程亞蕊，黃世鵬，張?zhí)炀?，張建猛，王鋒尖

集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803中非生物脅迫響應(yīng)的核心基因分析

程亞蕊1，黃世鵬1，張?zhí)炀?，張建猛1，王鋒尖1

（1. 漢江師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 十堰 442000；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

以集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的多組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為對象，鑒定藍(lán)細(xì)菌在非生物脅迫下共同表達(dá)的核心差異基因（CDGs））．結(jié)果表明，9個(gè)對氮、鐵、碳、磷缺乏響應(yīng)的CDGs被鑒定．京都基因和基因組百科全書（KEGG）分析表明，氮代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基酸代謝與營養(yǎng)缺乏有關(guān)．研究還鑒定了熱激處理下共同表達(dá)的CDGs，并且代謝通路ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和碳固定也與熱脅迫相關(guān)．同時(shí)構(gòu)建了CDGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，以預(yù)測基因在應(yīng)對脅迫可能的響應(yīng)機(jī)制．這些候選基因庫將有助于加速理解藍(lán)細(xì)菌在應(yīng)激中的調(diào)控模式．

集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803；非生物脅迫；核心差異基因；KEGG；蛋白互作

藍(lán)細(xì)菌屬于革蘭陰性的光合生物，通過捕獲太陽能來增強(qiáng)其高效的光自養(yǎng)代謝，進(jìn)而固定無機(jī)碳和氮[1]．藍(lán)細(xì)菌的光系統(tǒng)與高等植物相似，可在各種環(huán)境壓力下成功生存，因此其可以作為高等植物研究非生物脅迫下光合作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的優(yōu)秀模型[2]．由于集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803（sp. PCC 6803）生長速度相對較快、基因組較小且易于修飾的特點(diǎn)，已成為研究各種應(yīng)激響應(yīng)的模式生物[3]71．組學(xué)測序技術(shù)已成功應(yīng)用于研究藍(lán)細(xì)菌對脅迫的響應(yīng)．前期研究通過整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，鑒定了集胞藍(lán)細(xì)菌對鹽脅迫響應(yīng)的基因以及激活平衡滲透壓的基因[4]．鹽濃度過高會破壞細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，并導(dǎo)致活性氧的積累，進(jìn)而導(dǎo)致光合系統(tǒng)的破壞和膜脂質(zhì)的過氧化[5]．藍(lán)細(xì)菌對3種不同光照（藍(lán)、橙、紅）適應(yīng)過程的相關(guān)基因也通過轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行了鑒定[6]．集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803在缺鐵和氧化脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也確定了該菌株在各種應(yīng)激下的調(diào)控機(jī)制[7]．

不同類型的脅迫不僅會導(dǎo)致藍(lán)細(xì)菌發(fā)生類似的生理變化，還可能誘導(dǎo)一系列相同基因的表達(dá)，并激活相關(guān)蛋白來響應(yīng)非生物應(yīng)激．基于不同的組學(xué)數(shù)據(jù)可以比較分析響應(yīng)壓力源的共同基因和代謝途徑．集胞藍(lán)細(xì)菌應(yīng)激的多轉(zhuǎn)錄組比較分析確定了其對己醇、苯甲醇和丁醇等響應(yīng)的共同表達(dá)基因[8]．多組氮缺乏的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析揭示了可能參與異形胞分化的新候選基因[9]2545．然而，尚未有多組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較分析來確定藍(lán)細(xì)菌對營養(yǎng)缺乏響應(yīng)的共同基因和代謝途徑．

本文重新分析集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的3種不同營養(yǎng)限制和2種熱激處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，并確定細(xì)胞對應(yīng)激因素的響應(yīng)．通過生物信息學(xué)分析，確定脅迫響應(yīng)的共同表達(dá)基因和代謝途徑，構(gòu)建共同表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，確定參與藍(lán)細(xì)菌抗脅迫的重要基因．這些候選基因庫將有助于加速理解藍(lán)細(xì)菌在應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制，以期為藍(lán)細(xì)菌和植物對脅迫響應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)．

