◆作者：邵盛男 張志超 鄒京京 陳玉珂 穆道運(yùn)

◆單位：1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院

海 水 小 球 藻（marine Chlorella sp.）是綠藻門（Chlorophyta）小球藻屬（Chtorella）的普生性單細(xì)胞綠色微藻，呈球形或橢球形，其細(xì)胞內(nèi)富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素等營養(yǎng)物質(zhì)。由于小球藻具有的生物活性和抗氧化性，其廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖、食品、醫(yī)藥、紡織等領(lǐng)域。

L- 肉堿（L-carnitine）又稱維生素Bt，學(xué)名β-羥基γ-三甲銨丁酸，是由賴氨酸和蛋氨酸作為前體物質(zhì)合成的一種類氨基酸。L- 肉堿廣泛存在于動(dòng)植物中，其中在動(dòng)物體內(nèi)L- 肉堿可通過日糧途徑及內(nèi)源合成獲得，植物組織中含量普遍低于動(dòng)物組織，研究表明，L- 肉堿也存在于生物餌料中，但相對(duì)含量較低（Dong MZ 等，2006）。L- 肉堿可促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β- 氧化，以及清除線粒體中多余的短鏈和中鏈脂肪酰基CoA。同時(shí)它還具有提高抗氧化能力、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)幼體發(fā)育等作用（Kolodziejczyk J 等，2011）。

本研究在前人相關(guān)研究基礎(chǔ)上，探究不同濃度L- 肉堿對(duì)小球藻促生長的作用機(jī)理。旨在為L- 肉堿在微藻培養(yǎng)以及應(yīng)用領(lǐng)域提供參考，同時(shí)為天然色素生產(chǎn)技術(shù)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

海水小球藻由中國海洋大學(xué)藻種庫提供。試驗(yàn)所用試劑：L- 肉堿購自Sigma 公司（產(chǎn)品代號(hào)c-0158）；鎂單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04-1735-2004）、鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04-1726-2004）購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；濃硝酸、N,N- 二甲基甲酰胺、人工基礎(chǔ)海水及f/2培養(yǎng)基所用試劑均為分析純；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

光照培養(yǎng)箱（HPG-400BX）、冷凍高速離心機(jī)（HITACHI CR21N）、全功能微孔板檢測(cè)儀（Biotek Synergy H1）、原子吸收光譜儀（Agilent 3510）、電子分析天平（BSA124S-CW）、超聲波清洗儀（Auto Science AS）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

接種前對(duì)試驗(yàn)用具及培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。采用f/2 培養(yǎng)基及人工基礎(chǔ)海水作為營養(yǎng)源，接種后待培養(yǎng)體系穩(wěn)定后分別添加濃度0、5、50、100、200 mg/L的L- 肉堿。在光照培養(yǎng)箱恒溫條件下，溫度25±1 ℃，光照強(qiáng)度4000 lx，光暗比24 h∶0 h，2 L培養(yǎng)體積，培養(yǎng)10d，試驗(yàn)期結(jié)束后使用冷凍高速離心機(jī)收集海水小球藻樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)人工基礎(chǔ)海水成分和選用f/2 培養(yǎng)基見表1 和表2。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每組取20 mL藻液4 ℃條件10000 r/min 離心10 min，去除上清，加入5 mL 的N,N- 二甲基甲酰胺于收獲的藻樣品中，重新懸浮后，置于黑暗條件下4 ℃浸提24 h。樣品5000 r/min 離心10 min。測(cè)定樣品及空白樣品647 nm 和664.5 nm 處OD 值（Chen X 等，2016）。

1.3.3 鐵、鎂含量的測(cè)定

1.3.3.1 樣品處理及測(cè)定

稱取適量藻泥于坩堝65 ℃烘干至恒重，重新稱重統(tǒng)一每組干燥的藻細(xì)胞重量，碳化至無煙后，550 ℃灰化完全后，待溫度降低取出，加入1 體積濃硝酸與1體積水配制成的溶液5 mL 溶解沉淀，重復(fù)2 次將沉淀完全洗入容量瓶，蒸餾水定容至100 mL待測(cè)，調(diào)節(jié)Agilent 3510 型原子吸收光譜儀至最佳狀態(tài)，載氣為乙炔，設(shè)置鐵、鎂空心陰極燈在248.3 nm、285.2 nm 波長處檢測(cè)元素濃度。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將1000μg/mL 的鐵、鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用蒸餾水配置成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，鐵為：0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL；鎂為0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6μg/mL。測(cè)定方法保持與樣品一致，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表3。

