焦 存 楊麗曉 張 艷 王 哲 李亦晗 蘆現(xiàn)杰

(1 山東省聊城市人民醫(yī)院,聊城,252000; 2 山東大學(xué)附屬聊城人民醫(yī)院,聊城,252000; 3 山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南,250355)

卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)是指女性在40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,常伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀。中醫(yī)辨證多與腎虛有關(guān)。左歸丸始于《景岳全書》,是中醫(yī)補(bǔ)腎的經(jīng)典方劑,具有滋陰補(bǔ)腎、填精生髓的功效,近年來(lái)廣泛應(yīng)用于卵巢早衰等生殖疾病的治療[1]。干細(xì)胞具有多向分化的特性,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)作為組織損傷修復(fù)與再生的理想種子細(xì)胞之一,在治療卵巢早衰方面亦得到大量研究[2-3]。左歸丸和hUC-MSCs相結(jié)合為卵巢早衰治療提供了新的思路。研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞歸巢率低等問(wèn)題嚴(yán)重制約其治療效果,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal Cell-derived Factor-1,SDF-1)/C-X-C趨化因子受體4(C-X-C Chomekine Receptor 4,CXCR4)信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)遷移和歸巢中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-5]。左歸丸可能通過(guò)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的體內(nèi)遷移與歸巢從而增強(qiáng)其治療效果[6]。但是,關(guān)于左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移作用及與CXCR4表達(dá)關(guān)系的研究,國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。因此,本研究擬探討左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移的影響及可能的分子機(jī)制,以期為左歸丸聯(lián)合hUC-MSCs治療卵巢早衰提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 hUC-MSCs,采用組織塊法分離培養(yǎng)健康產(chǎn)婦足月分娩胎兒的臍帶樣本,經(jīng)聊城市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2019016)。培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)液(含10% FBS和1%雙抗),條件為37 ℃和5%CO2。

1.1.2 藥物 左歸丸(仲景宛西制藥股份有限公司,批號(hào):181012)。

1.1.3 試劑與儀器 杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基/營(yíng)養(yǎng)混合物F-12(Dulbecco′s modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(貨號(hào):11330032)、青霉素-鏈霉素(貨號(hào):15140122)、TrypLE酶(貨號(hào):12605010),以上均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(ScienCell公司,美國(guó),貨號(hào):0510);普樂(lè)沙福(AMD3100)(MCE公司,美國(guó),貨號(hào):HY-10046);CD34抗體(貨號(hào):348057)、CD45抗體(貨號(hào):555483)、CD73抗體(貨號(hào):561014)、CD90抗體(貨號(hào):555595),以上均購(gòu)自美國(guó)BD公司;PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara公司,日本,貨號(hào):RR036A);SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher公司,美國(guó),貨號(hào):4309155);結(jié)晶紫染色液(貨號(hào):E607309)、一步法動(dòng)物細(xì)胞活性蛋白提取試劑盒(貨號(hào):C500022)、改良BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):C503051)、ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào):D601039),以上均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;CCK-8試劑盒(貨號(hào):C0037)、SDF-1α(貨號(hào):P6537)、QuickBlockTMWestern溶液套裝(貨號(hào):P0239)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號(hào):A0216),以上均購(gòu)自碧云天公司;β-actin抗體(貨號(hào):sc-47778)、CXCR4抗體(貨號(hào):sc-53534)、CXCR4-FITC抗體(貨號(hào):sc-53534 FITC),以上均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司,美國(guó),型號(hào):371);超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司,型號(hào):SW-CJ-1FD);光學(xué)顯微鏡(Nikon公司,日本,型號(hào):TS100-F);離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):5810);流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó),型號(hào):FACS AriaIII);熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó),型號(hào):7500);酶標(biāo)儀(型號(hào):iMark)、電轉(zhuǎn)電泳系統(tǒng)(型號(hào):PowerPac)、凝膠成像分析系統(tǒng)(型號(hào):ChemiDoc),以上均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs分離培養(yǎng) 剔除臍帶動(dòng)靜脈血管,分離出華通氏膠,機(jī)械剪切約3 mm組織塊,覆蓋無(wú)菌玻片,置于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每2～3天換液1次,待細(xì)胞融合度為80%～90%,用TrypLE酶消化5 min,加入完全培養(yǎng)液中止消化,201×g,離心5 min,去除上清液,按1∶3進(jìn)行傳代,記為P1。此后每4～5天按1∶3比例傳代,進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 hUC-MSCs流式鑒定 取第3代對(duì)數(shù)期hUC-MSCs,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。取200 μL細(xì)胞懸液于樣本管,分別加入CD34、CD45、CD73和CD90熒光抗體各2 μL,充分混勻后常溫避光孵育30 min。杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline,DPBS)洗滌2次,201×g,離心5 min,棄上清液,加入500 μL DPBS混勻,細(xì)胞篩過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.3 CCK-8檢測(cè) 取第3～5代對(duì)數(shù)期hUC-MSCs,按2×103/孔細(xì)胞量接種到96孔板,24 h后加入不同培養(yǎng)液各200 μL,分為空白組(不加細(xì)胞)、對(duì)照組和左歸丸組(濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL),培養(yǎng)48 h后棄上清液,每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)液90 μL和CCK-8 10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm的吸光度值。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取第3～5代對(duì)數(shù)期hUC-MSCs,按2×105/孔細(xì)胞量接種于6孔板,48 h后用1 mL槍頭劃痕,DPBS洗滌3次,分別加入不同的無(wú)血清培養(yǎng)液,分為對(duì)照組、左歸丸0.1 mg/mL組、左歸丸0.2 mg/mL組和左歸丸+普樂(lè)沙福組(左歸丸0.2 mg/mL+普樂(lè)沙福10 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞遷移情況。利用Image J軟件分別計(jì)算0 h和24 h的劃痕面積,采用劃痕愈合面積百分比比較各組細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整hUC-MSCs密度為1×105/mL,加100 μL到24孔Transwell上室(孔徑8.0 μm),下室為500 μL含100 ng/mL SDF-1α的正常培養(yǎng)液,分為對(duì)照組、左歸丸0.1 mg/mL組、左歸丸0.2 mg/mL組和左歸丸+普樂(lè)沙福組(左歸丸0.2 mg/mL+普樂(lè)沙福10 μmol/L),培養(yǎng)1天后取出小室,用棉簽輕輕擦去膜上層細(xì)胞,DPBS洗滌3次,4% PFA固定15 min,結(jié)晶紫染色10 min。

