職韶陽，楊麗萍，秦超彬，閆 瀟，張文蕾，劉茗宇，趙夢娟，聶國興

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，1989 年至今中國的水產(chǎn)品產(chǎn)量一直居于世界首位[1-2]。蛋白質(zhì)成本是水產(chǎn)飼料成本的重要組成部分，有研究表明，在飼料中添加適宜水平的糖類可以達到節(jié)約蛋白質(zhì)，降低養(yǎng)殖成本的作用[3]。但是魚類對糖類的利用能力較弱，魚類天生具有糖不耐受性，攝糖過多會導(dǎo)致持續(xù)的高血糖狀態(tài)，屬于典型的糖尿病體質(zhì)[4-5]，因此，魚類如何維持機體葡萄糖代謝平衡一直是一個值得重視的問題[6]。內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在維持機體糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[7]。在人類中，激素不僅可以直接調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、儲存和釋放，也能通過對其他葡萄糖調(diào)節(jié)的重要激素如胰島素和胰高血糖素進行間接調(diào)節(jié)，從而達到維持機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的目的[8]。2012 年鳶尾素(irisin)被鑒定為肌肉因子，并被證明具有調(diào)節(jié)糖代謝的功能，運動后產(chǎn)生的PGC-1α 介導(dǎo)肌肉組織產(chǎn)生FNDC5，酶切后產(chǎn)生irisin[9]。隨著深入研究，哺乳動物中irisin 在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)和促進產(chǎn)熱等方面的生理功能逐漸明晰[10]。研究表明，irisin 可以在人體中誘導(dǎo)成熟脂肪細胞GLUT4 的表達，提高葡萄糖攝取量[11]；在離體環(huán)境下，使用重組irisin (50 nmol/L)處理原代人骨骼肌細胞1 h能顯著增加對葡萄糖和脂肪酸的攝取，具有增強糖酵解，抑制糖異生的作用，同時抑制糖原分解相關(guān)基因的表達[12]。

在魚類中，irisin 與糖代謝的相關(guān)報道較少。2021 年，鯉(Cyprinus carpio) irisin 作為一種糖代謝調(diào)節(jié)因子被克隆、表征，并展開初步的糖代謝功能研究[13]。2022 年，闡明irisin 能夠通過AMPK 和PI3K/Akt 信號通路調(diào)控鯉肝糖代謝[14]。相關(guān)研究大多從轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，研究不夠深入全面，無法對魚體內(nèi)irisin 含量進行定量檢測，極大地制約了irisin 對鯉糖代謝調(diào)節(jié)的深入研究。在哺乳動物中，除了肌肉組織和心肌之外，在大腦和皮膚、肝臟等處均檢測到irisin[15-16]。研究報道哺乳動物irisin 的循環(huán)水平并不相同，甚至有顯著差異。目前已有的檢測閾值在人(Homo sapiens)血清或血漿中的濃度跨度很大，為0.01～2 000.00 ng/mL[17-19]。FNDC5 是由一個N 端的信號肽、一個纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域、一個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域以及錨定在膜上的C 末端結(jié)構(gòu)域組成[9]，實驗所檢測到的irisin 可能是全長的FNDC5或是其他的可以發(fā)生某些非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)[20]，血清irisin 的準(zhǔn)確檢測方法亟需建立和規(guī)范[21-23]。血清irisin 含量無法準(zhǔn)確測定，同樣制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物糖代謝的深入研究。

因此，本研究擬使用原核重組鯉irisinA 和irisinB，免疫NIH 陰性小鼠(Mus musculus)，獲得鯉irisinA 和irisinB 多克隆抗體。分別驗證其特異性后，檢測抗體效價，并以此抗體使用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)法檢測經(jīng)過口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)或siRNA 干擾后鯉血清中irisinA 和irisinB 的含量變化，免疫熒光檢測irisin 相對分布以及葡萄糖耐量后腦、心臟、肝胰臟、腸道蛋白質(zhì)水平irisin 的表達變化，檢測鯉肌細胞分化前后irisin 含量，為深入研究水產(chǎn)養(yǎng)殖動物糖代謝提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株、載體及實驗對象 DH5α/BL21(DE3)/Rosetta (北京索萊寶科技有限公司)；pET21a載體為本實驗室保存；實驗對象為健康鯉，體長(12.0±1.0) cm，體重(37.00±1.25) g，購自河南省延津水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，將鯉馴化2 周后，轉(zhuǎn)移至300 L 塑料罐的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，光/暗為12/12。在8:30、13:30 和18:30 飽食投喂商品飼料(河南通威飼料有限公司)。水質(zhì)指標(biāo)和養(yǎng)殖環(huán)境：DO (5.8～6.2)，溫度(27 °C)、pH (7.2～7.4)和氨基氮(<0.02 mg/L)；NIH 陰性實驗鼠購自華蘭生物工程股份有限公司。實驗過程中操作人員嚴格遵守實驗動物飼養(yǎng)管理使用指南和倫理規(guī)范，并按照河南師范大學(xué)實驗動物倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

