水均為50 mL，配方6～9分別在配方2～5的基礎(chǔ)上，減少水分的加入量，以配方6 的10 mL水為基礎(chǔ)，每增加10 g小麥粉和降低10 g米飯加水15 mL）。

制作過(guò)程：選擇新鮮、干燥、無(wú)病蟲的大米與小麥粒，將經(jīng)蒸鍋蒸熟的顆粒狀大米米飯先置于干凈的340 mL組培瓶底，壓實(shí)，再加入經(jīng)粉碎機(jī)處理的小麥粉、鋪平、加水，pH自然，然后清潔瓶口并覆蓋一層中間留有面積為0.5 cm2大小的聚乙烯塑料膜，最后覆蓋4層報(bào)紙并用棉細(xì)繩封口。采用高溫間歇滅菌法，121 ℃下滅菌99 min，室溫培養(yǎng)3 d后再次121 ℃下滅菌60 min，然后接經(jīng)種子培養(yǎng)基活化的3個(gè)星孢寄生菇菌株，在25 ℃下遮光培養(yǎng)，記錄菌絲萌發(fā)期（d）、生長(zhǎng)勢(shì)（菌絲濃密用“+++”表示，較濃密的用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生長(zhǎng)用“－”表示）[21-22]，測(cè)定封口期（從接菌至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基瓶口的時(shí)間）、原基分化期（d）（從接種到長(zhǎng)出原基的時(shí)間）、幼菇形成期（d）（從接種到長(zhǎng)出子實(shí)體的時(shí)間）、厚垣孢子形成期（d）（從接種到第一朵子實(shí)體上形成厚垣孢子的時(shí)間）、子實(shí)體濕質(zhì)量（g）、菌蓋直徑（mm）、菌柄長(zhǎng)度（mm）、菌柄直徑（mm）等農(nóng)藝性狀，每個(gè)配方的生物學(xué)效率=（子實(shí)體鮮質(zhì)量）/培養(yǎng)基干質(zhì)量×100%。根據(jù)子實(shí)體濕質(zhì)量（g）與生物學(xué)效率（%）篩選出最優(yōu)菌株以及相應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方。下同。

1.4 最優(yōu)菌株培養(yǎng)基優(yōu)化及其農(nóng)藝性狀相關(guān)性研究

以最優(yōu)菌株和基礎(chǔ)培養(yǎng)基（配方1）為對(duì)照（表2），探究水分含量（配方1～3）、土豆成分（配方1、4、5）、葡萄糖含量（配方1、6、7、8）、豆科作物種類（配方1、9、10、11、12）、營(yíng)養(yǎng)物增加倍數(shù)（配方1、13、14）、營(yíng)養(yǎng)物加入方式（配方1、15、16）對(duì)最優(yōu)菌株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，每處理3次重復(fù)，并采用相關(guān)性與通徑分析探究厚垣孢子形成期與其他農(nóng)藝性狀之間的關(guān)系。制作過(guò)程同“1.3”，其中配方1～14米飯均置于玻璃瓶底，配方15小麥粉置于玻璃瓶底，米飯置于最上層，配方16小麥粉與米飯混勻加入；取450 g土豆，加入450 mL水，經(jīng)榨汁機(jī)處理，采用200目土壤篩過(guò)濾并徒手?jǐn)D壓，土豆汁和土豆渣均在60 ℃下除水獲取干物質(zhì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所得結(jié)果均為3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件Duncans法對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株鑒定結(jié)果

2021年7月30日，在云南省臨滄市忙角社區(qū)樹林的紅菇屬（Russula）真菌腐爛子實(shí)體上采集到3株野生幼嫩子實(shí)體，其子實(shí)體小，菌蓋直徑為0.55～3.30 cm，白色，幼菇近球形，成熟菇半球形且覆蓋一層土黃色粉末狀的厚垣孢子；菌肉和菌褶白色，后者直生、分叉、稀疏；菌柄白色、柱狀、內(nèi)實(shí)，其基部有白絨毛，長(zhǎng)度1.10～6.20 cm，直徑約為0.20～0.45 cm。從形態(tài)學(xué)初步鑒定3個(gè)菌株均為星孢寄生菇（圖1）。

