張海琛，馬清花，許?？桑⒘樟?，梁 健

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

青海湖是我國(guó)面積最大的內(nèi)陸咸水湖泊，湖水pH 為9.1～9.4，26～32 mmol/L，鹽度為11.9～13.49 g/L，是世界上海拔最高的咸水湖之一，其獨(dú)特的自然生態(tài)環(huán)境造就了獨(dú)特的高寒生態(tài)系統(tǒng)[1-2]。青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)俗稱湟魚(yú)、無(wú)鱗魚(yú)等，屬鯉形目 (Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裸鯉屬 (Gymnocypris)，可以在高海拔的缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，生命力強(qiáng)，是青海湖重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，處于青海湖整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的核心地位[3-4]。青海湖裸鯉屬溯河性產(chǎn)卵魚(yú)類(lèi)，每年的4—8 月為其產(chǎn)卵繁殖期，6 月中旬達(dá)到其產(chǎn)卵盛期。產(chǎn)卵時(shí)從青海湖溯游到淡水支流布哈河、泉吉河等水流緩慢的河灘道，完成產(chǎn)卵后又洄游到青海湖內(nèi)。同時(shí)青海湖裸鯉在洄游過(guò)程中先是面臨著鹽堿度的下降，在回到青海湖過(guò)程中又面臨著鹽堿度的升高[5]，表現(xiàn)出極強(qiáng)的鹽堿適應(yīng)性和耐受性。我國(guó)鹽堿水資源豐富，但絕大部分的水生生物對(duì)于水中鹽堿度的變化比較敏感。高鹽度會(huì)改變水生生物的滲透壓，高堿度會(huì)損傷水生生物DNA[6]、消化酶及免疫相關(guān)酶活性下降[7]、耗氧率升高[8]等。同時(shí)，鹽度、堿度和pH 對(duì)水生生物的生長(zhǎng)、代謝、繁殖等方面表現(xiàn)出交互協(xié)同作用[9]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序作為研究復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組變化的強(qiáng)有力工具，可用于物種中尤其是那些基因組未知的物種中的基因發(fā)現(xiàn)和分子信號(hào)通路的鑒定，而目前關(guān)于青海湖裸鯉在鹽堿度耐受轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的研究仍然比較少。本研究中，對(duì)青海湖裸鯉在青海湖河口水域(有一定鹽堿度)和淡水下的鰓、腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并通過(guò)比較分析篩選出在鹽堿耐受過(guò)程中發(fā)揮作用的滲透、免疫、代謝相關(guān)基因，同時(shí)為青海湖裸鯉在鹽堿脅迫下的基因表達(dá)水平變化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用青海湖裸鯉取樣于青海湖及其周邊水系，從同一時(shí)期 (5—7 月) 的淡水(無(wú)脅迫處理，青海省海北藏族自治州剛察縣泉吉河，99.89° E，37.24° N)以及青海湖與哈爾蓋河口 (鹽堿環(huán)境脅迫，pH 9.58，鹽度為6，堿度3.22 mmol/L,100.42° E，37.12° N)處分別收集3 尾青海湖裸鯉(3～4 齡，體長(zhǎng)200～300 mm，體重100～150 g)。獲得裸鯉樣品后將魚(yú)立即處死，快速分離其鰓組織和腎臟組織，并儲(chǔ)存于液氮中備用。本研究獲得了青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程 中操作人員嚴(yán)格遵守倫理規(guī)范，并按照青海大學(xué)倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 RNA 提取和文庫(kù)構(gòu)建

使用TRIzol 法參照說(shuō)明書(shū)分別從2 個(gè)采樣地的青海湖裸鯉鰓組織和腎臟組織中提取總RNA，然后用DNase I (TaKaRa，日本)去除基因組DNA。通過(guò)使用NanoPhotometer-NP80 (Implen，德國(guó))對(duì)RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳用于測(cè)量RNA 的完整性。

轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的制備及測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用Oligo(dT)的磁珠從總RNA 中分離出具有poly(A)的mRNA，進(jìn)行純化，用fragmentation buffer 將其片段化 (100～400 bp)，并使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，然后通過(guò)添加緩沖液、dNTPs、DNA 聚合酶I 和RNase H 合成雙鏈cDNA。使用AMPure XP beads再次純化雙鏈cDNA。首先對(duì)純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，加A 尾并連接到測(cè)序接頭，然后使用AMPure XPbeads 進(jìn)行片段大小的選擇。最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并使用AMPure XP beads 純化PCR 產(chǎn)物以獲得最終的cDNA 文庫(kù)。構(gòu)建好文庫(kù)后，使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，并將文庫(kù)稀釋至1.5 ng/μL。然后使用Agilent 2 100 檢測(cè)文庫(kù)的插入片段大小 (insert size)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù) (qRT-PCR)方法準(zhǔn)確定量文庫(kù)的有效濃度 (文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L)以確保文庫(kù)質(zhì)量。最后基于 Illumina HiSeq 2000 測(cè)序平臺(tái)，以Pairedend 雙末端測(cè)序技術(shù)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)拼接和功能注釋