表3 金屬元素回歸方程及相關(guān)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用方差分析法比較試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。應(yīng)用Tukey 多重比較檢驗(yàn)比較各處理組間均值的差異顯著性，差異顯著性水平P值設(shè)在0.05。數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L- 肉堿對(duì)海水小球藻葉綠素含量的影響

圖1 所示，在一定濃度范圍內(nèi)，葉綠素a 含量隨L- 肉堿濃度先增加后降低，5 mg/L 肉堿組海水小球藻葉綠素a 含量顯著高于對(duì)照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素a 含量顯著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉堿組（P＜0.05），200 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素a 含量高于100 mg/L 肉堿組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 L- 肉堿對(duì)海水小球藻葉綠素a 含量的影響

圖2 所示，在一定濃度范圍內(nèi)葉綠素b 含量隨L- 肉堿濃度先增高后降低，總體趨勢(shì)與葉綠素a 含量相似，5 mg/L 肉堿組海水小球藻葉綠素b 含量顯著高于對(duì)照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素b 含量顯著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉堿組（P＜0.05），海水小球藻中葉綠素b 含量要低于葉綠素a 含量。

圖3 所示，在一定濃度范圍內(nèi)總?cè)~綠素含量隨L- 肉堿濃度先增高后降低，5 mg/L 肉堿組中海水小球藻總?cè)~綠素含量最高，100 mg/L 肉堿組中海水小球藻總?cè)~綠素含量最低，在5～100 mg/L 的L- 肉堿濃度范圍內(nèi)總?cè)~綠素含量隨肉堿濃度增高而降低，200 mg/L 肉堿組總?cè)~綠素含量高于100 mg/L 肉堿組，但差異不顯著（P＞0.05），且略低于對(duì)照組。

圖3 L- 肉堿對(duì)海水小球藻總?cè)~綠素含量的影響

2.2 L- 肉堿對(duì)海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量的影響

圖4 所示，在5～100mg/L范圍內(nèi)，金屬元素鐵的含量隨著L- 肉堿添加濃度的增加而減少，5、50、100、200 mg/L 組 間 鐵含量差異顯著（P＜0.05），其中5、50 mg/L 肉堿組鐵含量顯著高于對(duì)照組，兩組間差異顯著，100 mg/L 肉堿組鐵含量高于對(duì)照組但 無 顯 著 差 異（P＞0.05），200 mg/L 肉堿組鐵含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖5 所示，在5～100mg/L范圍內(nèi)，海水小球藻中鎂元素含量隨著L- 肉堿添加量的增加而減少。5 mg/L 肉堿組海水小球藻中鎂元素含量顯著高于對(duì)照組和200 mg/L 肉堿組（P＜0.05），其中5 mg/L 肉 堿 組 與50 mg/L、100 mg/L 肉堿組之間無顯著差異（P＞0.05），200 mg/L 肉堿組鎂含量低于對(duì)照組但無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 L- 肉堿對(duì)海水小球藻鎂元素含量的影響

3 討論

3.1 小球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

小球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用十分廣泛。首先，小球藻含有天然免疫物質(zhì)和促生長物質(zhì)，可以提高生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫力，降低飼料消耗（Dalmo,R 等，1996），是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用的優(yōu)良餌料藻及飼料添加劑。蔡榮等（2017）研究表明，飼料中添加小球藻醇提物對(duì)于提高花鱸的生產(chǎn)性能、改善體組成有一定的作用。何亞丁等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，小球藻藻渣可以部分替代凡納濱對(duì)蝦飼料中的豆粕，降低豆粕的用量，而不影響凡納濱對(duì)蝦的生長和氮排放，并降低磷排放。常洪淼（2022）研究發(fā)現(xiàn)，新型高蛋白小球藻替代魚粉沒有對(duì)虹鱒的生長、代謝和腸道健康造成明顯的負(fù)面影響，具備大比例替代虹鱒飼料中魚粉的潛力。其次，小球藻在水質(zhì)調(diào)控方面也有良好效果，如在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖系統(tǒng)中，小球藻對(duì)于維持水體生態(tài)系統(tǒng)的正常功能以及水環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用（王崇明等，1993）。在對(duì)凡納濱對(duì)蝦（宋楚兒等，2023）以及羅非魚（秦璐等，2021）的養(yǎng)殖尾水投放一定濃度的小球藻進(jìn)行水質(zhì)凈化實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)氨氮、磷酸鹽和硝酸鹽的去除效果較好，并可以調(diào)節(jié)水體微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)狀況。此外，小球藻代謝可以合成多種色素，如葉綠素、葉黃素、蝦青素等，能起到改善水生動(dòng)物體色，提高魚類肌肉質(zhì)量，保護(hù)蝦蟹幼體發(fā)育等作用。并且由于小球藻所產(chǎn)生的是天然色素，因此還具有色價(jià)高、穩(wěn)定性好、抗氧化性高以及安全健康的特征（蘇力德，2011）。有研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加適量的蝦青素能防止低密度脂蛋白氧化，并且對(duì)水生動(dòng)物的生產(chǎn)無任何不利影響（Matsuno T 等，1990）。在飼料中添加一定的天然葉黃素也可以使水產(chǎn)動(dòng)物呈現(xiàn)出靚麗鮮艷的自然健康顏色，同時(shí)還可以改善部分水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化指標(biāo)以及生長性能（曾胡龍等，2021）。