1.2.6 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR) TRIzol提取細(xì)胞RNA,利用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。β-actin(Forward:CATGTACGTTGCTATCCAGGC,Reverse:CTCCTTAATGTCACGCACGAT)和CXCR4(Forward:GGGCAATGGATTGGTCATCCT,Reverse:TGCAGCCTGTACTTGTCC)引物,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green Master Mix(2×)、1 μL cDNA、8 μL RNase-free dd H2O及正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,采用公式2-△△Ct計(jì)算CXCR4基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法 裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取10 μg蛋白上樣,在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳膠上電泳(濃縮膠5%:80 V,30 min;分離膠10%:120 V,60 min),250 mA轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜1 h。常溫封閉30 min,加入CXCR4抗體(1∶100)和β-actin抗體(1∶1 000),常溫孵育2 h,洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000),常溫孵育1 h,ECL顯影。利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 CXCR4表達(dá)流式分析 取各組hUC-MSCs,制成單細(xì)胞懸液(濃度為1×106/mL)。取500 μL細(xì)胞懸液于樣本管,加入CXCR4-FITC抗體5 μL,充分混勻后常溫孵育1 h。DPBS洗滌2次,201×g,離心5 min,棄上清液。加入500 μLDPBS混勻,細(xì)胞篩過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的分離培養(yǎng)與流式鑒定 分離的hUC-MSCs形態(tài)多為梭形(圖1A),增殖力強(qiáng),傳代后4～5天即可長(zhǎng)滿。利用流式細(xì)胞儀分析第3代hUC-MSCs表面標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs高表達(dá)CD73(87.3%)和CD90(99.4%),極低表達(dá)CD34(0.3%)和CD45(0.2%)。見圖1B。分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合hUC-MSCs的特征。

2.2 左歸丸對(duì)hUC-MSCs增殖的影響 應(yīng)用不同濃度左歸丸處理hUC-MSCs 48 h后,CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,0.1、0.2 mg/mL左歸丸能明顯促進(jìn)hUC-MSCs增殖(P<0.05),0.5 mg/mL左歸丸對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響,而1.0 mg/mL左歸丸則明顯抑制hUC-MSCs增殖(P<0.05),其中0.2 mg/mL為最佳濃度(圖2A)。合適濃度的左歸丸對(duì)hUC-MSCs增殖有明顯促進(jìn)作用。