1　材料與方法

1.1　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采集及分析

集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803不同應(yīng)激處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集從國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載．本文共篩選4個(gè)不同的數(shù)據(jù)集（SRP102282，缺氮4 h，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)；SRP301698，缺鐵4 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)；SRP032228，缺碳20 h，缺磷12 h，42℃ 30 min，對照2個(gè)重復(fù)，其他無重復(fù)；SRP3328835，39℃ 1 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)），共21個(gè)樣本組成．通過FastQC處理原始數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)．Bowtie2用于將高質(zhì)量數(shù)據(jù)與集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803參考基因組進(jìn)行比對[10]．通過比較應(yīng)激和對照樣品中的基因表達(dá)水平來鑒定共同表達(dá)的核心差異基因（core differential genes，CDGs）．

1.2　CDGs的富集分析

通過比較不同數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因（倍數(shù)變化≥2.00和<0.05），并基于維恩圖分析應(yīng)激響應(yīng)的CDGs，然后對這些基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以確定與營養(yǎng)缺乏和熱激有關(guān)的代謝途徑．使用clusterProfiler 3.8版進(jìn)行GO和KEGG富集分析．

1.3　PPI網(wǎng)絡(luò)分析

基于STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）可以對已知和未知的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和整合[11]．可能的相互關(guān)系參考的標(biāo)準(zhǔn)是置信度得分為0.4，交互因素的最大數(shù)量為0．交互預(yù)測主要來自文本挖掘、實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫、共表達(dá)、鄰域、基因融合和共出現(xiàn)．

2　結(jié)果與分析

2.1　與營養(yǎng)缺乏相關(guān)的CDGs鑒定

首先分析在氮、鐵、碳、磷缺乏下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集．在營養(yǎng)缺乏的情況下，不同數(shù)據(jù)集的總體基因表達(dá)譜（見圖1a）是相似的，表明集胞藍(lán)細(xì)菌對脅迫的反應(yīng)是相容的．由維恩圖（見圖1b）可見，在不同的樣品中共鑒定出1 132個(gè)差異表達(dá)基因，但不同數(shù)據(jù)集僅鑒定了9個(gè)在不同營養(yǎng)限制中保守的CDGs．這9個(gè)基因分別編碼缺鐵誘導(dǎo)的葉綠素結(jié)合蛋白、Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、50S核糖體蛋白L4、異天冬氨酰肽酶和未知蛋白等（見表1）．每個(gè)數(shù)據(jù)集特有的數(shù)百個(gè)基因可能是由菌株對不同應(yīng)激處理和生長條件的耐受水平差異引起的．

圖1　與營養(yǎng)缺乏相關(guān)CDGs的鑒定

表1　不同數(shù)據(jù)集中響應(yīng)營養(yǎng)限制的CDGs

對在不同數(shù)據(jù)集中檢測共同表達(dá)的CDGs進(jìn)行了GO和KEGG富集分析（見圖2）．在鐵和氮缺乏的情況下，對46個(gè)CDGs的GO分析（見圖2a）表明，所富集的生物過程與膜的組成、類囊體膜和質(zhì)膜有關(guān)．KEGG分析（見圖2b）表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是最顯著富集的代謝通路，其次是氮代謝，分別有35%，18%的CDGs參與這些途徑，表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在營養(yǎng)缺乏的情況下發(fā)揮著關(guān)鍵作用．在氮、碳、磷缺乏的情況下，對48個(gè)CDGs的KEGG富集分析（見圖2c）表明，核糖體是最顯著的生物過程，其次是氨基酸代謝．在鐵、碳、磷缺乏的情況下，CDGs主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（見圖2d）．這些結(jié)果表明，氨基酸代謝可能與營養(yǎng)限制有關(guān)，因?yàn)榫晷枰嗟陌被醽砗铣傻鞍踪|(zhì)以應(yīng)對營養(yǎng)缺乏．