由于原始測(cè)序數(shù)據(jù)中會(huì)包含測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N (N 表示不確定堿基信息)率較高序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列，這將嚴(yán)重影響后續(xù)分析的質(zhì)量。因此在分析之前需先對(duì)測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和質(zhì)控，從而得到高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)(clean data)以保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，然后將質(zhì)控后得到的有效數(shù)據(jù) (clean reads)使用Trinity 軟件[10]進(jìn)行無(wú)參轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。使用Blast X 程序?qū)nigenes 與六大數(shù)據(jù)庫(kù) (NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)) 進(jìn)行比對(duì)(E<10-5)，獲得在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，并對(duì)其在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 差異表達(dá)基因(DEGs)分析

本實(shí)驗(yàn)根據(jù) FPKM (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段)方法評(píng)估基因的表達(dá)量。使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2 軟件對(duì)raw counts 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P-adjust <0.05 &|log2FC| ≥2 作為篩選條件以獲得比較組間差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，為了控制整體推斷結(jié)果發(fā)生錯(cuò)誤的概率或頻次，使用BH (Benjamini hochberg)方法對(duì)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得的P-value 進(jìn)行矯正，然后對(duì)樣本間差異表達(dá)基因DEGs 進(jìn)行GO功能注釋和KEGG 通路富集分析。分別將注釋、富集到GO term 和KEGG 通路中的基因進(jìn)行篩選，獲得滲透、免疫、代謝相關(guān)基因。使用Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的可視化分析，通過(guò)計(jì)算節(jié)點(diǎn)權(quán)重以及節(jié)點(diǎn)的連通度，篩選可能的關(guān)鍵基因。

1.5 qRT-PCR 分析

為驗(yàn)證RNA-Seq 數(shù)據(jù)，使用qRT-PCR 分析隨機(jī)選擇的具有不同功能的差異基因的組織表達(dá)特異性。使用Primer premier 5 軟件和在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 對(duì)所選差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)引物 (表1)。使用TRIzol 試劑(Invitrogen，美國(guó)) 從青海湖水域和淡水泉吉河的青海湖裸鯉鰓、腎臟組織中提取總RNA。在測(cè)量提取的RNA 的完整性和濃度后，使用Prime ScriptTMRT-PCR 試劑盒 (TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (TliRNase H Plus) 試劑盒 (TaKaRa，日本)，在Roche LightCycler 480 (Roche，瑞士) 上進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。反應(yīng)程序?yàn)?5 °C 30 s,95 °C 5 s,60 °C 30 s (40 個(gè)循環(huán))。最后使用2-△△CT[11]方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，且CT值為各樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the experiments

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及質(zhì)控

本研究分別提取了青海湖水域和淡水泉吉河中的青海湖裸鯉鰓、腎臟組織的總 RNA，獲得并構(gòu)建了12 個(gè)相應(yīng)的 cDNA 文庫(kù)，同時(shí)采用 Illumina HiSeq 2000 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。青海湖水域獲得的青海湖裸鯉鰓、腎臟組織分別編號(hào)為B 和E，淡水泉吉河中獲得的青海湖裸鯉鰓、腎臟組織編號(hào)為C、F。各樣品質(zhì)控?cái)?shù)據(jù) (clean data)均達(dá)到 6.74 Gb 以上，Q30 堿基百分比在94.38%以上 (表2)。使用Trinity 對(duì)所有樣本clean data 進(jìn)行從頭組裝，將并對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化評(píng)估，結(jié)果顯示，組裝得到的轉(zhuǎn)錄本 (transcript)個(gè)數(shù)為880 998，以聚類(lèi)最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本為unigene，其個(gè)數(shù)為541 429，N50 (組裝獲得的unigene 按長(zhǎng)度排列，累加達(dá)到總unigene 長(zhǎng)度的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的unigene 的長(zhǎng)度)平均長(zhǎng)度為612 bp。其中長(zhǎng)度為0～500 bp 的unigenes 共有404 000 個(gè)，占比最大，占總unigenes 的75% (圖1)。

圖1 青海湖裸鯉 unigenes 的長(zhǎng)度分布Fig.1 Unigene Sequence Length distribution of G. przewalskii

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistics table of sequencing data