菌株YAASM4665、YAASM4666、YAASM4667測(cè)序獲得的ITS序列長(zhǎng)度分別為731 bp、669 bp、658 bp，與GenBank中的2個(gè)星孢寄生菇ITS序列（登錄號(hào)KP192566.1、MZ159455.1）相似性最高。結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，鑒定菌株3個(gè)菌株均為星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）（圖2）。

2.2 最優(yōu)菌株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選結(jié)果

由表3可知，菌株YAASM4665的菌絲萌發(fā)期均為3 d。配方2～5上，基質(zhì)總質(zhì)量不變下，僅改變小麥粉與米飯的比例，該菇農(nóng)藝性狀大部分參數(shù)均高于對(duì)照組，隨著小麥粉的增加，菌絲封口期延長(zhǎng)，菌蓋直徑增加，原基分化期與厚垣孢子形成期卻減小。配方6～9上，該菇封口期、幼菇形成期、厚垣孢子形成期隨著小麥粉與水分的增加而延長(zhǎng)，其子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率均低于配方3?？傊?，配方2上厚垣孢子形成期最長(zhǎng) ?（15 d），但子實(shí)體濕質(zhì)量最?。?.25 g），配方3上子實(shí)體濕質(zhì)量最大（4.80 g）且在顯著性因子0.05和0.01上與其他配方相比均達(dá)到極顯著水平，厚垣孢子形成期時(shí)間僅低于配方2，生物學(xué)效率最高（9.60%）。

菌株YAASM4666的菌絲萌發(fā)期除在配方9上最長(zhǎng)（5 d）外均為3 d，對(duì)照組封口期最?。? d）且未形成幼菇。配方2～5上，小麥粉的增加有利于菌絲封口期的延長(zhǎng)。配方6～9上，隨著小麥粉與水分的增加，封口期延長(zhǎng)，其子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率均低于配方3。總之，配方2上厚垣孢子形成期最長(zhǎng)（17 d），配方3上子實(shí)體濕質(zhì)量最大 ?（2.12 g），在顯著性因子0.05和0.01上與配方2、7不顯著，但與其他配方相比均達(dá)到極顯著水平，其厚垣孢子形成期（16 d）僅低于配方2，生物學(xué)效率最高（4.24%）。

菌株YAASM4667的菌絲萌發(fā)期也均為 ?3 d，對(duì)照組封口期最短（8 d），原基分化期最長(zhǎng)（15 d）且未形成幼菇。配方2～5上，小麥粉的增加有利于菌絲封口期、原基分化期延長(zhǎng)。配方 ?6～9上，隨著小麥粉與水分的增加，封口期延長(zhǎng)，其子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率均低于配方3?？傊?，配方5上子實(shí)體濕質(zhì)量（1.17 g）與生物學(xué)效率（2.34%）最大，但配方3上厚垣孢子形成期最長(zhǎng)（15 d），上述篩選指標(biāo)僅次于配方5，且子實(shí)體濕質(zhì)量（1.16 g）在顯著性因子0.05和0.01上與配方4、5不顯著，但與其他配方相比均達(dá)到極顯著水平。

綜合考慮，3株菌株子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率分別在配方3、配方3、配方5上達(dá)到最高，其中菌株YAASM4665上述篩選指標(biāo)均高于其他菌株。因此，該菇最優(yōu)菌株為YAASM4665，配方3為最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基質(zhì)。

2.3 最優(yōu)菌株YAASM4665培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

由表4可知，營(yíng)養(yǎng)物的種類、增加倍數(shù)及加入方式對(duì)該菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響較大。營(yíng)養(yǎng)階段，豌豆粉基質(zhì)上菌絲萌發(fā)期最短（1 d），生長(zhǎng)勢(shì)在大部分配方上濃密，封口期在紅豆粉基質(zhì)上最短 ?（5 d）。生殖階段，紅豆粉基質(zhì)上原基分化期 ?（6 d）與幼菇形成期（8.33 d）最短，基質(zhì)加入2% ?（1 g）葡萄糖時(shí)厚垣孢子產(chǎn)生時(shí)間最長(zhǎng)（30 d），基質(zhì)水被同體積的土豆汁替代后子實(shí)體濕質(zhì)量最大（4.86 g），且顯著性因子0.05和0.01上與其他配方相比達(dá)到極顯著水平，菌蓋與菌柄特征因基質(zhì)不同而差異較大，黑豆粉基質(zhì)上生物學(xué)效率最高 ?（8.50%）。