實驗試劑 TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit (with DNA eraser)、高保真酶Prime STAR?HS DNA Polymerase、pMD19-T vector (TaKaRa，日本)；膠回收試劑盒Quick Gel Extraction Kit (江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)；2×PCR mix (Abcam，英國)；質(zhì)粒提取試劑盒Omega EZNA plasmid mini kit I (Omega，美國)；氨芐青霉素鈉，丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺29∶1 以及ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PVDF 膜(Millipore，美國)；熒光二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA 的提取參考文獻[14]，以1 mL TRIzol溶液浸沒組織，勻質(zhì)研磨儀50 Hz 頻率低溫振蕩至組織破碎；12 000×g，4 °C 離心5 min，吸取800 μL 上 清液，加 入200 μL TRIzol補齊后，以5∶1 (體積比)比例加入氯仿，劇烈振蕩后，靜置10 min，12 000×g，4 °C 離心15 min；吸取上清液，以1∶1 (體積比)比例加入異丙醇，輕柔混勻后，靜置10 min，12 000×g，4 °C 離心10 min；棄去上清液，干燥后以DEPC 水溶解RNA，Nanodrop 2 000 (Thermo，美國)評估RNA 質(zhì)量及濃度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA 完整度。按照去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.3 鯉irisinA、irisinB 基因擴增、載體構(gòu)建、原核表達及表達條件的優(yōu)化

鯉irisinA、irisinB 基因擴增、載體構(gòu)建鯉irisinA、irisinB 基因的開放閱讀框(ORF)區(qū)的擴增、載體構(gòu)建參考文獻[13]，即根據(jù)irisinA 和irisinB 的ORF 區(qū)設(shè)計相應(yīng)序列，使用Primer Premier 5.0 軟件對序列進行分析，添加保護堿基、6×HIS 標(biāo)簽以及特異性酶切位點，使用高保真酶對ORF 區(qū)進行擴增，擴增程序參考文獻[13]。使用膠回收試劑盒回收目的DNA 片段，與pMD19-T 16 °C 過夜連接；通過熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細胞DH5α 中，將混合液均勻涂布至含氨芐的LB 固體培養(yǎng)板上，37 °C 過夜培養(yǎng)；隨后挑取陽性克隆進行PCR 驗證，對擴增大小正確的陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序驗證。

測序后，使用ClustalW2 軟件對irisinA、irisinB質(zhì)粒進行氨基酸序列比對并檢測其相似度。將目的基因和pET21a 載體分別使用NotI-HF 和EcoR IHF (NEB，美國)進行雙酶切，37 °C 酶切8 h。1.0%瓊脂糖凝膠中純化質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，使用T4連接酶分別構(gòu)建pET21a-irisinA、pET21airisinB 表達載體，使用BL21 (DE3)以及Rosetta作為表達菌株，引物序列及相關(guān)信息如表1 所示。

表1 引物序列信息Tab.1 Information of primer sequences

重組irisin 蛋白的原核表達及表達條件的優(yōu)化 使用熱激法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)和Rosetta 中，過夜培養(yǎng)，從LB 固體培養(yǎng)板上挑取陽性單克隆接種至LB 液體培養(yǎng)基中，37 °C，200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6；收集1 mL 菌液離心(10 000×g，2 min，4 °C)，加入IPTG (1 mmol/L)誘導(dǎo)蛋白表達，37 °C，200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，分別取1 mL BL21 表達菌液和Rosetta 表達菌液，選擇表達量最高的表達載體，用于后續(xù)蛋白表達實驗。

重組irisin 蛋白可溶性分析 菌液經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后4 h，離心(10 000×g，2 min，4 °C)，按溶解緩沖液∶LB 液體培養(yǎng)基=1∶10 (體積比)的比例加入1 mol/L 尿素溶解緩沖液(1 mol/L 尿素，5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)溶解，在低溫下對溶液進行超聲破碎(功率600 W，超聲開3 s，關(guān)3 s，30 min)。破碎后離心(4 °C，6 500×g，15 min)，離心后含有可溶性蛋白和少量包涵體蛋白溶于上清液，沉淀均為包涵體蛋白。超速離心上清液(4 °C，12 000×g，15 min)，收集上清液進行蛋白純化，記作“上清液”。包涵體蛋白以6 mol/L 尿素溶解緩沖液(6 mol/L 尿 素、5 mol/L NaCl，81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)溶解，磁力攪拌10 min，離心(4 °C，12 000×g，15 min)，收集上清液進行蛋白純化，記作“包涵體”，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

重組irisin 蛋白的純化 純化前，用0.45 μm的過濾器過濾所有溶液。調(diào)節(jié)液體流速為1 mL/min，樣品收集后冰上保存。簡要步驟：ddH2O (5 mL)沖洗鎳柱；1 mol/L 溶解緩沖液(10 mL)平衡鎳柱；收集樣品(1 mL)，記作“未過柱液”；上樣，收集1 mL 液體，記作“過柱液”；1 mol/L 沖洗緩沖液(1 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4) (10 mL)洗滌鎳柱，收集1 mL 液體，記作“沖洗液”；7 mL 1 mol/L 洗脫緩沖液(5 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)洗脫蛋白，收集6 mL 液體，記作“洗脫液”；ddH2O (10 mL)洗滌鎳柱；20%乙醇封閉鎳柱，石蠟?zāi)っ芊猓? °C 保存鎳柱。SDS-PAGE 分析收集的蛋白溶液。

