朱智濤,陳 鋒,袁 寧,陳祖鵬

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011)

腰椎間盤突出癥(LDH)是常見的脊柱疾病之一,其因主要是腰椎的退行性病變,椎間盤纖維環(huán)破裂,椎間盤的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞,其中的髓核突出,從而壓迫脊髓及神經(jīng)根,出現(xiàn)腰腿痛、下肢放射痛等癥狀的腰部綜合征[1-2]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,LDH發(fā)病率較高,約占人口的1.00%,多見于20～40歲中青年人群,好發(fā)于L4～L5及L5～S1椎間[3-4]。隨著智能信息化的滲透,久坐的工作方式較為常見,LDH發(fā)病率也因此逐年升高,患病人群的生活質(zhì)量受到了嚴(yán)重影響,也增加了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。使用中藥方劑治療LDH的方法繁多,目前主要有四妙丸、左歸丸、右歸丸、身痛逐瘀湯、甘姜苓術(shù)湯、獨(dú)活寄生湯等方劑。牛膝、蒼術(shù)、薏苡仁、黃柏組成四妙丸,是清濕熱、舒經(jīng)絡(luò)名方之一。目前尚無(wú)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來(lái)研究四妙丸對(duì)治療LDH作用機(jī)制,因此,本研究目的在于分析四妙丸的藥理作用,為臨床上使用四妙丸治療LDH提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1文章中運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件工具:見表1。本研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

表1 文章中運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件工具

1.2分析四妙丸的化合物及作用靶點(diǎn)蛋白:使用TCMSP選取出四妙丸藥物的化合物成分,收錄標(biāo)準(zhǔn)為:口服利用度(OB%≥30%)、類藥性(DL≥0.18);再參考相關(guān)文獻(xiàn)及《中華人民共和國(guó)藥典》,對(duì)雖然不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但有明確生物活性及藥理作用報(bào)道的化合物也納入候選化合物。篩選出來(lái)的化合物在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)收集,并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行簡(jiǎn)稱注釋。

1.3選取LDH的疾病靶點(diǎn):從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出關(guān)鍵詞“Lumbar disc herniation”,收集LDH發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)。

1.4四妙丸和LDH的交集靶點(diǎn)的確定:將LDH疾病發(fā)病靶點(diǎn)和四妙丸標(biāo)準(zhǔn)化處理后的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)通過(guò)R軟件導(dǎo)入Venny作圖平臺(tái),通過(guò)映射疾病-四妙丸靶點(diǎn)來(lái)構(gòu)建韋恩圖。映射出交集靶點(diǎn)可能為四妙丸治療LDH的作用靶點(diǎn)。

1.5四妙丸治療LDH主要活性化合物篩選:分別整理四妙丸藥物的活性化合物與作用靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系,應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建四妙丸治療LDH的“活性化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行相關(guān)分析,并選取出關(guān)鍵活性化合物。

1.6構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)篩選:將1.4中獲得的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String線上分析平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,參數(shù)的設(shè)置保持默認(rèn),構(gòu)建出作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。再利用CytoHubba插件,篩選出四妙丸治療LDH的核心靶點(diǎn)。

1.7四妙丸治療LDH作用靶點(diǎn)功能及信號(hào)通路分析:利用R軟件對(duì)篩選出交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,得出生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成、通路信息。

2 結(jié)果

2.1四妙丸的方藥組成及其藥性分類:對(duì)四妙丸的4味中藥進(jìn)行藥性分析,在歸經(jīng)分類上,多行于腎經(jīng)、肝經(jīng)、脾經(jīng)。功效上多屬化濕藥。性味分類上,多屬于苦味、甘味。見表2。

表2 四妙丸組成藥物的藥性分類

2.2四妙丸的化學(xué)成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè):結(jié)合TCMSP篩選后,可得到四妙丸活性藥物成分75種,其中黃柏37種、牛膝20種、蒼術(shù)9種、薏苡仁9種。經(jīng)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)匹配后,可得到四妙丸2 902個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn), 分別為蒼術(shù)276個(gè),黃柏1 346個(gè),牛膝1 034個(gè),薏苡仁246個(gè)。

2.3LDH疾病靶點(diǎn)以及與四妙丸交集靶點(diǎn)的確定:分別在GeneCards、OMIM及Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到疾病靶點(diǎn)380個(gè)、31個(gè)及9個(gè),綜合數(shù)據(jù)去重剔除后,得出LDH的相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)共399個(gè)。見圖1。并得出四妙丸與LDH的交集靶點(diǎn),共45個(gè)。見圖2。