培養(yǎng)高品質(zhì)小球藻對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的意義十分重大，具有重要的應(yīng)用前景。可以通過營養(yǎng)強(qiáng)化，調(diào)節(jié)藻色素組成來強(qiáng)化小球藻。同時(shí)提高小球藻運(yùn)輸、保存的質(zhì)量，以促進(jìn)小球藻規(guī)?；a(chǎn)（葛玲瑞等，2022）。

3.2 L- 肉堿在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

L- 肉堿是一種具有多種生理功能和生物活性的新型無公害添加劑。對(duì)動(dòng)物體來說，補(bǔ)充肉堿與補(bǔ)充其它維生素及礦物質(zhì)具有同樣的重要性，目前肉堿的使用已受到普遍關(guān)注并廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物、豬、禽的養(yǎng)殖中。眾多研究表明，在養(yǎng)殖動(dòng)物中添加適量的L- 肉堿可以提高動(dòng)物飼料利用率和生產(chǎn)性能，改善肉品質(zhì)，提高動(dòng)物的抗病力。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，L- 肉堿作為飼料添加劑對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長、脂代謝、抗氧化及免疫方面都發(fā)揮著重要作用。魚類方面，陳玉珂等（2012）研究表明，適宜質(zhì)量濃度L- 肉堿強(qiáng)化的鹵蟲投喂草魚和鳙魚開口苗提高了魚苗體內(nèi)多聚不飽和脂肪酸（PUFAs）的含量，這對(duì)促進(jìn)魚開口苗生長有重要作用。然而也有部分研究表明，飼料中添加L- 肉堿對(duì)魚類生長、蛋白質(zhì)利用率和飼料轉(zhuǎn)化率無明顯影響，如雜交條吻鱸、大菱鲆、黃顙魚、黑鯛、大口黑鱸、歐洲鱸和初始體重為（151.00±1.69）g 的虹鱒（于婷等，2019）。Sabzi 等（2017）研究表明，飼料中添加L- 肉堿能夠改善高脂飼料鯉魚幼魚體質(zhì)并抑制脂質(zhì)過氧化；許多研究也表明，在飼料中添加L- 肉堿能降低不同魚類的脂質(zhì)含量并增加蛋白質(zhì)含量，或降低組織和全身的蛋白質(zhì)分解代謝，顯示出顯著的蛋白質(zhì)儲(chǔ)留效果。明建華等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，添加L- 肉堿可顯著提高青魚血清溶菌酶活性及補(bǔ)體C3 和C4 水平，從而增強(qiáng)魚體的非特異性免疫力。同時(shí)，L- 肉堿對(duì)甲殼類動(dòng)物的生長和風(fēng)味也具有促進(jìn)作用，Sabrina 等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在沼蝦的飼料中添加L- 肉堿可以加速其脂肪酸的β氧化，促進(jìn)對(duì)脂類的利用。吳成福等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，添加L- 肉堿能提高斑節(jié)對(duì)蝦肌肉肌苷酸含量，增加對(duì)蝦鮮味作用，且低濃度肉堿的添加組效果更佳。

3.3 不同濃度L- 肉堿對(duì)海水小球藻葉綠素含量的影響

在小球藻細(xì)胞中，葉綠素鑲嵌在葉綠體的類囊體膜中，是其進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，小球藻細(xì)胞中葉綠素主要由葉綠素a、葉綠素b 組成。在光合作用中，絕大部分葉綠素的作用是吸收及傳遞光能，但只有少數(shù)處于激發(fā)狀態(tài)的葉綠素a 可以將光能轉(zhuǎn)化為電能，葉綠素b 通過吸收光能輔助光合作用。對(duì)于人體，葉綠素具有輔助造血、提供維生素、維持酶活性、解毒等作用（張懷斌，2008）。