與對(duì)照相比，基質(zhì)含水量與菌株幼菇形成期、子實(shí)體濕質(zhì)量、菌柄長(zhǎng)度、生物學(xué)效率同步增加，當(dāng)水分為80 mL（配方3）時(shí)，其菌絲萌發(fā)期與厚垣孢子形成期縮短，大部分農(nóng)藝性狀明顯增加，其中子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率分別為3.95 g、 ?7.90%?；|(zhì)水被同體積的土豆汁（干質(zhì)量： ?34.33 g）（配方4）替代后，該菇子實(shí)體參數(shù)均明顯增加，尤其是子實(shí)體濕質(zhì)量達(dá)到最大，但大部分農(nóng)藝性狀均縮短，生物學(xué)效率降低（5.76%）。土豆渣（干質(zhì)量：44.08 g）（配方5）替代對(duì)照組基質(zhì)后菌絲生長(zhǎng)勢(shì)減弱，大多農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較差，其中厚垣孢子形成的時(shí)間縮短，子實(shí)體濕質(zhì)量?jī)H1.36 g。葡萄糖含量增加，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱，基質(zhì)中加入0.5%（0.25 g）（配方6）葡萄糖時(shí)，與對(duì)照相比其封口期、原基分化期、幼菇形成期、厚垣孢子形成期（15.5 d）均縮短，但子實(shí)體相關(guān)參數(shù)均明顯增加，子實(shí)體濕質(zhì)量達(dá)3.36 g；當(dāng)加入2% ?（1 g）（配方8）葡萄糖時(shí)封口期、原基分化期、幼菇形成期延長(zhǎng)，菌蓋直徑與生物學(xué)效率減小，子實(shí)體濕質(zhì)量?jī)H1.88 g，但厚垣孢子形成期最長(zhǎng)，菌柄參數(shù)增加。豆類基質(zhì)上與對(duì)照相比其菌蓋直徑減小，厚垣孢子形成期縮短，其中豌豆粉（配方9）、綠豆粉（配方11）、紅豆粉（配方12）替代小麥粉后大部分生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間縮短，子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率降低，被黑豆粉（配方10）替代后，封口期、原基分化期、幼菇形成期延長(zhǎng)，厚垣孢子形成期縮短，菌蓋直徑與菌柄長(zhǎng)度降低，但子實(shí)體濕質(zhì)量（4.25 g）與生物學(xué)效率增加且在豆類中最大。營(yíng)養(yǎng)物倍數(shù)的增加與對(duì)照相比，該菇子實(shí)體濕質(zhì)量、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑均有所增加，生物學(xué)效率降低，其余參數(shù)變化不大，其中營(yíng)養(yǎng)物增加1/2倍（配方13）時(shí)其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好，子實(shí)體濕質(zhì)量達(dá)到（3.91 g）。改變營(yíng)養(yǎng)物的加入方式后，與對(duì)照相比菌絲萌發(fā)期與厚垣孢子形成期縮短，原基分化期延長(zhǎng)，菌蓋直徑減小，其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混勻加入（配方16）時(shí)，其子實(shí)體濕質(zhì)量（3.90 g）與生物學(xué)效率明顯增加，該處理綜合表現(xiàn)最佳，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非混勻加入時(shí)上大多農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較差。

2.4 厚垣孢子形成期與其他農(nóng)藝性狀相關(guān)性 ?分析

由表5可知，菌株YAASM4665的厚垣孢子形成期與原基分化期、幼菇形成期、菌柄直徑呈不顯著正相關(guān)，與菌絲萌發(fā)期、菌絲封口期呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、生物學(xué)效率、子實(shí)體濕質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，其他農(nóng)藝性狀之間均存在一定程度的相關(guān)性。

上述相關(guān)性分析只能顯示厚垣孢子形成期與各農(nóng)藝性狀之間的直接關(guān)系，還要考慮不同農(nóng)藝性狀之間相互作用對(duì)其影響，需要通過(guò)逐步回歸分析法把厚垣孢子形成期與其他農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性分解為直接作用與間接作用，以明確不同農(nóng)藝性狀的相互作用對(duì)厚垣孢子形成期的影響。