重組irisin 蛋白的透析及超濾 按照說明書對透析袋(北京索萊寶科技有限公司)進行清洗與激活，使用透析袋將蛋白溶液轉(zhuǎn)移至1 L 含有0.5 mol/L 尿素的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，4 °C磁力攪拌12 h；將透析袋轉(zhuǎn)移至1 L 不含尿素的PBS 中，4 °C 磁力攪拌12 h，以去除重組蛋白溶液中的咪唑及尿素。向超濾離心管(Thermo，美國)中加入10 mL 超純水，離心(5 000×g，4 °C，10 min)，清洗并激活超濾離心管；將透析后的樣品加入超濾離心管中，離心(5 000×g，4 °C，2 h)，充分吹打懸浮，重復(fù)離心直至上層液體剩余約1 mL；取100 μL 超濾液進行SDS-PAGE 電泳驗證，其余溶液置于-80 °C 保存。

1.4 多克隆抗體的制備

免疫動物 按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進行蛋白濃度測定，加入PBS 將蛋白濃度調(diào)至150 μg/mL。以1∶1(體積比)比例混勻蛋白溶液與弗氏佐劑 (Sigma，美國)，達到“油包水”的乳化狀態(tài)，采用皮下多點注射(4～6 個點)的方法免疫NIH 陰性鼠。每10 天免疫1 次，共5 次免疫(注意弗氏完全佐劑用于初次免疫，加強免疫則使用弗氏不完全佐劑)。

血清的收集以及抗體效價的檢測 間接ELISA 法用于抗體效價檢測，以10 μg/mL蛋白溶液用于包被酶標(biāo)板，0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液為空白對照，4 °C 過夜包被；使用10%脫脂奶粉37 °C封閉2 h，隨后加入不同稀釋度的抗血清(1∶1.0×102、1∶1.0×103、1∶1.0×104、1∶3.0×104、1∶9.0×104、1∶2.7×105、1∶8.1×105、1∶2.4×106)及陰性對照血清(未免疫鼠血清)，37 °C 孵育2 h，HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗37 °C 孵育1 h，TMB 顯色30 min，加入硫酸溶液后測定A450nm值?？贵w效價以處理組/陰性對照的光吸收比值≥2 為標(biāo)準(zhǔn)，最大稀釋倍數(shù)即為抗血清效價。血液采集后室溫靜置4 h，離心(6 000×g，4 °C，10 min)收集上清液。

1.5 鯉irisinA、irisinB 抗體交叉反應(yīng)驗證

為驗證irisinA 和irisinB 抗體的特異性和有效性，進行抗體交叉驗證實驗。分別使用irisinA 和irisinB 抗體(體積比1∶400)同時孵育不同濃度(1 000/500 ng)的重組鯉irisinA 或irisinB 蛋白，Western blot 法檢測抗體特異性。

1.6 葡萄糖耐量實驗

選取144 尾鯉，隨機分為兩組(生理鹽水/葡萄糖灌喂組)。以1.67 g/kg 體重 (BW)灌喂生理鹽水或葡萄糖。灌喂后0、1、2、3、5 和10 h，尾靜脈采血，靜置4 h 后離心收集血清。

1.7 siRNA 干擾實驗

選取60 尾鯉隨機分為對照組(PBS)、無義siRNA (Scramble)組、siRNA-irisinA 組、siRNAirisinB 組、siRNA-irisinA/irisinB 組，每組12 尾魚。腦室注射(i.c.v)方法參考文獻[14]，禁食24 h后，以PBS 配制Scramble 和siRNA；siRNA-irisinA 組、siRNA-irisinB 組以及siRNA-irisinA/irisinB 組分別注射siRNA-irisin 溶液(10 ng/g BW)，對照組和無義siRNA 組分別注射同等體積的Scramble 溶液和PBS 溶液。注射24 h 后尾靜脈取血，靜置4 h 后離心收集血清。

1.8 鯉肌細胞的誘導(dǎo)分化

使用含20% 胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 培養(yǎng)基傳代第40 代鯉肌細胞至12 孔板，每孔細胞數(shù)為15 萬，28 °C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。待其匯合后，吸出培養(yǎng)基，PBS 浸洗，記為“未分化”(n=6)。另一組更換培養(yǎng)基為含有2%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，待其形態(tài)發(fā)生變化后，吸出培養(yǎng)基，PBS 浸洗，記為“分化”(n=6)。爬片以4%多聚甲醛固定15 min，進行細胞免疫熒光實驗。

使用含20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基傳代第40 代肌細胞至12 孔板，每孔細胞數(shù)為15 萬，待其匯合后，對照組培養(yǎng)基仍使用20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分化組更換培養(yǎng)基為含有2%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，分別誘導(dǎo)2 和3 d。誘導(dǎo)后，吸出培養(yǎng)基，使用500 μL TRIzol 收集細胞，按照文獻的方法提取RNA 并鑒定其完整性[14]，使用去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取第一鏈cDNA，熒光定量PCR (qPCR)程序如前所述[13]，并采用2-ΔΔCt法分析基因表達[24]。18SrRNA作為內(nèi)參基因，實驗重復(fù)2 次，以保證其準(zhǔn)確性。