2.2 轉(zhuǎn)錄組注釋

將經(jīng)質(zhì)控后獲得的unigenes 與6 大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行比對(duì)，獲得在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，并對(duì)其在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。共有107 568個(gè)unigenes 得到了注釋，注釋率為19.87%。其中有97 816 個(gè)unigenes 注釋到了NR 庫(kù)，注釋率為18.07%；68 226 個(gè) unigenes 注釋到了 Swiss-Prot 庫(kù)，注釋率為12.6%；46 459 個(gè)unigenes 注釋到了Pfam 庫(kù)，注釋率為8.58%；16 894個(gè)unigenes 注釋到了COG 庫(kù)，注釋率為3.12%；13 560個(gè)unigenes 注釋到了GO 庫(kù)，注釋率為2.5%；51 153 個(gè)unigenes 注釋到了KEGG 庫(kù)，注釋率為9.45% (圖2)。拼接所得的 unigene 與NR 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，相似序列所占比例最高的幾種物種分別是鯉 (Cyprinus carpio，21.42%)、犀角金線鲃 (Sinocyclocheilus rhinocerous，17.01%)、安水金線鲃 (S.anshuiensis，14.32%)、滇池金線鲃(S.grahami，13.26%)、中華菊頭蝠 (Rhinolophus sinicus，5.39%)、斑馬魚(yú) (Danio rerio，4.71%) (圖3)。

圖2 不同數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果1.NR 數(shù)據(jù)庫(kù),2.Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù),3.Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù),4.COG 數(shù)據(jù)庫(kù),5.GO 數(shù)據(jù)庫(kù),6.KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)。Fig.2 Annotated results of different databases1.annotated in NR,2.annotated in Swiss-Prot,3.annotated in Pfam,4.annotated in COG,5.annotated in GO,6.annotated in KEGG.

圖3 NR 注釋物種分布Fig.3 NR annotated species distribution of G. przewalskii

2.3 差異表達(dá)基因

利用 DEseq 2 軟件分析2 個(gè)區(qū)域的青海湖裸鯉鰓、腎臟中差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，共有832 個(gè)基因在2 個(gè)區(qū)域的組織中共表達(dá)，3 269 個(gè)基因僅在鰓中 (Bvs.C)表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的DEGs 共2 403 個(gè)，下調(diào)的1 698 個(gè)；4 281 個(gè)基因僅在腎臟 (Evs.F)中表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的DEGs 共3 506 個(gè)，下調(diào)的1 607 個(gè)。

2.4 差異表達(dá)基因的 GO 功能分類(lèi)分析

本研究中，GO 功能注釋分析結(jié)果表明共有4 101 (Bvs.C)和5 113 (Evs.F)個(gè)差異表達(dá)基因分別注釋到了GO 的3 大分類(lèi)中，即生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。其中，Bvs.C 和EvsF 中注釋到結(jié)合 (binding)的DEGs 數(shù)量最多，分別為226 個(gè)和261 個(gè)。其次為細(xì)胞過(guò)程 (cellular process)，注釋到該GO term 的DEGs 分別為239 個(gè)和232 個(gè)。注釋到代謝過(guò)程 (metabolic process)的DEGs 分別為226 個(gè)和194 個(gè)，而注釋到單一生物過(guò)程 (single-organism process)的DEGs 分別為190個(gè)和207 個(gè)(圖4)。此外，Bvs.C 和Evs.F 分別有20、13 個(gè)DEGs 注釋到了免疫系統(tǒng)過(guò)程 (immune system process)GO term。

圖4 差異表達(dá)基因的GO 功能注釋分類(lèi)圖(a) B vs.C;(b) E vs.F 左邊縱坐標(biāo)表示GO 的二級(jí)分類(lèi)，橫坐標(biāo)表示包含在該二級(jí)分類(lèi)中的unigene/transcript 的數(shù)目，右邊三種顏色由上到下分別表示GO 的3 大分支 (即生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能)。Fig.4 Cassification of differentially expressed genes in three GO categories in G. przewalskii The ordinate on the left represents the secondary classification of GO,the abscissa represents the number of unigene/transcript included in the secondary classification,and the three colors on the right represent the three major branches of GO (ie BP,CC,MF) from top to bottom.