2.2　響應(yīng)溫度的CDGs鑒定

對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集SRP332228（42℃，30 min）和SRP3328835（39℃，1 h）進(jìn)行比較分析，以探究與溫度相關(guān)的基因．35個(gè)共同表達(dá)的CDGs被檢測（見圖3a）．由缺氮、缺鐵和熱激下的CDGs（見圖3b）可見，該結(jié)果僅檢測到3個(gè)共同表達(dá)的CDGs，包括BAA17923（，未知蛋白）、BAA16628（，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和BAA16842（，鐵攝取蛋白A1），其在碳和磷缺乏下并未差異表達(dá)．該結(jié)果表明，在不同脅迫處理下，共有基因較少，可能是由于藍(lán)細(xì)菌本身的基因數(shù)量較少及不同數(shù)據(jù)集中菌株的生長狀態(tài)和脅迫處理不同．GO分析（見圖3c）主要富集在細(xì)胞質(zhì)、ATP結(jié)合和蛋白水解．KEGG分析（見圖3d）顯示，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是最富集的代謝途徑，其次是碳固定，該結(jié)果與營養(yǎng)缺乏下的分析一致，表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在各種脅迫下均發(fā)揮重要作用，這可能是由于菌株在應(yīng)激時(shí)會增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸．

圖3　與熱激相關(guān)CDGs的鑒定

2.3　CDGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為了探究在營養(yǎng)缺乏下9個(gè)共有表達(dá)CDGs的功能，基于STRING數(shù)據(jù)庫中尋找這些基因的PPI信息，每個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)由11個(gè)節(jié)點(diǎn)組成．部分CDGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖4．與IsiA相關(guān)的蛋白質(zhì)是光系統(tǒng)I的亞基，與RplD相關(guān)性較高的蛋白質(zhì)是核糖體亞基；與FecC相關(guān)性較高的蛋白主要與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；與未知蛋白質(zhì)（Sll0422，Slr0869，Slr1726，Slr1113）相互作用的蛋白質(zhì)主要是未知蛋白質(zhì)．這說明應(yīng)對脅迫的基因并不是獨(dú)立發(fā)揮作用，而是與其具有類似功能的基因共同作用來抵抗不利條件．

圖4　CDGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

3　討論

本文通過比較不同脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，以確定藍(lán)細(xì)菌對應(yīng)激響應(yīng)的共有基因和代謝途徑．與植物相比，集胞藍(lán)細(xì)菌的基因數(shù)量相對較少，只有3 000多個(gè)[3]1173．因此，本文通過比較轉(zhuǎn)錄組分析確定的共有表達(dá)的CDGs較少．念珠藻PCC 7120中通過將2組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析來篩選與異形胞分化相關(guān)的基因，但該研究并未使用系統(tǒng)生物信息學(xué)的分析方法[9]2555．前期在集胞藍(lán)細(xì)菌中也未有相關(guān)的比較分析來確定其在非生物脅迫下的共有核心基因．

在營養(yǎng)缺乏的情況下，CDGs富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氮代謝和氨基酸代謝中．集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803基因組中有50多個(gè)基因編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能主要涉及各種化合物和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[12]．植物在營養(yǎng)限制下會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，激活呼吸途徑，并利用氨基酸作為替代底物來應(yīng)對能量不足．氨基酸也可以作為信號分子來協(xié)調(diào)植物生長和脅迫響應(yīng)[13]，藍(lán)細(xì)菌也可能具有與植物類似的響應(yīng)機(jī)制．在氮和鐵缺乏下，CDGs也富集到氮代謝．鐵攝取調(diào)節(jié)因子FurA參與念珠藻PCC 7120中的異形胞分化[14]．總氮調(diào)節(jié)因子NtcA可以控制基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)鐵的獲取，從而保護(hù)藍(lán)細(xì)菌免受缺鐵引起的氧化應(yīng)激的影響[15]．這表明藍(lán)細(xì)菌中的鐵和氮調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)存在相互交叉．響應(yīng)溫度的CDGs的KEGG分析主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和碳固定途徑．為了應(yīng)對低溫脅迫導(dǎo)致的光合速率降低，香蕉會上調(diào)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，以提高固碳效率[16]．因此，在不利條件下生長的植物可能會導(dǎo)致光合效率下降，并通過調(diào)節(jié)碳固定來應(yīng)對能量不足．