1.9 鯉血清中irisinA、irisinB 含量的測定

ELISA 法檢測血清中irisinA 和irisinB 的含量，將血清與2×包被液以1∶1 (體積比)稀釋后包被酶標(biāo)板，4 °C 過夜。一抗以1∶2 000 (體積比)稀釋并加入至酶標(biāo)板，其他處理完全同“多克隆抗體的制備”部分。

1.10 多克隆抗體的免疫熒光檢測

組織樣品包埋與石蠟切片制作 簡要步驟為：4%多聚甲醛固定組織，乙醇梯度脫水，制片觀察。具體操作：將樣品分別置于70%、80%、90%和無水乙醇中浸泡脫水30 min；以1∶1 的比例配制無水乙醇∶二甲苯混合液，浸泡樣品20 min 至組織透明；將樣品浸泡于盛有石蠟溶液的68 °C 溫浴盒中2 h；將組織置于包埋盒中，浸蠟?zāi)毯? °C 保存；將蠟塊裁切成四方體，切片機固定切片，將蠟片置于40 °C 蒸餾水中展片，觀察形態(tài)后使其貼附于載玻片上，40 °C 烘片3 h，4 °C 保存。

組織固定 取常規(guī)飼養(yǎng)及葡萄糖耐量前后鯉腦、心臟、肝胰臟和腸道組織，經(jīng)包埋與切片制作后進行免疫熒光檢測。將載玻片依次置于二甲苯(15 min×2)、無水乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)中脫蠟和水化；轉(zhuǎn)移載玻片至PBS 中洗滌15 min (5 min×3)。

細胞固定及透化 4%多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗細胞15 min (5 min×3)，將細胞爬片轉(zhuǎn)移至0.5%的TritonX-100 (北京索萊寶科技有限公司)中透化。

免疫熒光 轉(zhuǎn)移載玻片至3% H2O2，避光孵育20 min；PBS 浸洗細胞15 min (5 min×3)。以1∶200 (體積比)比例稀釋山羊血清，孵育組織15 min；重復(fù)洗滌步驟。以1∶400 (體積比)比例稀釋irisin 多克隆抗體，4 °C 過夜孵育；重復(fù)洗滌步驟。以1∶800 (體積比)比例稀釋熒光二抗，室溫避光孵育1 h，重復(fù)洗滌步驟。滴加DAPI，室溫避光孵育15 min，重復(fù)洗滌步驟。使用抗熒光猝滅劑封片，固定完成后觀察組織。

1.11 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的形式表示，SPSS 18.0 軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，對于兩組間數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗分析其是否具有顯著差異，單向ANOVA 中LSD 指標(biāo)檢測多組間數(shù)據(jù)分析，概率小于0.05 (P<0.05)被認為具有顯著差異。免疫熒光組織觀察后，使用Image J 對熒光強度進行定量，統(tǒng)計后將熒光數(shù)值轉(zhuǎn)換為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)。

2 結(jié)果

2.1 irisinA、irisinB 基因擴增與原核表達載體的構(gòu)建

按照先前的方法[13]，分別從下丘腦和白肌的cDNA 中克隆獲得FNDC5a 722 bp 和FNDC5b 714 bp (圖1-a，b)。以其為模板，使用irisinA 和irisinB特異性引物分別進行擴增，獲得長度為336 bp 的irisinA 和irisinB ORF 區(qū)(圖1-c，d)，均編 碼112個氨基酸，預(yù)測蛋白大小約為 14.90 和14.94 ku，等電點分別為4.62 和4.46。

圖1 鯉irisin PCR 克隆產(chǎn)物的電泳分析(a) fndc5a PCR 產(chǎn)物，(b) fndc5b PCR 產(chǎn)物，(c) irisinA PCR 產(chǎn)物，(d) irisinB PCR 產(chǎn)物；1～4，相應(yīng)PCR 產(chǎn)物；M1.100 bp DNA ladder；M2.DL2000 DNA marker。Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR product of irisin(a) the PCR product of fndc5a;(b) the PCR product of fndc5b;(c) the PCR product of irisinA;(d) the PCR product of irisinB;1-4,corresponding PCR products;M1.100 bp DNA ladder;M2.DL2000 DNA marker.

將克隆獲得的irisinA 和irisinB 片段與pET21a進行連接，獲得pET21a-irisinA (354 bp)和pET21airisinB (354 bp)克隆載體，雙酶切處理后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，泳道1 和泳道2 分別為質(zhì)粒與酶切產(chǎn)物。結(jié)果顯示，目的片段irisinA 和irisinB與表達載體pET21a 成功連接(圖2-a，b)。

圖2 重組表達質(zhì)粒的雙酶切驗證(a) irisinA，(b) irisinB；1.重組質(zhì)粒，2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M1.500 bp ladder，M2.DL2000 marker。Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant expression plasmid(a) irisinA,(b) irisinB;1.recombinant plasmid,2.double digestion of recombinant plasmid;M1.500 bp ladder,M2.DL2000 marker.