圖1 LDH疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

圖2 四妙丸與LDH靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4四妙丸治療LDH主要活性成分篩選結(jié)果:四妙丸治療LDH的“活性化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)顯示。見圖3。其中有48種化合物成分沒有找到對(duì)應(yīng)疾病靶點(diǎn),故未參與分析,得到27種有效化合物成分。共四妙丸4種組成藥物的27個(gè)活性成分通過(guò)調(diào)控45個(gè)靶點(diǎn)治療LDH,度值排名前2的活性化合物,即關(guān)鍵活性化合物為槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)。

注: :牛膝的化合物成分; :蒼術(shù)的化合物成分; :薏苡仁的化合物成分; :黃柏的化合物成分; :“藥物-疾病”的交集靶點(diǎn);如圓形內(nèi)有多種顏色,表示此化合物成分存在于多種中藥中,具體見相關(guān)顏色。

2.5共同靶點(diǎn)蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析:對(duì)交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)網(wǎng)絡(luò)。見圖4。使用Cytoscape的插件CytoHubba篩選出6個(gè)作為核心靶點(diǎn),分別為促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、白細(xì)胞介素(IL)-6、雌激素受體(ESR)1、FOS核蛋白轉(zhuǎn)錄因子和JUN原癌基因。見圖5。

圖4 LDH與四妙丸交集靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 四妙丸治療LDH的核心靶點(diǎn)

2.6交集靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG分析:交集靶點(diǎn)GO富集分析得到GO條目2 004個(gè)。其中生物過(guò)程1 881個(gè),細(xì)胞組成 25個(gè),分子功能98個(gè)。富集程度前10見圖6。交集靶點(diǎn)KEGG富集分析得到137條信號(hào)通路,富集程度最高的前20條信號(hào)通路見圖7。

圖6 四妙丸治療LDH交集靶點(diǎn)富集的GO分析結(jié)果圖

圖7 四妙丸治療LDH交集靶點(diǎn)富集的KEGG通路氣泡圖

3 討論

LDH引起的腰腿痛和下肢放射性麻木疼痛是促使患者就診的重要原因,有學(xué)者認(rèn)為當(dāng)脊髓神經(jīng)根受到壓迫時(shí),主要表現(xiàn)不是疼痛而是麻木,而炎性反應(yīng)是腰腿痛的主要原因。中醫(yī)方面,LDH歸于“腰痛病”“痹證”的范疇,病機(jī)多為“經(jīng)脈閉阻,腰府失養(yǎng)”,而四妙丸源自《成方便讀》,有清濕熱、利濕濁、通經(jīng)活絡(luò)的功效,是治療腰痛病、痹癥等疾病的經(jīng)典方劑之一。四妙丸由黃柏、薏苡仁、蒼術(shù)、牛膝組成,該方藥方組成較少,但其藥力專一、藥性平穩(wěn)、組方精煉。現(xiàn)代藥理研究表明該方具有抗炎抑菌、調(diào)節(jié)免疫、解熱鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[6]。

研究得出四妙丸治療LDH的關(guān)鍵化合物是槲皮素、漢黃芩素。槲皮素研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒作用[7-8]。孫軍等[9]發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激損傷有著改善作用。有研究表明漢黃芩素能抗炎是因減少前列腺素E2的表達(dá)[10-11]。有前期研究表明漢黃芩素能通過(guò)下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平達(dá)到抑制炎性反應(yīng)作用[12],而TNF-α與炎性反應(yīng)關(guān)系緊密。因此,四妙丸中關(guān)鍵活性化合物的抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化應(yīng)激的作用可能在治療LDH發(fā)揮了重要作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示,四妙丸治療LDH的核心靶點(diǎn)為MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1、FOS和JUN。MAPK14作為MAPK家族中的成員之一,其表達(dá)異常與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到炎性因子、紫外線照射等刺激后,p38MAPK通路得到激活,炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)也隨之啟動(dòng)[13]。IL-6作為機(jī)體重要的調(diào)節(jié)因子,分泌到血清中,并通過(guò)IL-6受體α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄炎性反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)ESR1基因的表達(dá)可能會(huì)增加膝骨關(guān)節(jié)炎的患病風(fēng)險(xiǎn)[14]。FOS是神經(jīng)功能活動(dòng)的代謝性標(biāo)志物,參與感覺形成的信息傳遞、調(diào)控和整合[15]。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí),FOS的陽(yáng)性表達(dá)與傷害性刺激信號(hào)的傳入密切相關(guān)[16]。JUN存在于神經(jīng)細(xì)胞中,參與疼痛信息的傳遞過(guò)程,能對(duì)神經(jīng)傳遞物質(zhì)、神經(jīng)沖動(dòng)、激素和外部刺激等信息做出反應(yīng),進(jìn)行特異性表達(dá)的特點(diǎn)[17]。可見,四妙丸可能在抑制炎性反應(yīng)、阻礙傷害性刺激信號(hào)的傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,具有抗炎、抑制神經(jīng)功能活動(dòng)的作用。其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

