劉玉靜，劉召明，楊香芳，趙同淵，王翠菊，王琳

（青島易邦生物工程有限公司 山東青島 266113）

在20 世紀(jì)60-70 年代，科學(xué)家們建立了微載體懸浮培養(yǎng)體系，同時(shí)創(chuàng)建了空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為在體外進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造了可能[1]。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)是指通過使用生物反應(yīng)器，在人工條件下，對用于生物制品當(dāng)中的動物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模高效率的培養(yǎng)技術(shù)。隨著生物技術(shù)的不斷革新、發(fā)展，動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛地用于病毒的大規(guī)模培養(yǎng)當(dāng)中，這項(xiàng)培養(yǎng)技術(shù)具有非常高效的生產(chǎn)效率，同時(shí)還具有高質(zhì)量與生物安全容易掌控等多方面的優(yōu)點(diǎn)。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)為動物源性，因此這項(xiàng)技術(shù)在獸用疫苗的制備當(dāng)中得到了很好的運(yùn)用。細(xì)胞懸浮技術(shù)根據(jù)動物細(xì)胞貼壁能力的差異，又被分為了全懸浮和貼壁懸浮這兩種培養(yǎng)方式。

1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)

1.1 選擇和懸浮馴化動物細(xì)胞系

在動物疫苗的生產(chǎn)過程當(dāng)中，安全性、有效性和成本控制是疫苗生產(chǎn)最主要的幾點(diǎn)考慮因素，只有如此才能提高獸用疫苗生產(chǎn)的生產(chǎn)效率，同時(shí)確保生物產(chǎn)品的質(zhì)量具有可靠性。在生產(chǎn)過程中，做好動物細(xì)胞系的選擇和馴化這兩個(gè)方面，對以上幾點(diǎn)要求的優(yōu)化達(dá)標(biāo)具有非常重要的意義。由于同一種細(xì)胞和準(zhǔn)備擴(kuò)增的病毒之間能夠產(chǎn)生相互作用，因此在應(yīng)用某細(xì)胞系進(jìn)行大規(guī)模的疫苗生產(chǎn)之前，應(yīng)該提前與目標(biāo)病毒進(jìn)行相互的適應(yīng)性選擇。同時(shí)，所選細(xì)胞的生長特性對能否進(jìn)行大規(guī)模增殖培養(yǎng)，以及使用哪種工藝進(jìn)行增殖培養(yǎng)具有決定性的作用，這是由于同一種細(xì)胞在不同的培養(yǎng)狀態(tài)下對病毒的敏感程度也不盡相同[2]。另一方面，這項(xiàng)技術(shù)對懸浮細(xì)胞的繁殖效率、活力以及生物穩(wěn)定性等均具有較高的要求，馴化是細(xì)胞懸浮的首要任務(wù)，特別是對于貼壁細(xì)胞來說，在微載體懸浮培養(yǎng)的狀態(tài)下會明顯的改變貼壁細(xì)胞的生長狀態(tài)，因此穩(wěn)定性是細(xì)胞馴化過程中最重要的考慮因素，在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，可以通過逐漸降低培養(yǎng)基中血清的濃度來達(dá)到維持較高穩(wěn)定性的目的。若在培養(yǎng)過程中細(xì)胞受到了損傷，就難以恢復(fù)原狀，因此在整個(gè)馴化的過程中，最好能夠令細(xì)胞的活力維持在90%以上。

1.2 最適培養(yǎng)基的選擇

選擇適宜的培養(yǎng)基是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)中最為關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。一般情況下，動物細(xì)胞的生長必須存在血清這種營養(yǎng)成分，但由于血清的組成成分比較復(fù)雜，并且存在價(jià)格高昂，不同批次間血清組成成分差異較大等弊端，導(dǎo)致這種培養(yǎng)基在實(shí)際的疫苗生產(chǎn)當(dāng)中難于應(yīng)用。當(dāng)前，隨著技術(shù)的不斷革新，這種血清培養(yǎng)基已經(jīng)被逐漸替代為無血清培養(yǎng)基，有效降低了血清培養(yǎng)基容易被污染的情況，同時(shí)還在一定程度上降低了生產(chǎn)的成本。但由于細(xì)胞培養(yǎng)對培養(yǎng)基具有較高的選擇性，單一一種無血清培養(yǎng)基無法適用于多種細(xì)胞系的培養(yǎng)，這就促使了個(gè)性化無血培養(yǎng)基的快速發(fā)展，可以在無血清培養(yǎng)基當(dāng)中加入適量的轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或者纖連蛋白等特定的生物活性物質(zhì)，以促進(jìn)動物細(xì)胞的快速繁殖生長[2]。據(jù)當(dāng)前的研究報(bào)道，在大部分疫苗生產(chǎn)和組織工程細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)過程中已經(jīng)融入了無血清微載體培養(yǎng)技術(shù)[3]。但在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)由無血清培養(yǎng)所引發(fā)的細(xì)胞凋亡問題，仍然阻礙著細(xì)胞懸浮技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。