(圖4 Fig.4)

2.5 差異表達(dá)基因的 KEGG 通路分析

2 個(gè)區(qū)域的差異表達(dá)基因在KEGG 不同的通路中出現(xiàn)不同程度的富集。Bvs.C 中共富集到307 條通路，其中顯著富集的通路主要集中在癌癥 (pathways in cancer)、PI3K-Akt 信號(hào)通路 (PI3Kakt signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖 (proteoglycans in cancer)、黏著斑 (focal adhesion)、核糖體 (ribosome)、人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)、甲型流感(influenza A)、阿米巴原蟲(chóng)病 (amoebiasis)、癌癥中的MicroRNAs (MicroRNAs in cancer)、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用 (cytokine-cytokine receptor interaction)(圖5-a)。部分基因富集到了吞噬體 (phagosome)、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ABC transporters)、IL-17 信號(hào)通路 (IL-17 signaling pathway)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián) (complement and coagulation cascades)、造血細(xì)胞系 (hematopoietic cell lineage)、精氨酸和脯氨酸代謝 (arginine and proline metabolism)、色氨酸代謝 (tryptophan metabolism)、果糖和甘露糖代謝 (fructose and mannose metabolism)等與滲透、免疫和代謝相關(guān)的信號(hào)通路(表3)。

在產(chǎn)能建設(shè)效益、效果上，青海油田明確“產(chǎn)量?jī)?yōu)先、進(jìn)站優(yōu)先、壓裂優(yōu)先”的產(chǎn)建思路，強(qiáng)調(diào)地面與地下同步規(guī)劃、同步實(shí)施，做到新投一口、進(jìn)站一口。通過(guò)有效銜接鉆井作業(yè)、新投施工、地面配套等環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)投產(chǎn)周期較往年縮短11天，進(jìn)站周期縮短22天，保障新井產(chǎn)量貢獻(xiàn)。在11月中旬冬供峰值來(lái)臨之前，油田天然氣產(chǎn)能建設(shè)已完成工作的78%，日增氣超過(guò)200萬(wàn)立方米。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG classification of putative functions of differentially expressed genes(a) B vs.C;(b) E vs.F.

表3 鰓組織滲透、免疫、代謝相關(guān)信號(hào)通路Tab.3 Osmotic,immune,metabolism related pathway in gill

Evs.F 中共富集到303 條通路，顯著富集的通路主要包括PI3K-Akt 信號(hào)通路 (PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥 (pathways in cancer)、癌癥中的蛋白多糖 (proteoglycans in cancer)、Rap1 信號(hào)通路 (Rap1 signaling pathway)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié) (regulation of actin cytoskeleton)、黏著斑(focal adhesion)、癌癥中的MicroRNAs (MicroRNAs in cancer)、吞噬體 (phagosome)、MAPK 信號(hào)通路 (MAPK signaling pathway)、軸突引導(dǎo) (axon guidance)(圖5-b)。同樣，有部分基因富集到了礦物質(zhì)吸收 (mineral absorption)、近端小管碳酸氫鹽再 生 (proximal tubule bicarbonate reclamation)、cAMP 信號(hào)通路 (cAMP signaling pathway)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移 (leukocyte transendothelial migration)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián) (complement and coagulation cascades)、造血細(xì)胞系 (hematopoietic cell lineage)、精氨酸合成 (arginine biosynthesis)、泛酸和輔酶A生物合成 (pantothenate and CoA biosynthesis)等與滲透、免疫、代謝相關(guān)的信號(hào)通路(表4)。

表4 腎組織滲透、免疫、代謝相關(guān)信號(hào)通路Tab.4 Osmotic,immune,metabolism related pathway in kidney

2.6 鰓組織滲透、免疫、代謝相關(guān)基因篩選

根據(jù)差異表達(dá)基因的GO 注釋和KEGG 信號(hào)通路富集分析，然后使用Cytoscape 軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的可視化分析，通過(guò)計(jì)算節(jié)點(diǎn)權(quán)重以及節(jié)點(diǎn)的連通度，我們篩選到的青海湖裸鯉滲透相關(guān)的基因則主要有絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase)、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道 (transient receptor potential cation channel subfamily)、囊性纖維化跨膜 (cystic fibrosis transmembrane)、氯通道蛋白(chloride channel protein) 等。免疫相關(guān)基因主要包括補(bǔ)體(complement)、整合素 (integrin)、白細(xì)胞介素(interleukin)、顆粒酶B (granzyme B)等。代謝相關(guān)的基因主要有乙醇脫氫酶 (aldehyde dehydrogenase)、1,25-二羥基維生素D(3)24-羥化酶 (1,25-dihydroxyvitamin D(3) 24-hydroxylase)、3-磷酸肌醇合酶 (inositol-3-phosphate synthase)、細(xì)胞色素 P450(cytochrome P450)、果糖二磷酸醛縮酶C (fructosebisphosphate aldolase C)等 (附表1)。