圖2 左歸丸對(duì)hUC-MSCs增殖和體外遷移的影響

2.3 左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:左歸丸0.1、0.2 mg/mL組細(xì)胞劃痕愈合速度顯著快于對(duì)照組,最佳作用濃度為0.2 mg/mL(P<0.05);加入普樂(lè)沙福(CXCR4拮抗劑)后,與左歸丸0.2 mg/mL組比較,細(xì)胞劃痕愈合速度則顯著下降(P<0.05)。見圖2B和2C。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:左歸丸0.1、0.2 mg/mL組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組,最佳作用濃度為0.2 mg/mL(P<0.05);加入普樂(lè)沙福后,與左歸丸0.2 mg/mL組比較,遷移細(xì)胞數(shù)量則明顯下降(P<0.05)。見圖2D和2E。合適濃度的左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移有明顯促進(jìn)作用,最佳作用濃度為0.2 mg/mL,應(yīng)用CXCR4拮抗劑則能抑制左歸丸誘導(dǎo)的hUC-MSCs促遷移作用。

2.4 左歸丸對(duì)hUC-MSCs中CXCR4表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)PCR分析發(fā)現(xiàn),左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05);與對(duì)照組比較,普樂(lè)沙福組CXCR4 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05);與左歸丸0.2 mg/mL組比較,左歸丸+普樂(lè)沙福組CXCR4 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見圖3A。蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),普樂(lè)沙福組CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);與左歸丸0.2 mg/mL組比較,左歸丸+普樂(lè)沙福組CXCR4蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見圖3B和3C。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05),普樂(lè)沙福組CXCR4陽(yáng)性率顯著下降(P<0.05);左歸丸+普樂(lè)沙福組CXCR4陽(yáng)性率顯著高于普樂(lè)沙福組(P<0.05),左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4陽(yáng)性率顯著高于左歸丸+普樂(lè)沙福組(P<0.05)。見圖3D和表1。左歸丸能上調(diào)hUC-MSCs中CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平,并促進(jìn)CXCR4蛋白在細(xì)胞膜的表達(dá),左歸丸通過(guò)上調(diào)CXCR4表達(dá)促進(jìn)hUC-MSCs體外遷移。

表1 各組CXCR4表達(dá)

圖3 左歸丸對(duì)hUC-MSCs中CXCR4表達(dá)的影響

3 討論

卵巢早衰發(fā)病呈上升和年輕化趨勢(shì),嚴(yán)重?fù)p害育齡女性的生殖健康。目前西醫(yī)主要采用激素替代療法治療卵巢早衰,雖然能改善患者臨床癥狀,但是其長(zhǎng)期療效欠佳,且有一定不良反應(yīng)[1]。腎藏精,主生殖。左歸丸由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜甲膠、鹿角膠、山藥、山茱萸和枸杞子組成,其補(bǔ)腎填精的功效能夠顯著改善卵巢功能[7]。崔曉萍教授遵循月經(jīng)陰陽(yáng)周期規(guī)律,取左歸丸“純補(bǔ)無(wú)瀉,陽(yáng)中求陰”之義,辨證運(yùn)用左歸丸加減治療卵巢早衰,幫助患者重建正常的月經(jīng)周期,臨床療效顯著[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn),左歸丸聯(lián)合地屈孕酮通過(guò)調(diào)節(jié)“腎-天癸-沖任-胞宮”的平衡功能,促進(jìn)卵巢早衰患者卵巢功能恢復(fù),并改善圍絕經(jīng)期癥狀,有效降低不良反應(yīng)發(fā)生率[9]。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能,是“先天之精”在細(xì)胞層次的存在形式[10]。hUC-MSCs具有取材方便、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低和無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等特點(diǎn),能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、生殖細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等不同類型細(xì)胞,且具有旁分泌及免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。2018年,世界首例hUC-MSCs治療卵巢早衰臨床研究在南京鼓樓醫(yī)院獲得成功,為hUC-MSCs移植治療卵巢早衰打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。近年來(lái),中國(guó)科學(xué)院聯(lián)合北京婦產(chǎn)醫(yī)院、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院合作開展hUC-MSCs干預(yù)卵巢早衰的多中心臨床試驗(yàn),結(jié)果顯示hUC-MSCs移植能夠改善患者卵巢內(nèi)血流,恢復(fù)卵巢功能,促進(jìn)卵泡活動(dòng)[11]。左歸丸“腎主生殖”理論與干細(xì)胞“先天之精”屬性是相通的,中西醫(yī)結(jié)合療法將左歸丸和hUC-MSCs相結(jié)合,即補(bǔ)腎填精和再生修復(fù)相結(jié)合,有望為治療卵巢早衰提供新的方案。

