金中淦 居 漪 張素潔

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）每增加5 μmol/L，缺血性心臟病的風險會增加84%[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是腦卒中的獨立危險因素，高于10.50 μmol/L人群的卒中風險可增加4.2倍[2]；Hcy檢測結(jié)果準確與否，關(guān)系著臨床對患者病情的正確判斷。相關(guān)標準[3-4]要求用參考測量程序或參考物質(zhì)驗證常規(guī)檢驗結(jié)果的準確性，實驗室應(yīng)制定適宜的正確度驗證計劃，采用有證參考物質(zhì)、正確度控制品等進行正確度驗證，或與參考方法進行結(jié)果比對，從而保證檢驗結(jié)果的計量學溯源性。通過參考測量程序賦值的正確度質(zhì)控品，可將臨床實驗室的結(jié)果溯源到國際單位，實現(xiàn)臨床實驗室結(jié)果可比[5-6]。2021年，上海市臨床檢驗中心第1次開展Hcy正確度驗證計劃。本研究通過分析此次正確度驗證計劃數(shù)據(jù)，了解上海市臨床實驗室Hcy 檢驗質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院無溶血和脂血臨床檢驗剩余新鮮血清樣本，離心、過濾后制備成高、低2個濃度水平正確度調(diào)查品，分別編號為HCY2021-A、HCY2021-B，每支0.45 mL。根據(jù)《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[7]評估調(diào)查品的均一性和穩(wěn)定性。本次Hcy正確度驗證計劃參加實驗室共87家，包括醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室和部分企業(yè)醫(yī)學實驗室。

1.2 標準物質(zhì)

1）參考方法賦值時采用的有證參考物質(zhì)為美國國家標準技術(shù)研究院NIST SRM 1950和中國計量科學研究院GBW 09863，均于-70 ℃保存，室溫平衡后使用。2）Hcy純品物質(zhì)購自上海甄準生物公司，純度為99.8%，不確定度為±2%，為參考測量程序賦值過程中使用的校準品；D4-Hcy標記物購自加拿大C/D/N ISOTopes公司，同位素豐度為98.6%。

1.3 儀器和試劑

API 5000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB sciex公司），Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），XP205天平（德國梅特勒-托利多公司），Thermo Reacti-Therm氮吹儀（美國賽默飛世爾科技公司）。乙腈（LC/MS級）、三氟乙酸等購自美國Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 正確度調(diào)查品的發(fā)放和數(shù)據(jù)回報

采用冷鏈（干冰）將正確度調(diào)查品送至87家參評實驗室，實驗室收到調(diào)查品（每個濃度水平各3支）后立即存放在-20 ℃冰箱中，按照各實驗室的標準操作規(guī)程測定，每個濃度調(diào)查品重復測定3次，連測3 d，共需回報18個數(shù)據(jù)。通過上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價管理平臺回報檢測方法（原理）、試劑、儀器、結(jié)果等信息。

1.4.2 參考測量程序賦值

用上海市臨床檢驗中心參考實驗自建的同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜參考測量程序[8]進行賦值。校準物、有證參考物質(zhì)、樣本均進行3個批次重復前處理，每批次重復測定9次，以均值作為最終有效數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學方法和評價標準

通過上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價管理平臺進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，以樣本均值為統(tǒng)計值，分析各參評實驗室測定結(jié)果與靶值的偏移、實驗室內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和按不同試劑分組后的偏移、實驗室內(nèi)CV。以1/2允許總誤差（allowable total error，TEa）（≤10%）評價回報結(jié)果的合格率。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查品均勻性和穩(wěn)定性

分裝完畢后，分別隨機挑選2個濃度水平調(diào)查品中的10支進行均勻性檢測，以s≤0.3σ為評價標準，HCY2021-A、HCY2021-B的不均勻s分別為0.12、0.16 μmol/L；正確度驗證調(diào)查品運輸過程均有溫度監(jiān)控，評估HCY2021-A、HCY2021-B 2個濃度水平調(diào)查品-20 ℃存放1個月的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果分別為0.16、0.11 μmol/L，均低于相應(yīng)0.3σ對應(yīng)的0.37和0.62 μmol/L，滿足相關(guān)指南[7]對能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性的要求。