1.3 選擇恰當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)器

作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)中心的關(guān)鍵性設(shè)備，生物反應(yīng)器主要是利用細(xì)胞或者酶作為生物催化劑，同時(shí)還能夠?yàn)榧?xì)胞的生長繁殖提供一種無菌環(huán)境。其最大的優(yōu)勢就是能夠進(jìn)行逐級放大，而由于疫苗生產(chǎn)的成本會受生產(chǎn)細(xì)胞規(guī)模的影響，因此生物反應(yīng)器的選擇就直接影響到了疫苗生產(chǎn)成本。在疫苗生產(chǎn)中對生物反應(yīng)器的要求通常包括以下幾點(diǎn)：生產(chǎn)效率高、可靠性較強(qiáng)、生產(chǎn)成本較低、安全性能強(qiáng)、活性較強(qiáng)、便于控制質(zhì)量和回收，同時(shí)具有較高的細(xì)胞密度。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較多的有以下幾種生物反應(yīng)器，分別是：流床式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器和旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等[2]。

1.4 生產(chǎn)工藝的選擇

生產(chǎn)工藝的選擇決定了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)最后的投入加工過程，按照培養(yǎng)方式的不同可以分為以下5 種：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式以及灌流式操作等幾種操作模式。不同的生產(chǎn)工藝具有其自身的特點(diǎn)與優(yōu)勢，同時(shí)還具有自身相對應(yīng)的生物反應(yīng)器的類型，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，可以根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的不同和所生產(chǎn)的疫苗種類，進(jìn)行靈活的優(yōu)化選擇。

2 動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 在豬病疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

隨著我國生豬養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化與集約化程度的不斷加深，各種傳染性疫病的發(fā)生率也在逐年提高，如常見的豬藍(lán)耳病、偽狂犬病、豬瘟、豬細(xì)小病毒以及豬圓環(huán)病毒病等均會對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的危害。而控制這些疾病最好的辦法就是按照規(guī)定接種相關(guān)的疫苗，正是得益于動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的成熟與發(fā)展，讓各種獸用疫苗的大批量生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)，同時(shí)還保證了生物安全性。例如馮磊等[4]就利用了微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)將豬藍(lán)耳病病毒在Marc-45細(xì)胞上進(jìn)行了大規(guī)模的培養(yǎng)，并且成功地取得了較高的病毒效價(jià)。王建超等[5]則利用Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模地生產(chǎn)出了豬流行性腹瀉病毒，并且發(fā)現(xiàn)隨微載體濃度的提高，所獲得的最高細(xì)胞密度也在提高，同時(shí)利用CelliGen 生物反應(yīng)器，將培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化，制備出了具有較好免疫原性的疫苗。

2.2 在雞病疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

雞是我國重要的畜禽產(chǎn)品，特別是雞蛋、肉類在國民生活中占據(jù)著重要的地位，但雞病的控制也給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的困擾。尤其是一些病毒性的傳染性疾病，可以給養(yǎng)殖者帶來巨大的危害，通過科學(xué)合理的接種疫苗，能夠最大限度地降低傳染性疫病給雞養(yǎng)殖業(yè)所帶來的損失。在我國利用SPF 雞胚進(jìn)行擴(kuò)增是生產(chǎn)禽用疫苗最為常見的方法，但這種方法對于雞胚的培養(yǎng)周期、操作、來源以及是否受到了污染等因素具有較高的要求，同時(shí)難于在短時(shí)間集齊大規(guī)模生產(chǎn)所用的數(shù)百萬枚的SPF 雞蛋。基于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，在國內(nèi)外已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)大批量的生產(chǎn)禽用疫苗。在我國有公司利用Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)成功生產(chǎn)出禽流感疫苗，也利用該項(xiàng)技術(shù)生產(chǎn)出了符合國內(nèi)獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)的雞傳支H120 細(xì)胞弱毒疫苗[2]。石崗等[6]通過Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了雞傳染性法氏囊病疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。

2.3 在其他畜禽疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

除上述對單一的物種傳染性較強(qiáng)的致病源以外，還有一些人畜共患的致病源，流行的范圍較為廣泛，危害性也比較強(qiáng)，可以通過接種疫苗的方式進(jìn)行預(yù)防控制。例如李薇等[7]通過Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)對乙型腦炎病毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行了探究，并且為進(jìn)一步放大創(chuàng)造了新思路。國內(nèi)外研究人員利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)均對甲型H1N1 流感疫苗的制備進(jìn)行了探究，并且發(fā)現(xiàn)在MDCK細(xì)胞中使用微載體培養(yǎng)能夠達(dá)到較高的細(xì)胞密度。

3 結(jié)語

綜上所述，動物細(xì)胞懸浮技術(shù)以其獨(dú)特的自身優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于獸用疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、質(zhì)量可靠的生物制品性疫苗提供了技術(shù)支持。并且隨著工藝與技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)也變得更加容易，更加促進(jìn)了獸用疫苗規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展?！?/p>