以厚垣孢子形成期為因變量Y，菌絲萌發(fā)期、菌絲封口期、原基分化期、幼菇形成期、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑、子實(shí)體濕質(zhì)量、生物學(xué)效率分別為自變量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9，剔除偏回歸系數(shù)不顯著的自變量，建立Y=6.719+4.564X1-2.280X8的最優(yōu)多元回歸方程，X1與X8在回歸方程中統(tǒng)計(jì)量值F分別是6.110、6.674，P值分別是0.027、0.010，因此，根據(jù)多元線形回歸方程的整體檢驗(yàn)可知方程是極其顯著的。同時(shí)，經(jīng)過(guò)對(duì)該方程常數(shù)項(xiàng)與自變量進(jìn)行檢驗(yàn)，常數(shù)項(xiàng)對(duì)應(yīng)的置信水平為0.145，該值遠(yuǎn)比0.05大，說(shuō)明常數(shù)項(xiàng)對(duì)方程顯著，自變量X1、X8的置信水平分別為0.004、0.038，該值遠(yuǎn)比常用的置信水平0.05要小且不等于0，因此，該方程自變量的系數(shù)也是顯著的?？傊?，方程的整體、常數(shù)項(xiàng)以及自變量檢驗(yàn)均顯著，需要進(jìn)一步做通徑分析（表6）。

通徑分析表明：多元線形回歸方程中直接通徑作用的關(guān)聯(lián)程度為X1>X8，間接通徑的關(guān)聯(lián)程度與其相反（X8>X1），決策系數(shù)的大小為 ?X1>X8，說(shuō)明X8通過(guò)X1對(duì)Y的間接作用大于X1通過(guò)X8對(duì)Y的間接作用（0.261>-0.174），即子實(shí)體濕質(zhì)量對(duì)厚垣孢子形成期的間接影響大于菌絲萌發(fā)期，但菌絲萌發(fā)期對(duì)厚垣孢子形成期的綜合作用最大（R2=0.273）。

3 討? 論

星孢寄生菇作為寄生菇屬具有寄生[2]和腐生的獨(dú)特大型真菌，其生活史中擔(dān)孢子與厚垣孢子兩大孢子體系[3]及其營(yíng)養(yǎng)方式成為當(dāng)前研究重點(diǎn)，尤其厚垣孢子的形成機(jī)理與子實(shí)體形成極快成為眾多野生菇類馴化栽培的突破口，因此，探究該菇個(gè)體發(fā)育與基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系對(duì)上述研究有重要意義。

本研究表明，最優(yōu)菌株YAASM4665子實(shí)體濕質(zhì)量與生物學(xué)效率在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（小麥粉15 g、米飯35 g、水50 mL，pH自然）上均高于其他菌株，各菌株適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基的加水量與小麥粉和米飯組合有關(guān)，說(shuō)明星孢寄生菇菌株間營(yíng)養(yǎng)生理差異較大，其生長(zhǎng)發(fā)育在小麥粉與米飯的培養(yǎng)基組合上優(yōu)于單一的小麥粉，菇類農(nóng)藝形狀與菌株遺傳相關(guān)[24]。同時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中水增加至80 mL或被土豆汁代替，添加0.5%的葡萄糖，增加1/2倍的營(yíng)養(yǎng)物，小麥粉被黑豆粉代替，營(yíng)養(yǎng)物混合加入單因素處理下，最優(yōu)菌株農(nóng)藝性狀綜合表現(xiàn)較好，說(shuō)明該菇的個(gè)體發(fā)育除受品種[25]影響外，還受營(yíng)養(yǎng)物的種類、增加倍數(shù)及加入方式影響較大。因此，適宜的基質(zhì)含水量與營(yíng)養(yǎng)種類[26]、合理的營(yíng)養(yǎng)物配比[27]、均衡的營(yíng)養(yǎng)供給[28]等有利于提高菇類的產(chǎn)量。最后，厚垣孢子形成期與子實(shí)體濕質(zhì)量、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度等呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明厚垣孢子是該菇生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要特征，不利于子實(shí)體的正常發(fā)育。

上述結(jié)論驗(yàn)證了該菇具有腐生的營(yíng)養(yǎng)特性且易出菇，營(yíng)養(yǎng)物的種類、數(shù)量、加入方式對(duì)其個(gè)體發(fā)育影響較大，厚垣孢子的形成與農(nóng)藝形狀相關(guān)，有望為其他珍稀食用菌的人工馴化提供理論指導(dǎo)，但營(yíng)養(yǎng)物（如大米和小麥）的組分、地域、時(shí)間來(lái)源、用量、培養(yǎng)容器以及操作人員技術(shù)水平、試驗(yàn)設(shè)備型號(hào)等因素均可能引起試驗(yàn)誤差。