2.2 參考測量程序賦值結(jié)果

HCY2021-A和HCY2021-B參考測量程序賦值結(jié)果分別為（10.82±0.31）和（19.16±0.48）μmol/L。每個分析批同時測定了NIST SRM 1950（8.50±0.20）μmol/L，GBW 09863（17.9±0.7）μmol/L，測定結(jié)果均在靶值±不確定度范圍內(nèi)。

2.3 參評實驗室回報結(jié)果分析

2.3.1 不同實驗室數(shù)據(jù)與靶值的相對偏移和實驗室內(nèi)CV

2021HCY-A和2021HCY-B測定結(jié)果與靶值的偏移分別為-20.21%～31.39%和-29.66%～23.93%。2021HCY-A測定結(jié)果實驗室內(nèi)CV為0.28%～9.44%，有14.9%（13/87）的實驗室CV＞1/3 TEa，有34.5%（30/87）的實驗室CV＞1/4 TEa；2021HCY-B測定結(jié)果實驗室內(nèi)CV為0.25%～10.69%，有6.9%（6/87）的實驗室CV＞1/3 TEa，16.1%（14/87）的實驗室CV＞1/4 TEa。見圖1、圖2。

圖1 單個實驗室檢測結(jié)果與靶值的偏移

圖2 單個實驗室檢測結(jié)果的實驗室內(nèi)CV

2.3.2 不同試劑組的偏移和組內(nèi)不精密度

按試劑進行分組，2021HCY-A、2021HCY-B測定結(jié)果與靶值的偏移分別為-25.33%～20.27%、-18.41%～23.00%；見圖3。有20.59%（7/34）的試劑2個濃度調(diào)查品檢測結(jié)果與靶值的偏移均＞10%。試劑品牌超過5家的實驗室檢測結(jié)果顯示，同一品牌實驗室間CV為1.93%～12.91%，與靶值的偏移為1.01%～11.61%；見表1。

表1 不同試劑品牌檢測均值與靶值的偏移和CV

圖3 不同試劑組檢測結(jié)果均值與靶值的偏移

2.3.3 參評實驗室合格率

參評實驗室2個濃度水平調(diào)查品合格率分別為62.07%、65.52%。見表2。

表2 正確度調(diào)查合格率

3 討論

Hcy水平升高與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如心腦血管疾病、腎臟疾病、老年癡呆、認知障礙、高血壓、糖尿病[9-10]。一項基于2018年我國腦卒中高危人群篩查項目的研究發(fā)現(xiàn)，我國≥40歲的居民中，近1.8億人有高Hcy血癥，高血壓伴高Hcy血癥者發(fā)生腦卒中的風險增加75.2%[10-11]。臨床研究的結(jié)論是基于實驗室的檢測結(jié)果，而臨床實驗室在采用不同測量原理、測量方法的商品化試劑盒測量相同檢驗指標時，不可避免地會帶來檢驗結(jié)果可比性問題。目前，Hcy檢測方法有乳膠增強散射比濁法、酶聯(lián)免疫法、熒光偏振免疫法、化學發(fā)光免疫分析法、色譜質(zhì)譜法、循環(huán)酶法，臨床使用最廣泛的是循環(huán)酶法。因此，Hcy 的檢測質(zhì)量值得關(guān)注。

相關(guān)實驗室質(zhì)量管理文件和我國政府部門發(fā)布的檢驗結(jié)果互認的相關(guān)文件均要求臨床實驗室建立適當方法解決臨床檢驗結(jié)果的溯源性問題，其方法之一就是參加正確度驗證計劃。正確度驗證計劃相對常規(guī)室間質(zhì)量評價而言是比較理想的一種質(zhì)量評價方法，室間質(zhì)量評價質(zhì)控品制備時會加入一定的穩(wěn)定劑，可能會存在一定的基質(zhì)效應(yīng)；正確度驗證計劃使用的調(diào)查品非常接近臨床樣本，分析靶值由參考測量程序測定，不易受基質(zhì)效應(yīng)、方法特異性等因素影響，且實驗室多次重復測定，可不考慮隨機誤差的影響。本實驗室建立的Hcy參考測量程序，近幾年參加國家參考實驗室網(wǎng)絡(luò)比對，均取得較好的成績，為開展正確度驗證計劃工作奠定了良好基礎(chǔ)。