附表1 鰓組織滲透、免疫、代謝相關(guān)基因Tab.S1 Osmotic,immune,metabolism related genes in gill

2.7 腎組織滲透、免疫、代謝相關(guān)基因篩選

篩選得到的青海湖裸鯉腎臟組織滲透相關(guān)蛋白包括溶質(zhì)載體家族 (solute carrier family)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 (calcium/calmodulindependent protein kinase)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道 (transient receptor potential cation channel subfamily)、氯通道蛋白 (chloride channel protein)、鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶 (sodium/potassium-transporting ATPase)等。免疫相關(guān)基因主要有整合素 (integrin)、干擾素誘導(dǎo)蛋白VLIG 蛋白亞家族 (interferon-induced very large GTPase)、顆粒酶B (granzyme B)、白細(xì)胞介素 (interleukin)、補(bǔ)體 (complement)。代謝相關(guān)基因則包括一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase)、1,25-二羥基維生素D(3)24-羥化酶 (1,25-dihydroxyvitamin D(3) 24-hydroxylase)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3)、細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (phosphoenolpyruvate carboxykinase)、磷酸甘油酸變位酶 (phosphoglycerate mutase)等(附表2)。

附表2 腎組織滲透、免疫、代謝相關(guān)基因Tab.S2 Osmotic,immune,metabolism related genes in kidney

2.8 qRT-PCR 結(jié)果

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，從上述2 個(gè)區(qū)域的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果中隨機(jī)挑選16 個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，并將該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較 (圖6)。結(jié)果表明，所挑選的基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致，從而驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 檢測(cè)RNA-Seq 結(jié)果1.溶質(zhì)載體家族 41 成員 1 基因，2.鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 酶亞基 α-1 基因，3.鈣依賴膜結(jié)合蛋白基因，4.酶原顆粒膜蛋白16 基因，5.GTPase IMAP 家族成員 7 基因，6.補(bǔ)體C3 基因，7.NADPH 氧化酶激活劑 1 基因，8.自然殺傷細(xì)胞受體2B4 基因，9.一氧化氮合酶基因，10.核因子7 基因，11.TNF 受體相關(guān)因子2 基因，12.環(huán)指蛋白 233 基因，13.黏蛋白-17 基因，14.S100 蛋白-A1 基因，15.細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，16.ras 樣蛋白家族成員10B 基因。Fig.6 Detection of RNA-seq by qRT-PCR of differentially expressed genes1.solute carrier family 41 member 1,2.sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1,3.copine-2,4.zymogen granule membrane protein 16,5.GTPase IMAP family member 7,6.complement C3,7.NADPH oxidase activator 1,8.natural killer cell receptor 2B4,9.nitric oxide synthase,10.nuclear factor 7,11.TNF receptor-associated factor 2,12.RING finger protein 223,13.mucin-17,14.protein S100-A1,15.cell cycle control protein 50B,16.ras-like protein family member 10B.

3 討論

水體環(huán)境中鹽堿度含量的變化使得魚(yú)類(lèi)通過(guò)改變自身的生理狀態(tài)以調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓平衡來(lái)維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[12]。魚(yú)類(lèi)滲透壓調(diào)節(jié)變化的過(guò)程中，同時(shí)還伴隨著魚(yú)體免疫功能的變化以及能量的大量消耗[13]。

鰓是魚(yú)類(lèi)主要的呼吸器官，因具有表面積大和與外界水環(huán)境直接接觸的特點(diǎn)而被認(rèn)為在水分運(yùn)輸和離子轉(zhuǎn)運(yùn)中起主要作用[14]，且對(duì)水體環(huán)境的變化高度敏感。此外，鰓組織所分泌的黏液也是魚(yú)體抵抗環(huán)境病原微生物入侵和擴(kuò)散的有力方式。鰓上皮組織中含有大量的上皮組織細(xì)胞，內(nèi)含有豐富的Na+-K+-ATP 酶。魚(yú)類(lèi)能通過(guò)鰓組織上的泌氯細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+、Cl-以及體液滲透平衡。在高滲環(huán)境下魚(yú)類(lèi)還可以通過(guò)腎臟的腎小管重吸收作用，增強(qiáng)對(duì)水和離子的重吸收能力[15]，從而維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，腎臟作為魚(yú)類(lèi)主要的免疫器官，在鹽堿耐受過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要的作用。水環(huán)境中鹽堿度的增加，導(dǎo)致魚(yú)體抗病變能力下降易受到水體中病原微生物的侵入，在此過(guò)程中腎臟上的免疫相關(guān)因子的含量就會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的刺激。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，青海湖裸鯉鹽堿耐受的過(guò)程很復(fù)雜，從KEGG 通路分析來(lái)看，既涉及到癌癥相關(guān)的通路 (pathway in cancer)、又有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，如PI3K-Akt 信號(hào)通路 (PI3KAkt signaling pathway)、還包括蛋白多糖 (proteoglycans in cancer)的變化等，故我們從滲透、免疫和代謝這3 個(gè)方面探討鹽堿耐受過(guò)程中發(fā)生作用的相關(guān)基因。