總之，星孢寄生菇作為理想的個(gè)體發(fā)育研究材料，其生長(zhǎng)發(fā)育與遺傳和營(yíng)養(yǎng)條件息息相關(guān)，不同因素下其厚垣孢子的產(chǎn)生存在一定程度的差異，有必要針對(duì)其開展環(huán)境脅迫[29]、胞外酶活性[30]、菇體轉(zhuǎn)錄組與蛋白組分析[31- 32]等方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究。同時(shí)，該菇快速出菇的原因、寄生與腐生的營(yíng)養(yǎng)方式之間的關(guān)系以及營(yíng)養(yǎng)物對(duì)個(gè)體發(fā)育的作用機(jī)理也有待進(jìn)一步深入研究。

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Isolation，Identification，Screening and Correlation of Physiological Characteristics of Asterophora lycoperdoides

ZHOU Huiming，WANG Zhimin，GU Guanghong，KONG Yufei，LI Jiahao，BAO Longqian，KANG Shengwan and ZHAO Yan

Abstract The isolation and identification of Asterophora lycoperdoides and the correlation between their nutritional physiology and ontogeny were invesitigated to provide a theoretical basis for expediting the domestication process of other rare mushrooms. In this paper，three pure cultured mycelia strains were isolated from the fruiting bodies of three wild Asterophora.Their taxonomic statuses were identified by morphology and molecular biology. The wet mass and biological efficiency of the fruiting bodies were used as the main indicators to screen and identify the optimal strains and their corresponding basic media. The effects of different nutrient types，increase multiples and addition methods of nutrients on the ontogeny of the optimal strain were determined..The two identification approaches consistently categorized the three wild fungi strains within the A.lycoperdoides species.Among the screened media，strain YAASM4665 exhibited superior agronomic traits on nine media compositions，with the optimal basic media consisting of 15 g of wheat flour，35 g of cooked rice，and 50 mL of water，maintaining a natural pH value.A comprehensive investigation of five factors，including increasing the water content in basic media to 80 mL or substituting it with 50 mL of potato juice，adding 0.50% glucose，replacing wheat flour with an equal mass of black bean flour，increasing nutrient levels by 1/2 multiples，and nutrient mixture，resulted in the optimal strain outperforming all other selected media.The highest fruiting body wet mass? was achieved using potato juice （4.86 g），while the black bean flour media exhibited the highest biological efficiency （8.50%）.The addition of 2% glucose facilitated chlamydospore formation delay. The chlamydospore formation period was found to be correlated with other agronomic traits to some extent，The mycelia germination period and fruiting body wet mass were identified as the main influencing factors. In conclusion，the ontogeny of A.lycoperdoides is affected by the genetic traits of the strainand nutrient factors，the chlamydospore formation is unfavorable to normal development of the fruiting bodies. The mycelium germination period may exerts the most significantly comprehensive impact on the chlamydospore formation. The findings above can be of any reference for domestication of other mushrooms.

Key words Asterophora lycoperdoides; Isolation and identification;Strain screening;? Nutritional physiology; Ontogeny

Received2022-10-28Returned 2023-01-06

Foundation item Joint Specialized Project of Local Universities in Yunnan Province[No. 2019FH001（-059）].

First author ZHOU Huiming，male，associate professor. Research area：domestication，genetics and cultivation of edible fungi. E-mail：632243530@qq.com

Corresponding?? author GU Guanghong，male，teaching assistant. Research area：domestication and genetics of macrofungi germplasm resources. E-mail：1786288023@qq.com

（責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

收稿日期：2022-10-28修回日期：2023-01-06

基金項(xiàng)目：云南省地方本科高校（部分）基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)[2019FH001（-059）]。

第一作者：周會(huì)明，男，副教授，主要從事食用菌馴化、遺傳及栽培研究。E-mail：632243530@qq.com

通信作者：古廣紅，男，助教，從事大型真菌種質(zhì)資源的馴化與遺傳研究。E-mail：1786288023@qq.com