干細(xì)胞定向遷移歸巢至損傷組織是其發(fā)揮治療作用的前提,SDF-1/CXCR4的相互作用在MSCs遷移、歸巢至損傷組織及組織再生修復(fù)過(guò)程中具有關(guān)鍵作用,提高M(jìn)SCs中CXCR4表達(dá)能夠促進(jìn)其歸巢至損傷組織。研究發(fā)現(xiàn),損傷組織中SDF-1表達(dá)升高,能夠募集參與血液循環(huán)的CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞的定向遷移與歸巢[4,12]。LUO等[13]發(fā)現(xiàn)卵巢早衰小鼠卵巢組織中SDF-1表達(dá)水平顯著升高,SDF-1/CXCR4通路激活及細(xì)胞凋亡同卵巢損傷的發(fā)展密切相關(guān)。但是經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的MSCs表面CXCR4表達(dá)率很低,限制其在體內(nèi)的定向遷移[14]。雖然基因修飾和酶修飾能提高M(jìn)SCs中CXCR4表達(dá),但是存在影響細(xì)胞功能和活力的問(wèn)題。利用低氧、化合物和細(xì)胞因子等預(yù)處理MSCs增強(qiáng)其CXCR4表達(dá),正在成為促進(jìn)MSCs定向遷移與歸巢的重要手段[15-16]。ZHENG等[17]研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素通過(guò)上調(diào)hUC-MSCs的CXCR4表達(dá)促進(jìn)其體外遷移和體內(nèi)歸巢至損傷部位,從而改善hUC-MSCs移植的治療效果。

現(xiàn)代藥理學(xué)探討了左歸丸及其組分對(duì)BMSCs的增殖和遷移的影響及可能的機(jī)制。張晨[18]研究發(fā)現(xiàn)左歸丸水煎液能促進(jìn)BMSCs體外衰老模型的增殖能力,其機(jī)制可能與p21和干細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。李杰斌[10]發(fā)現(xiàn),左歸丸能夠促進(jìn)BMSCs的體內(nèi)定向歸巢,可能機(jī)制為促進(jìn)BMSCs分泌SCF。牛膝提取物杯莧甾酮可能通過(guò)上調(diào)CXCR4表達(dá)促進(jìn)大鼠BMSCs的體外遷移[19];龜甲水提物能激活SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)BMSCs遷移[20]。這些研究結(jié)果證實(shí),左歸丸及其組分能夠促進(jìn)BMSCs增殖和遷移。但是,左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移的影響及作用機(jī)制仍不清楚。

本研究利用組織塊法對(duì)hUC-MSCs進(jìn)行分離培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)分析其表面標(biāo)志物(CD34、CD45、CD73和CD90)表達(dá)情況,說(shuō)明分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合hUC-MSCs的特征。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,左歸丸具有類生長(zhǎng)因子作用,能促進(jìn)hUC-MSCs增殖。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,合適濃度的左歸丸對(duì)hUC-MSCs體外遷移有明顯促進(jìn)作用,其具體機(jī)制可能與CXCR4表達(dá)有關(guān)。實(shí)時(shí)PCR、蛋白印跡法和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),左歸丸能上調(diào)hUC-MSCs中CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平,并促進(jìn)CXCR4蛋白在細(xì)胞膜表達(dá),證實(shí)左歸丸通過(guò)上調(diào)CXCR4表達(dá)促進(jìn)hUC-MSCs體外遷移。上述研究結(jié)果提示,左歸丸干預(yù)將有利于hUC-MSCs定向遷移至組織損傷區(qū)域。

綜上所述,左歸丸能促進(jìn)hUC-MSCs體外增殖和遷移;左歸丸促進(jìn)hUC-MSCs遷移的機(jī)制可能與上調(diào)CXCR4表達(dá)、激活SDF-1/CXCR4信號(hào)通路有關(guān),但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示,左歸丸干預(yù)不僅能夠增強(qiáng)hUC-MSCs增殖活力,還可以促進(jìn)hUC-MSCs定向遷移與歸巢,從而改善細(xì)胞移植治療效果,為左歸丸聯(lián)合hUC-MSCs治療卵巢早衰提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝:感謝聊城市人民醫(yī)院韓發(fā)彬和谷萬(wàn)里主任的指導(dǎo),感謝干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中原生物醫(yī)學(xué)研究院提供的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

利益沖突聲明:無(wú)。