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示與IsiA高度相關(guān)的蛋白質(zhì)均為PS I亞單位．基因與光系統(tǒng)II的具有序列相似性，前者參與鐵缺乏、氧化脅迫、熱激或鹽脅迫下的調(diào)節(jié)[17-19]．這表明藍(lán)細(xì)菌中IsiA在脅迫下的調(diào)控發(fā)揮重要作用．大多數(shù)FeoB相關(guān)蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在N-末端具有典型的ATP結(jié)合基序，其基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞利用亞鐵的能力顯著降低．Ssr2333是一種未知的蛋白質(zhì)，但與FeoB的相關(guān)性最高，這表明Ssr2333可能也屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白．未知蛋白Sll0422和CphB（藻青素酶）具有最高的相關(guān)性，CphB可以水解-Asp-Arg鍵，其也與細(xì)菌的碳利用有關(guān)[20]．這一系列基因在集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803應(yīng)對脅迫時(shí)的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證．因此，應(yīng)構(gòu)建并篩選基因的缺失和過表達(dá)菌株，觀察其在不同脅迫下的生長，進(jìn)而判斷基因?qū)λ{(lán)細(xì)菌抗逆性的影響．若突變體的表型有明顯變化，則可通過轉(zhuǎn)錄組測序來進(jìn)一步確定該基因在各脅迫下的調(diào)控機(jī)制．

綜上所述，本文從集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803的不同轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中鑒定了響應(yīng)不同非生物脅迫的CDGs．KEGG分析顯示，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氮代謝、氨基酸代謝和碳固定等代謝途徑與非生物脅迫相關(guān)．本文鑒定了9個(gè)在營養(yǎng)缺乏下共同表達(dá)的CDGs，并基于PPI網(wǎng)絡(luò)分析揭示了可能在藍(lán)細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)作為重要調(diào)節(jié)因子的假定蛋白質(zhì)．此研究將為了解藍(lán)細(xì)菌對非生物應(yīng)激反應(yīng)的通用信號奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)．

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Analysis of core genes associated with abiotic stress response insp. PCC 6803

CHENG Yarui1，HUANG Shipeng1，ZHANG Tianyuan2，ZHANG Jianmeng1，WANG Fengjian1

（1. School of Chemistry and Environmental Engineering，Hanjiang Normal University，Shiyan 442000，China；2. School of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Multiple sets of transcriptome datasets ofsp. PCC 6803 was applied to identify core differential genes（CDGs）under abiotic stress．Results showed that 9 co-expressed CDGs responsive to nitrogen，iron，carbon and phosphorus deficiency were identified．The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）analysis showed that nitrogen metabolism，ABC transporters，and amino acid metabolism were related to nutrient deficiency．The co-expressed CDGs were also identified under heat shock，the ABC transporters and carbon fixation were also related to heat stress．At the same time，a protein-protein interaction network of CDGs was constructed to predict the possible response mechanism of genes in response to stress．These candidate gene libraries will help accelerate the understanding of the regulatory patterns of cyanobacteria under various stresses．

sp. PCC 6803；abiotic stress；core differential genes；KEGG；protein-protein interaction

1007-9831（2023）11-0050-06

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.11.010

2023-07-08

漢江師范學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（XJ2022A02）；湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210518023）；漢江師范學(xué)院一般項(xiàng)目（XJ2022030）

程亞蕊（1994-），女，河南信陽人，講師，博士，從事微生物多樣性和生物信息學(xué)研究．E-mail：chengyarui@hjnu.edu.cn

王鋒尖（1976-），男，江西高安人，教授，博士，從事微生物生態(tài)學(xué)研究．E-mail：13972500499@163.com