2.2 大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備重組irisinA、irisinB

在先前的研究中[13]，使用BL21 對鯉irisin 進行表達，但其獲得的蛋白量小、效率低，因此本研究選用Rosetta 表達株，以優(yōu)化蛋白表達條件。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達后，泳道7/8 的Rosetta 表達株對irisinA 和irisinB 的蛋白表達量高于泳道5/6的BL21 表達株，且兩種表達株表達的irisinA 和irisinB 蛋白大小一致，均約為14.9 ku (圖3)，說明重組蛋白能夠在BL21 和Rosetta 中表達，在后續(xù)的研究中直接使用irisin-pET21a 和Rosetta 作為質(zhì)粒和表達株進行蛋白表達實驗。

圖3 不同表達條件對His-irisin 融合蛋白表達的影響M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未加IPTG 誘導(dǎo)的irisinA-BL21 合成組；2.未加IPTG 誘導(dǎo)的irisinB-BL21 合成組；3.未加IPTG 誘導(dǎo)的irisinA-Rosetta 合成組；4.未加IPTG 誘導(dǎo)的irisinB-Rosetta 合成組；5.IPTG 誘導(dǎo)4 h 的irisinA-BL21 合成組；6.IPTG 誘導(dǎo)4 h 的irisinB-BL21 合成組；7.IPTG 誘導(dǎo)4 h 的irisinA-Rosetta 合成組；8.IPTG 誘導(dǎo)4 h 的irisinB-Rosetta 合成組。Fig.3 His-irisin expression in E. coli under different conditionsM.protein molecular weight marker;1.without IPTG inducement irisinA-BL21 group;2.without IPTG inducement irisinB-BL21 group;3.without IPTG inducement irisinA-Rosetta group;4.without IPTG inducement irisinB-Rosetta group;5.induced by IPTG irisinA-BL21 group;6.induced by IPTG irisinB-BL21 group;7.induced by IPTG irisinA-Rosetta group;8.induced by IPTG irisinB-Rosetta group.

蛋白表達后進行超聲破碎，離心后取上清液蛋白和包涵體蛋白進行SDS-PAGE 檢測。結(jié)果顯示，上清液中重組蛋白irisinA 和irisinB 約為14.9 ku 且高效表達，而包涵體蛋白含量較少(圖4)。

圖4 pET21a-irisin 融合蛋白的表達形式與純化(a)上清液中irisinA 蛋白，(b) 包涵體中irisinA 蛋白，(c) 超濾后的irisinA 蛋白，(d) 上清液中irisinB 蛋白,(e)包涵體中irisinB 蛋白，(f) 超濾后的irisinB 蛋白；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1.未過柱液，2.過柱液，3.沖洗液，4～9.洗脫液。Fig.4 Type and purification of pET21a-irisin protein(a) irisinA in supernatant;(b) irisinA in inclusion body;(c) irisinA after ultrafiltration;(d) irisinB in supernatant;(e) irisinB in inclusion body;(f) irisinB after ultrafiltration;M.protein molecular weight marker,1.non-flow-through,2.flow-through,3.washing buffer,4-9.elution buffer.

大量制備重組irisin 蛋白并經(jīng)過超聲破碎后，SDS-PAGE 檢測蛋白大小及純度。結(jié)果顯示，重組蛋白的純度較好，條帶單一，條帶位于11～17 ku，大小正確(圖4)。

2.3 抗血清效價的檢測

采用ELISA 法檢測血清中多克隆抗體的效價，計算處理組/陰性對照組的光吸收比值。制備的irisinA 和irisinB 的多克隆抗體的效價分別在血清稀釋至9.0×104和2.7×105時，該比值大于2 (表2，表3)。因此，所獲得的irisinA 和irisinB 多克隆抗體的效價分別為9.0×104和2.7×105。

表2 ELISA 法測定多克隆抗體irisinA 效價Tab.2 Detection of irisinA antibody titer by ELISA method

表3 ELISA 法測定多克隆抗體irisinB 效價Tab.3 Detection of irisinB antibody titer by ELISA method

2.4 鯉irisinA、irisinB 抗體交叉反應(yīng)驗證

氨基酸序列比對分析表明，irisinA 與irisinB氨基酸序列相似率為77.68%，同源性較高。Western blot 結(jié)果顯示，irisinA 或irisinB 多克隆抗體分別識別irisinA 或irisinB 蛋白，二者之間不存在交叉反應(yīng)，抗體特異性良好(圖5)。

圖5 多克隆抗體特異性檢測(a) irisinA 與irisinB 氨基酸序列比對；(b) irisinA 多克隆抗體孵育irisinA 和irisinB 重組蛋白；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.1 000 ng irisinA 重組蛋白；2.500 ng irisinA 重組蛋白；3.1 000 ng irisinB 重組蛋白；4.500 ng irisinB 重組蛋白；(c) irisinB 多克隆抗體孵育irisinA 和irisinB 重組蛋白；M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.1 000 ng irisinB 重組蛋白；2.500 ng irisinB 重組蛋白；3.1 000 ng irisinA 重組蛋白；4.500 ng irisinA 重組蛋白。Fig.5 Polyclonal antibody specificity detection(a) irisinA and irisinB amino acid sequence alignment;(b) irisinA polyclonal antibody was used to incubate irisinA and irisinB recombinant proteins;M.protein molecular weight marker;1.1 000 ng irisinA recombinant protein;2.500 ng irisinA recombinant protein;3.1 000 ng irisinB recombinant protein;4.500 ng irisinB recombinant protein;(c) irisinB polyclonal antibody was used to incubate irisinA and irisinB recombinant protein;M.protein marker;1.1 000 ng irisinB recombinant protein;2.500 ng irisinB recombinant protein;3.1 000 ng irisinA recombinant protein;4.500 ng irisinA recombinant protein.