3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

本研究通過(guò)無(wú)參轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)，比較分析了鹽堿水環(huán)境和淡水環(huán)境下青海湖裸鯉鰓、腎臟2 個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組以及差異基因的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析表明，所構(gòu)建的12 個(gè)cDNA 文庫(kù)中，各樣品clean data 均達(dá)到 6.74 Gb 以上，且Q30 堿基百分比在94.38%以上。使用Trinity 對(duì)所有樣本clean data 進(jìn)行從頭組裝，共得到541 429個(gè)unigene，其中共有107 568 個(gè)unigenes 得到了注釋，注釋率為19.87%。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果注釋率不高，這可能是由于目前的幾大公共數(shù)據(jù)庫(kù)中所記錄到的與青海湖裸鯉相近的物種基因注釋信息較少的原因。NR 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋的結(jié)果顯示，有97 816 個(gè)unigenes 注釋到了NR 庫(kù)，注釋率為18.07%，其中與鯉 (21.42%)的同源性比對(duì)最高，其次為犀角金線鲃 (17.01%)、安水金線鲃(14.32%) 和滇池金線鲃 (13.26%)，這可能是因?yàn)榍嗪：沲幣c鯉、金線鲃屬魚(yú)類(lèi)同為鯉科魚(yú)類(lèi)，也反映了青海湖裸鯉與金線鲃屬魚(yú)類(lèi)具有很近的親緣關(guān)系[3-4]。

3.2 滲透相關(guān)基因的篩選及分析

由于魚(yú)類(lèi)生活在水體中，故其在整個(gè)生命過(guò)程中常常會(huì)面臨水環(huán)境滲透壓的改變。維持體液平衡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到了各種滲透調(diào)節(jié)器官，主要包括鰓、消化道、腎臟等[16]。在海水適應(yīng) (魚(yú)類(lèi)生活環(huán)境從淡水向海水過(guò)渡)和淡水適應(yīng) (魚(yú)類(lèi)生活環(huán)境從海水向淡水過(guò)渡) 過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)分別通過(guò)吞飲海水、減少尿量、排出離子和停止飲水，增加尿量，降低鰓上皮氯化鈉排出，從水環(huán)境中吸收Na+和Cl-等方式來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓[17-19]。本研究中腎臟組織中篩選得到的滲透相關(guān)基因種類(lèi)多于鰓組織，表明青海湖裸鯉腎組織在滲透脅迫中也發(fā)揮了重要作用。許多細(xì)胞的細(xì)胞膜表明都分布有Na+-K+-ATP 酶 (Na+-K+-ATPase,NKA)，這是離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+、Cl-以及體液滲透平衡的功能。Na+-K+-ATPase 可以通過(guò)水解產(chǎn)生能量進(jìn)行Na+、K+之間的互換，同時(shí)也為其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)供能，以此來(lái)維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定，并為細(xì)胞運(yùn)輸提供能量[12,20]。已有大量研究表明，魚(yú)類(lèi)NKA 對(duì)外界環(huán)境滲透壓的變化會(huì)隨著其生態(tài)位的改變而有所改變。在對(duì)莫桑比克羅非魚(yú)(O.mossambicus)[21]、青鳉[22]、尼羅羅非魚(yú)[23]等的研究中均發(fā)現(xiàn)，處于高滲環(huán)境下的NKA 活性增加，而低滲環(huán)境下的NKA 的活性則最低。本研究中篩選所得的NKA 的表達(dá)同樣也符合這一規(guī)律，腎臟中篩選出的NKA 其表達(dá)量同樣為鹽堿脅迫環(huán)境高于淡水環(huán)境。而本研究未在鰓組織中篩選出NKA，這可能是由于鹽堿脅迫下青海湖裸鯉免疫能力的下降從而使得鰓組織NKA表達(dá)量過(guò)低而未被篩選到，也可能是NKA 在鰓和腎組織中發(fā)揮的作用并不相同，需要進(jìn)一步研究。有研究表明[24]，胞內(nèi)第二信使cAMP 濃度可隨著鹽度的升高而增加，在激活細(xì)胞基底側(cè)Cl-通道的同時(shí)還能激活NKA，從外界吸收Na+，從而實(shí)現(xiàn)水生動(dòng)物的滲透調(diào)節(jié)平衡。我們?cè)? 個(gè)區(qū)域的腎組織中發(fā)現(xiàn)部分DEGs 富集到了cAMP 信號(hào)通路，且差異顯著，提示青海湖裸鯉腎臟也可依賴cAMP來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透平衡。此外，Péqueux 等[25]的研究證明鈣調(diào)蛋白參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)，可激活Cl-通道并對(duì)Na+的吸收產(chǎn)生影響。我們也在2 個(gè)區(qū)域的鰓、腎組織中均篩選到了作為鈣調(diào)蛋白下游靶基因的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶的顯著表達(dá)。