本研究通過分析上海市臨床檢驗中心第1次Hcy正確度驗證計劃參評實驗室回報數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)2021HCY-A、2021HCY-B測定結(jié)果與靶值的偏移分別為-20.21%～31.39%、-29.66%～23.93%，總體情況均不理想。2011-2016年全國Hcy室內(nèi)質(zhì)量控制的調(diào)查結(jié)果顯示，如以1/3 TEa為標準，實驗室的通過率低于80%；以1/4 TEa為標準，實驗室通過率僅為52.9%～58.7%，表明Hcy項目正確度并不令人滿意[9]。本研究結(jié)果表明，就精密度而言，2021HCY-A測定結(jié)果實驗室內(nèi)CV為0.28%～9.44%，有14.9%的實驗室CV＞1/3 TEa，有34.5%的實驗室CV＞1/4 TEa；2021HCY-B測定結(jié)果實驗室內(nèi)CV為0.25%～10.69%，有6.9%的實驗室CV＞1/3 TEa，16.1%的實驗室CV＞1/4 TEa，精密度優(yōu)于全國水平[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，8 7 家實驗室使用了3 4 種試劑，不同試劑品牌的檢測結(jié)果差異較大，2021HCY-A、2021HCY-B測定結(jié)果與靶值的偏移分別為-25.33%～20.27%、-18.41%～23.00%，有20.59%的試劑2個濃度水平調(diào)查品檢測結(jié)果與靶值的偏移均＞10%，正確度值得關(guān)注。本研究分析了使用同一品牌試劑超過5家的實驗室數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)用品牌3的實驗室均值與靶值的偏移＜10%，但是實驗室間CV均＞10%，表明某些品牌試劑組組內(nèi)CV較大，后續(xù)在檢測結(jié)果一致性方面需要加強，只有提高了檢驗結(jié)果的一致性，正確度才有意義。值得注意的是，試劑品牌1實驗室均值與靶值的偏移、實驗室間CV＜5%，結(jié)果的正確度和試劑性能穩(wěn)定性均表現(xiàn)較好。

本研究以參考方法定值結(jié)果為靶值，以1/2 TEa（≤10%）為評價標準，2個濃度水平調(diào)查品臨床實驗室的合格率分別為62.07%、65.52%，提示上海市Hcy項目正確度水平還需改進。實驗室加強全面質(zhì)量管理是提高檢驗結(jié)果準確性的必要條件。本次調(diào)查中，部分實驗室測量結(jié)果的精密度較差，這可能會導致部分測量結(jié)果不能真實體現(xiàn)實驗室測量結(jié)果的正確度。保證正確度的前提是實驗室方法要有較好的精密度，解決了精密度問題后，實驗室應(yīng)逐一排查，發(fā)現(xiàn)問題并加以改進，如校準品是否具有溯源性、校準品的定值是否可靠、檢驗方法的特異性，試劑的有效期、人員操作、儀器設(shè)備問題。另外，實驗室應(yīng)盡可能選用經(jīng)驗證、有溯源性的配套校準品，確保其使用的校準品可追溯到最高水平，以保證檢驗結(jié)果的準確、可靠。本研究使用無基質(zhì)效應(yīng)的血清樣本，可以更準確地反映不同系統(tǒng)間檢測結(jié)果的差異，為臨床實驗室提供參考[13]。為了提高Hcy檢驗結(jié)果的準確性和可比性，仍需要試劑廠商、臨床實驗室和質(zhì)量監(jiān)督管理機構(gòu)的共同努力。

綜上所述，通過本次正確度驗證計劃參評實驗室回報數(shù)據(jù)可以看出，上海市臨床實驗室Hcy項目檢驗正確度還有待改進。