2.5 血清irisinA、irisinB 含量測定

生理鹽水或葡萄糖灌喂后0、1、2、3、5、10 h，采血并檢測血液中irisinA 和irisinB 水平。與對照組相比，葡萄糖灌喂后irisinA 和irisinB 無明顯變化(圖6-a，b)。測定鯉基礎(chǔ)水平irisinA 含量約為1.26 ng/mL，irisinB 的含量約為1.15 ng/mL。

圖6 血清中irisin 含量測定(a) 葡萄糖耐量(OGTT)后不同時間血清irisinA 含量變化；(b) OGTT 后不同時間血清irisinB 含量變化；(c)腦室注射(i.c.v) siRNA 后血清irisinA 含量變化；(d)腦室注射(i.c.v) siRNA 后血清irisinB 含量變化。(c)和(d)中，1.scramble；2.control；3.siRNA-irisinA；4.siRNAirisinA；5.siRNA-irisinA+siRNA-irisinB；不同字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)，下同。Fig.6 Determination of irisin in serum(a) changes in serum irisinA at different time after OGTT;(b) changes in serum irisinB at different time after OGTT;(c) changes in serum irisinA after i.c.v injection of siRNA;(d) changes in serum irisinB after i.c.v injection of siRNA.In (c) and (d),1.scramble;2.control;3.siRNA-irisinA;4.siRNAirisinA;5.siRNA-irisinA+siRNA-irisinB.The significant differences within each treatment group were represented by different letters (P<0.05),the same below.

siRNA 注射實驗結(jié)果顯示，對照組和Scramble 組血清irisinA 和irisinB 含量無顯著差異。注射siRNA-A 和siRNA-A、siRNA-B 共注射均能顯著降低血清irisinA 含量，單獨注射siRNA-B 組與對照組和scramble 注射組對血清irisinA 含量無顯著影響；注射siRNA-B 和siRNA-A、siRNA-B 共注射均能顯著降低血清irisinB 含量，單獨注射siRNA-A 組與對照組和scramble 注射組對血清irisinB 含量無顯著影響(圖6-c，d)。

2.6 使用多克隆抗體進行免疫熒光檢測

組織分布 利用鯉irisin 多克隆抗體對腦、心臟、肝胰臟、腸道組織進行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，irisin 在腦、心臟、肝胰臟、腸道組織中均有表達(圖版Ⅰ)。使用ImageJ 軟件統(tǒng)計分析熒光強度，顯示腦中的irisin 含量最為豐富(圖版Ⅰ-1，5)，腸道(圖版Ⅰ-2，6)和肝胰臟次之(圖版Ⅰ-4，8)，心臟中irisin 含量相對較少(圖7)。

圖版Ⅰ 免疫熒光檢測irisin 在組織中的相對分布1～4.irisinA 相對含量，5～8.irisinB 相對含量；1、5.腦，2、6.腸道，3、7.心臟，4、8.肝胰臟。Plate Ⅰ Relative distribution of irisin in tissues detected by immunofluorescence1-4.the relative content of irisinA,5-8.the relative content of irisinB.1,5.brain,2,6.intestine,3,7.heart,4,8.hepatopancreas.

圖7 irisin 在組織中的相對分布(a) irisinA 在各組織中的相對熒光強度，(b) irisinB 在各組織中的相對熒光強度；1.腦，2.腸道，3.心臟，4.肝胰臟。Fig.7 Relative distribution of irisin in tissues(a) relative fluorescence intensity of irisinA,(b) relative fluorescence intensity of irisinB;1.brain,2.intestine,3.heart,4.hepatopancreas.

葡萄糖耐量 免疫熒光顯示，OGTT 后1 h，腦、肝胰臟、心臟和腸道的irisinA 熒光強度(圖版Ⅱ-4～6，16～18，28～30，40～42)與對照組相比均顯著增加(圖版Ⅱ-1～3，13～15，25～27，37～39)。OGTT 后，腦、肝胰臟、心臟和腸道的irisinB熒光強度(圖版Ⅱ-10～12，22～24，34～36，46～48)與對照組相比顯著增加(圖版Ⅱ-7～9，19～21，31～33，43～45)，且在腦、腸道和肝胰臟中受葡萄糖調(diào)節(jié)更為顯著(圖8-b)。這表明上述組織均可對葡萄糖作出響應(yīng)，可不同程度產(chǎn)生irisinA 和irisinB。

圖8 葡萄糖耐量后irisin 在各組織中的相對變化(a) 葡萄糖耐量后irisinA 在各組織中的相對變化；(b) 葡萄糖耐量后irisinB 在各組織中的相對變化，1.腦，2.腸道，3.心臟，4.肝胰臟。星號表明組間存在顯著差異，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，下同。Fig.8 Relative changes of irisin in various tissues after OGTT(a) relative changes of irisinA in various tissues after OGTT;(b) relative changes of irisinB in various tissues after OGTT,1.brain,2.intestine,3 heart,4.hepatopancreas.Asterisks indicated the significant differences between groups,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,the same below.