GO富集分析結(jié)果提示,其生物過(guò)程體現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。以上反映在LDH發(fā)病過(guò)程中較為常見。KEGG富集的通路分析發(fā)現(xiàn)涉及多條信號(hào)通路,主要包括AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。AGE-RAGE通路能激活NF-KB,進(jìn)而刺激促氧化靶基因的表達(dá),加速炎性反應(yīng)因子的分泌,而大量的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)能觸發(fā)相對(duì)應(yīng)的炎性反應(yīng),造成持續(xù)性細(xì)胞損傷及功能紊亂[18]。TNF稱為腫瘤壞死因子,是引起椎間盤退變的主要炎性反應(yīng)物質(zhì)之一[19]。IL-17是作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組促炎因子之一,參與體內(nèi)的炎性反應(yīng)[20]?？梢娝拿钔杩赡茉诳寡?、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑上有效地治療LDH,且與目前已知研究結(jié)果一致。

綜上所述,四妙丸治療LDH是可能是通過(guò)調(diào)控MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1和FOS的產(chǎn)生,抑制炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、阻礙傷害性刺激信號(hào)的傳入來(lái)實(shí)現(xiàn)的,該治療過(guò)程中槲皮素及漢黃芩素的消炎鎮(zhèn)痛及修復(fù)氧化應(yīng)激損傷的功能可能其中發(fā)揮了重要的作用。文章分析出多個(gè)藥物有效成分、多個(gè)治療靶點(diǎn)及多條信號(hào)通路,這也體現(xiàn)出中藥復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療疾病的特點(diǎn),為中醫(yī)藥臨床治療LDH及進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制提供了參考。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起是“中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展”的體現(xiàn),開辟了中醫(yī)藥研究的新思路與方法。中醫(yī)藥的經(jīng)驗(yàn)診療與循證醫(yī)學(xué)的有機(jī)結(jié)合是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的表現(xiàn)形式,也是一種新型研究方式。同時(shí),作為一門仍處于初期階段的新興學(xué)科,仍存在很多不足與局限性:①受各種平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)軟件算法的限制,有小部分藥物有效化合物未能找到相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),也沒有明確配伍后藥物有效成分是否會(huì)發(fā)生藥代動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)的改變,如是否能將單味中藥活性成分疊加作為復(fù)方活性成分,而中藥在煎制過(guò)程中是否有藥性變化。②中藥活性成分確定篩選標(biāo)準(zhǔn)是口服生物利用度、類藥性,但卻忽視了中藥活性成分存在著口服生物利用度低的問(wèn)題。如人參中的人參皂苷類,口服生物利用度低,但是人參作為拯危救脫、補(bǔ)肺脾氣要藥,在中醫(yī)藥治療疾病中有著舉足輕重作用,以口服生物利用度作為標(biāo)準(zhǔn)排除人參皂苷類顯然不合理。③需進(jìn)一步完善和驗(yàn)證基因組代謝途徑,以空間關(guān)聯(lián)為基礎(chǔ)將藥物化合物、靶點(diǎn)、病理-生理過(guò)程、疾病進(jìn)行進(jìn)一步研究。④需要用動(dòng)物試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等來(lái)驗(yàn)證研究的合理性、降低同質(zhì)化與偏倚性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是符合中醫(yī)藥的發(fā)展原則,隨著研究的不斷深入以及分析手段的更新,現(xiàn)代化技術(shù)與中醫(yī)藥能更好地有機(jī)結(jié)合。至此本研究有以下3點(diǎn)建議:①網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、人工智能、生物信息學(xué)等多種學(xué)科,雖然涉及領(lǐng)域廣,但同時(shí)單一領(lǐng)域的研究有所不足,需有所側(cè)重。②中藥制劑需要與新型制作工藝相結(jié)合,如固體分散技術(shù)、納米技術(shù)、自微乳化釋藥系統(tǒng)、磷脂復(fù)合技術(shù)等,以達(dá)到物盡其效。③目前一些新興起研究方法例如單細(xì)胞組學(xué)、空間組學(xué)尚未與中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)進(jìn)行交會(huì),需突破技術(shù)屏障,結(jié)合新型研究方法,在原有的研究方法上推陳出新,同時(shí)這也需要多學(xué)科研究者共同努力。