已有研究表明，L- 肉堿可以促進(jìn)微藻種群增長。林偉杰（2016）研究表明L- 肉堿能夠提高海水小球藻對(duì)N、P 和Fe 營養(yǎng)鹽吸收率的同時(shí)增加小球藻葉綠素a 的含量，此次試驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度L- 肉堿對(duì)海水小球藻葉綠素含量均有影響。在一定的濃度范圍內(nèi)，海水小球藻葉綠素含量隨L- 肉堿濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在L- 肉堿濃度為5 mg/L 時(shí)肉堿組海水小球藻葉綠素含量最高，顯著高于對(duì)照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素含量最低，但與L- 肉堿濃度為200 mg/L 時(shí)相比差異不顯著（P＞0.05）。原因可能是由于L-肉堿屬于季銨鹽陽離子復(fù)合物，研究表明季銨鹽陽離子復(fù)合物能夠與某些細(xì)胞膜蛋白相互作用，改變其通透性，從而提高小球藻對(duì)N 等營養(yǎng)素的親和力（曾惠，2014），促進(jìn)其對(duì)營養(yǎng)元素的吸收。因此，L- 肉堿能夠促進(jìn)海水小球藻葉綠素含量很可能與其屬于季銨鹽陽離子復(fù)合物的屬性有關(guān)。另外，L- 肉堿的主要功能是參與脂類代謝，為機(jī)體供能，同時(shí)產(chǎn)生乙酰CoA，乙酰CoA又是藻類色素合成的前提物質(zhì)，因此肉堿對(duì)海水小球藻葉綠素含量的影響也可能與L- 肉堿參與脂類代謝有關(guān)。

3.4 不同濃度L- 肉堿對(duì)海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量的影響

在藻類的生長過程中，鎂由鎂螯合酶復(fù)合物催化Mg2+與原卟啉IX 結(jié)合，是葉綠素組成的重要金屬元素。鐵是葉綠素合成過程中關(guān)鍵酶的重要組成元素，在葉綠素合成過程中具有輔助催化的作用，同時(shí)在一定濃度范圍內(nèi)鐵對(duì)藻類生長具有促進(jìn)作用（丁飛飛，2010）。已有研究表明，L- 肉堿不僅能夠促進(jìn)小球藻種群增長，還能提高金屬元素鐵等營養(yǎng)鹽的吸收（林偉杰，2017），本試驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度L- 肉堿對(duì)海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量均有影響。海水小球藻金屬鐵、鎂含量隨著L- 肉堿濃度增高呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢(shì)。在L- 肉堿濃度為5 mg/L 時(shí)肉堿組海水小球藻金屬鐵、鎂含量最高，其中金屬鐵含量顯著高于對(duì)照組及其他處理組（P＜0.05），而金屬鎂含量則顯著高于對(duì)照組并在一定程度上高于其他處理組；200 mg/L 肉堿組中海水小球藻金屬鐵、鎂含量最低，其中金屬鐵含量顯著低于對(duì)照組及其他處理組（P＜0.05），而金屬鎂含量則在一定程度上低于對(duì)照組及其他處理組（P＞0.05）。這表明L- 肉堿的加入能夠有效增加海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量。這應(yīng)該是由于藻類對(duì)鐵等營養(yǎng)元素的吸收是通過主動(dòng)運(yùn)輸，它們需要在藻細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用以及相關(guān)酶的輔助下，才能被藻細(xì)胞吸收利用（鮑亦璐，2012）。目前已有關(guān)于L- 肉堿對(duì)動(dòng)物細(xì)胞膜的研究表明，L- 肉堿可以保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，對(duì)細(xì)胞膜有及時(shí)修復(fù)的功能，并減少對(duì)磷脂雙分子層的損害，能夠增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性（王朕朕等，2012）。另外，L- 肉堿也可能通過提高藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β- 氧化，降低其膜脂質(zhì)降解作用（周濤等，2006）。因此，L- 肉堿很可能是通過提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性從而提高海水小球藻對(duì)金屬元素的吸收。另外，海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量有隨著L- 肉堿濃度增高而降低的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于水體中的鐵鹽溶解度小，可利用率低，同時(shí)易與磷酸鹽生成沉淀。因此形成沉淀物導(dǎo)致海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量減少。

本試驗(yàn)條件下，5 mg/L 的L-肉堿能顯著提高海水小球藻中葉綠素含量及金屬元素鐵、鎂的含量。

參考文獻(xiàn)：（略）