鯉肌細胞的誘導(dǎo)分化 在倒置顯微鏡下觀察鯉肌細胞，在使用2%馬血清誘導(dǎo)后，肌細胞形態(tài)變化并發(fā)生聚集(圖版Ⅲ-1～2)。免疫熒光實驗表明，在使用2%的馬血清對鯉第40 代肌細胞進行誘導(dǎo)后，肌細胞中的irisinA 和irisinB 含量與未誘導(dǎo)時相比顯著下降(圖版Ⅲ-3，6，9，12)。

圖版Ⅱ 免疫熒光檢測葡萄糖耐量后irisin 的相對變化1～6 和7～12 分別表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在腦中熒光含量的變化；13～18 和19～24 分別表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在腸道中熒光含量的變化；25～30 和31～36 分別表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在心臟中熒光含量的變化；37～42 和43～48 分別表示OGTT前后，irisinA 和irisinB 在肝胰臟中熒光含量的變化。FITC.異硫氰酸熒光素；DAPI.4'，6-二脒基-2 苯基吲哚；merge.FITC 與DAPI 的合并視野；NS.生理鹽水。Plate Ⅱ Relative changes of irisin after OGTT by immunofluorescenceImmunofluorescence of 1-6 and 7-12 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in brain before and after OGTT;13-18 and 19-24 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in intestine before and after OGTT;25-30 and 31-36 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in the heart before and after OGTT;37-42 and 43-48 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in hepatopancreas before and after OGTT.FITC.fluorescein Isothiocyanate,DAPI.4′,6-diamidino-2-phenylindole,merge.the merging perspective of FITC and DAPI,NS.normal saline.

圖版Ⅲ 免疫熒光檢測鯉肌細胞分化前后irisin 相對變化1.第40 代鯉肌細胞(100×)；2.2%馬血清誘導(dǎo)第40 代鯉肌細胞(100×)；3 和6 分別為2%馬血清誘導(dǎo)前后，第40 代鯉肌細胞irisinA 熒光含量相對變化；9 和12 分別為2%馬血清誘導(dǎo)前后，第40 代鯉肌細胞irisinB 熒光含量相對變化。Plate Ⅲ Relative changes of irisin in differentiation process of C. carpio myocytes1.P40 C. carpio myocytes (100×);2.P40 C. carpio myocytes induced by 2% horse serum (100×);3 and 6.the relative changes of irisinA fluorescence content in P40 common carp myocytes before and after induction with 2% horse serum;9 and 12.the relative changes of irisinB fluorescence content in P40 C. carpio myocytes before and after induction with 2% horse serum.

2.7 肌細胞分化前后FNDC5 的表達變化

使用2%馬血清誘導(dǎo)后，肌細胞中的irisinA和irisinB 含量與未誘導(dǎo)時相比顯著下降(圖9-a，b)FNDC5a 和FNDC5b 的相對表達量與對照組相比顯著下調(diào)(圖9-c，d)。

圖9 2%馬血清誘導(dǎo)前后第40 代鯉肌細胞分化前后FNDC5 mRNA 和irisin 的表達變化(a) irisinA，(b) irisinB；1.對照組，2.2%馬血清誘導(dǎo)組；(c) FNDC5a mRNA；(d) FNDC5b mRNA。紅色圓圈代表未分化組，綠色正方形為分化2 d 組，綠色三角形為分化3 d 組。Fig.9 Relative changes of FNDC5 mRNA and irisin in differentiation process of P40 C. carpio myocytes before and after induction with 2% horse serum(a) irisinA,(b) irisinB;1.control group,2.2% horse serum induction group;(c) FNDC5a mRNA,(d) FNDC5b mRNA.The red circle represents the undifferentiated group,the green square represents the 2-day differentiation group,and the green triangle represents the 3-day differentiation group.

3 討論

Irisin 是一種廣泛分布于全身各組織的肌肉和脂肪因子。在哺乳動物中，irisin 維持糖穩(wěn)態(tài)的生理功能及作用已逐漸明晰，其具有維持葡萄糖調(diào)節(jié)，減輕肝臟的糖代謝壓力，改善葡萄糖攝取以及緩解內(nèi)分泌和代謝紊亂的功能[25-26]；還可以通過活化蛋白激酶(p38 MAPK)，上調(diào)線粒體解偶聯(lián)蛋白(UCP1)來發(fā)揮作用，有著減肥的功效[27]；其在改善心血管內(nèi)皮功能、抗氧化、抗炎[28-30]等方面均有作用。Irisin 的前體基因FNDC5 在2002 年已被發(fā)現(xiàn)[31]。2012 年，Bostr?m 等[32]報道過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1-α 介導(dǎo)肌肉FNDC5 產(chǎn)生irisin，并證明耐力運動導(dǎo)致人類/小鼠體內(nèi)irisin 水平的增加。然而部分研究表明，并非所有運動受試者都能夠檢測到irisin 的顯著變化[22]。Pekkala 等[33]發(fā)現(xiàn)肌肉PGC-1α和FNDC5 mRNA以及循環(huán)鳶尾素含量不會因運動而改變，并且肥胖、空腹葡萄糖/胰島素和FNDC5 mRNA 之間沒有關(guān)系。哺乳動物中的irisin 通常使用EK-067-52(phoenix pharmaceuticals，英 國)、EK-067-29(phoenix pharmaceuticals，英國)、AG-45A-0046 EK-k101 (adipogen，韓國)、CSB-EQ027943HU(cusabio，美國)和SEN576Hu (cloud-clone，美國)等商品化試劑盒檢測[10,23,34]，檢測精度為0.01～2 000.00 ng/mL 不等，造成上述差異的原因可能與特異性抗體的缺失有關(guān)，同時也與irisin 存在糖基化、非糖基化以及二聚體等多種形式有關(guān)，哺乳動物相關(guān)研究仍需開發(fā)能夠檢測不同形式irisin 的單克隆抗體。正因為此，魚類irisin 抗體的制備和檢測方法問題亟待解決。