3.3 免疫相關(guān)基因的篩選及分析

鹽堿度是影響水生生物生命活動(dòng)最主要的外界因素之一，在改變魚(yú)體內(nèi)環(huán)境滲透壓穩(wěn)態(tài)的同時(shí)還伴隨著魚(yú)體免疫功能的變化[13]。腎臟不僅具有泌尿和滲透調(diào)節(jié)的作用，作為硬骨魚(yú)主要的免疫器官，在鹽堿耐受過(guò)程中發(fā)揮著重要的免疫防御作用。隨著水環(huán)境中鹽堿度的增加，魚(yú)體抗病變能力下降，導(dǎo)致易受到水體中病原微生物的侵入，在此過(guò)程中腎臟上的免疫相關(guān)因子的含量就會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的刺激。

由于青海湖具有鹽堿度含量高、高海拔、紫外線輻射強(qiáng)、貧營(yíng)養(yǎng)等極端的水文環(huán)境特點(diǎn)，使得生活在其中的青海湖裸鯉在生長(zhǎng)較其他魚(yú)類(lèi)相比較為緩慢[26]，并較其他魚(yú)表現(xiàn)出極強(qiáng)的鹽堿適應(yīng)性和耐受性，且高鹽堿環(huán)境脅迫下會(huì)導(dǎo)致青海湖裸鯉的免疫能力下降。本研究結(jié)果顯示，免疫相關(guān)基因如白細(xì)胞介素、補(bǔ)體、免疫球蛋白、干擾素誘導(dǎo)蛋白、顆粒酶B 等的顯著差異表達(dá)，說(shuō)明青海湖裸鯉通過(guò)表達(dá)這些基因以減緩鹽堿環(huán)境脅迫所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)，且大部分免疫相關(guān)基因都顯著下調(diào)。這與郭雯翡等[27]的研究結(jié)果相符，其通過(guò)構(gòu)建青海湖裸鯉在高鹽堿環(huán)境下的抑制消減cDNA 文庫(kù)，在轉(zhuǎn)錄水平上研究了基因表達(dá)差異，且發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。Tong 等[28]在提取青海湖裸鯉腎臟和鰓組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)了大量免疫相關(guān)候選基因 (如Tolllike 樣受體、干擾素調(diào)節(jié)因子白細(xì)胞介素以及腫瘤壞死因子)。同樣，我們也在免疫相關(guān)基因中篩選獲得了白細(xì)胞介素的顯著差異表達(dá)，其他免疫相關(guān)基因未在本研究中篩選獲得。但在本研究中，我們篩選到整合素家族相關(guān)基因在鰓、腎臟組織中均顯著差異表達(dá)，表明除白細(xì)胞介素外，該基因也是青海湖裸鯉免疫防御系統(tǒng)中的重要組成因子。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，青海湖水域中大部分免疫相關(guān)基因的下調(diào)可能是由于青海湖水域的青海湖裸鯉所面對(duì)的微生物種類(lèi)較淡水少，故使得其免疫應(yīng)激能力較淡水下調(diào)。

補(bǔ)體作為一種存在于脊椎動(dòng)物血清和組織液中的血清蛋白質(zhì)，可在機(jī)體被病原體侵染時(shí)激活，通過(guò)吞噬或裂解病原微生物來(lái)介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。已有對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)涉及了炎癥的發(fā)病機(jī)制[29]。本研究中，鰓組織和腎臟中顯著富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián) (complement and coagulation cascades)信號(hào)通路的DEGs 也主要為補(bǔ)體 (complement)和補(bǔ)體成分(complement component)。腎臟組織中補(bǔ)體基因的表達(dá)顯著上調(diào)表明了在免疫防御和清除病原體功能方面，補(bǔ)體發(fā)揮了十分重要的作用，這與Encinas 等[30]在對(duì)斑馬魚(yú)不同組織器官進(jìn)行VHSV 病毒感染后發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致。C3作為補(bǔ)體系統(tǒng)激活通路的中間樞紐，可通過(guò)激活末端補(bǔ)體通路來(lái)發(fā)揮清除病原體功能，其主要在肝臟中表達(dá)。且有研究表明魚(yú)類(lèi)C3 表達(dá)具有組織差異性，如虹鱒 肝臟中C3 表達(dá)量最高，肝外組織表達(dá)量則較低[31]。在對(duì)牙鲆 (Paralichthys olivaceus)進(jìn)行鰻弧菌感染前后的脾臟轉(zhuǎn)錄組研究中未檢測(cè)到C3 在脾臟中表達(dá)[32]。在對(duì)日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)進(jìn)行氨氮脅迫后的轉(zhuǎn)錄組分析中也發(fā)現(xiàn)肝胰腺、鰓和心臟組織中C3 基因的表達(dá)量相對(duì)肌肉和血液組織表達(dá)量高[33]，本研究也僅在鰓組織中篩選獲得C3 基因顯著表達(dá)。此外，鰓組織中補(bǔ)體基因的下調(diào)也表明不同組織在補(bǔ)體防御和清除病原體方面可能具有不同的響應(yīng)機(jī)制。并且本研究2 個(gè)區(qū)域的青海湖裸鯉鰓組織中篩選獲得的免疫相關(guān)基因的數(shù)量多于腎臟，推測(cè)在裸鯉鹽堿耐受過(guò)程的免疫防御能力方面，鰓組織的免疫調(diào)節(jié)能力可能更強(qiáng)。