以往研究通過基因克隆，獲得鯉FNDC5a 和FNDC5b 基因亞型[13]。在本研究中，實驗利用優(yōu)化后的蛋白表達技術(shù)表達重組鯉irisinA 和irisinB，與優(yōu)化前相比，蛋白產(chǎn)量增加1.6 倍。原核表達的重組蛋白可能以包涵體或可溶形式存在，Rosetta-irisinA 和Rosetta-irisinB 均以可溶形式存在于上清液中。由于irisin 在人和小鼠之中100%同源，高于胰島素(85%)和胰高血糖素(90%)[32]，這表明irisin 的功能可能更為保守。在對鯉的研究中，得到的irisinA 和irisinB 的氨基酸同源性較高(77.68%)，如何生產(chǎn)出特異性蛋白以及避免抗體間出現(xiàn)交叉反應(yīng)成為本研究的難點。用獲得的重組蛋白作為抗原免疫NIH 陰性鼠，獲得irisinA和irisinB 的多克隆抗血清，用ELISA 的方法檢測抗血清效價分別達到9.0×104和2.7×105，效價近似于先前制備的鯉營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運載體[35-36]。哺乳動物中使用同類方法制備的irisin 多克隆抗體已用于Western blot 檢測細胞中irisin 蛋白的表達，免疫組織化學(xué) (IHC)、免疫細胞化學(xué)(ICC)和免疫熒光法(IF)檢測irisin 在組織和細胞中的精確定位以及血清、組織中irisin 含量的定量檢測[37-39]?？贵w交叉驗證證明，鯉irisinA 和irisinB 多克隆抗體具有特異性且不存在交叉反應(yīng)，可以用于后續(xù)實驗。

以本實驗制備的多克隆抗體為工具，檢測葡萄糖灌喂后鯉血清irisin 的合成變化。ELISA 檢測結(jié)果顯示，灌喂后irisinA 和irisinB 的合成量呈現(xiàn)不規(guī)律變化，irisin 含量與血糖并未呈現(xiàn)顯著相關(guān)。在基礎(chǔ)血漿水平，irisin 循環(huán)水平與葡萄糖水平呈正相關(guān)；然而，血清irisin 濃度不受OGTT 期間血糖或胰島素增加的影響[40]，這與本實驗結(jié)果一致。也有研究表明，患有多囊卵巢綜合征 (PCOS)的成年女性血清irisin 與葡萄糖水平呈顯著正相關(guān)[41]，經(jīng)二甲雙胍處理的db/db 小鼠血糖與血清irisin 濃度同樣呈正相關(guān)[42]。有研究報道，健康人群、肥胖人群以及二型糖尿病患者的血糖水平與irisin 水平呈顯著負相關(guān)[43-44]。這意味著irisin 與血糖之間的關(guān)系受物種以及機體代謝狀態(tài)的影響。組織分布結(jié)果表明，irisin 在腦中含量最高，其次是肝胰臟、心臟、腸道，與本研究團隊之前在轉(zhuǎn)錄水平的研究結(jié)果一致[13]。葡萄糖耐量1 h 后，腦、肝胰臟、心臟和腸道中的irisinA 和irisinB 含量顯著增加，這可能預(yù)示著irisin 在機體糖代謝中扮演著重要作用。已有大量研究表明，irisin 作為一種促肌源性因子，能夠促進如脂肪細胞、骨細胞、肌細胞等多種細胞的分化和肌肉再生[11,45-46]。在本團隊的研究中，使用2%的馬血清誘導(dǎo)后，F(xiàn)NDC5 的mRNA 表達以及irisin 含量均顯著下調(diào)。有研究表明，對于原代培養(yǎng)的人肌細胞中irisin 的分泌以及FNDC5 mRNA 的表達在肌細胞分化過程中上調(diào)，與本實驗結(jié)果不一致[11]，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因有待進一步研究。

綜上所述，通過本實驗制備了具有較高親和力、特異性和效價的irisinA 和irisinB 的多克隆抗體，并可用于蛋白質(zhì)水平的檢測。該結(jié)果初步探究了不同條件下irisin 蛋白水平的變化，為明晰irisin 在機體糖代謝中的作用，完善魚類糖代謝的內(nèi)分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及深入開展魚類糖代謝相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）