3.4 代謝相關(guān)基因的篩選及分析

外界水環(huán)境的變化通常會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)能量的大量消耗，不同滲透壓環(huán)境下的魚(yú)類(lèi)為適應(yīng)滲透壓會(huì)通過(guò)改變自身的生理變化來(lái)調(diào)整機(jī)體的滲透壓平衡，使其能夠產(chǎn)生足夠的耗氧量以維持自身正常生命活動(dòng)[34-35]。本研究中，青海湖裸鯉在從淡水組到河口組時(shí)生態(tài)位發(fā)生了一定的改變，導(dǎo)致其可能選擇不同的代謝策略以適應(yīng)環(huán)境中鹽堿度的增加。

Su 等[36]在對(duì)3 種脅迫下雜交羅非魚(yú)的鰓轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下富集到的通路主要為生物合成和代謝相關(guān)，同樣本研究中篩選得到的代謝相關(guān)信號(hào)通路也主要與生物合成和代謝相關(guān)，主要集中在氨基酸代謝相關(guān)通路。Jiang 等[37]研究也證實(shí)了氨基酸代謝在滲透調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。精氨酸是一種在有機(jī)體內(nèi)具有重要生理、代謝調(diào)控功能的半必須氨基酸，同時(shí)其作為內(nèi)源性一氧化氮合成的唯一前體，可在一氧化氮合成酶的作用下生成一氧化氮，生成的一氧化氮進(jìn)而可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)能底物的代謝過(guò)程[38]。精氨酸激酶可催化生成ADP 和磷酸精氨酸，為細(xì)胞提供能量需求，同時(shí)生成的精氨酸則作為一氧化氮合成酶催化生成一氧化氮的唯一反應(yīng)底物，結(jié)合生成一氧化氮從而其能夠發(fā)揮生理功能。本研究中，青海湖水域組和淡水組鰓組織在精氨酸和脯氨酸代謝途徑中表達(dá)上調(diào)的重要基因?yàn)橐谎趸铣擅富颍? 個(gè)區(qū)域的腎臟組織中該基因則顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明在不同組織中一氧化氮合成酶可能是通過(guò)不同的調(diào)節(jié)方式參與機(jī)體的能量代謝過(guò)程。細(xì)胞色素P450 (cytochromeP450,CYP450)可參與生物活性分子如類(lèi)固醇、維生素和脂肪酸的代謝。維生素D 的生理功能主要通過(guò)活性形式的1,25-(OH)D3來(lái)實(shí)現(xiàn)的[39]。細(xì)胞色素P450 將與維生素D3結(jié)合蛋白結(jié)合后的維生素D3 羥化為2,5-(OH)D3，轉(zhuǎn)運(yùn)到腎臟后生成具有活性的1,25-(OH)D3。而腎臟分泌的1,25-二羥基維生素 D(3) 24-羥化酶可以在2,5-(OH)D3或1,25-(OH)D3濃度過(guò)高時(shí)通過(guò)與之相互作用來(lái)抑制其表達(dá)，在實(shí)現(xiàn)體內(nèi)維生素D 含量的動(dòng)態(tài)平衡的同時(shí)發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝以及部分免疫調(diào)節(jié)功能[40]。我們?cè)诓煌瑓^(qū)域的鰓、腎臟組織中均篩選得到了1,25-二羥基維生素 D(3)24-羥化酶和細(xì)胞色素P450 基因的顯著表達(dá)，表明鹽堿耐受過(guò)程中青海湖裸鯉可通過(guò)細(xì)胞色素P450 和1,25-二羥基維生素 D(3) 24-羥化酶的上調(diào)來(lái)穩(wěn)定體內(nèi)的鈣磷代謝過(guò)程。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）