吳啟文,姚葉萍

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院感染科,廣東 廣州 511300)

急性肺損傷是由感染、創(chuàng)傷等多種原因引起的肺部急性嚴(yán)重疾病,其中感染是主要因素[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡參與急性肺損傷過(guò)程,其可能機(jī)制是由NLRP3炎性體信號(hào)通路介導(dǎo)[2]。感染誘導(dǎo)的ALI目前抗生素是主要治療方法,但是由于抗生素的不合理應(yīng)用,細(xì)菌耐藥率不斷升高,甚至出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌,引起了高度重視。因此中醫(yī)藥在治療ALI方面的彰顯治療價(jià)值。研究證實(shí)姜黃素在預(yù)防及治療肺損傷中具有一定的保護(hù)作用,可減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠炎性反應(yīng),其關(guān)鍵分子靶點(diǎn)可能與 THF-β1/SMAD、Akt/Erk、MAPK/NF-κB、Notch2/Hes-1、TLR4/MyD88/NF-κB等多條信號(hào)通路相關(guān)[3-5]。目前關(guān)于姜黃素在感染性ALI中調(diào)控細(xì)胞焦亡機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此,本研究將在LPS/尼日利亞菌素誘導(dǎo)ALI細(xì)胞模型中研究姜黃素通過(guò)阻斷NLRP3炎性體信號(hào)通路抑制細(xì)胞焦亡改善ALI的作用及機(jī)制,旨在為發(fā)現(xiàn)姜黃素治療ALI的可能性及機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞:大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383,購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑:姜黃素購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS)購(gòu)自Biosharp公司;F12K培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司);雙抗(鏈霉素+青霉素)購(gòu)自思拓凡生物科技有限公司;尼日利亞菌素購(gòu)自麥克林公司;BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司;CCK-8購(gòu)自日本同仁化工;NLRP3抗體(Anti-NLRP3 antibody)、 Caspase-1+p10+p12抗體(Anti-pro Caspase-1+p10+p12 antibody)、GSDMD抗體(Anti-GSDMD antibody)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;磷酸酶抑制劑購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司,本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組及模型建立:大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383在含有10%胎牛血清、80%F12K培養(yǎng)基中培養(yǎng),消化傳代后接種12 h后進(jìn)行分組,分為空白對(duì)照組、姜黃素組、LPS 組、LPS+姜黃素組、LPS+尼日利亞菌素處理組、LPS+尼日利亞菌素+姜黃素處理組,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加藥處理,給藥方法如下:①空白對(duì)照組:使用預(yù)先加入10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基正常培養(yǎng),不使用任何藥物刺激;②姜黃素組:使用預(yù)先加入10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基正常培養(yǎng),加入10 μmol/L姜黃素進(jìn)行刺激,2 h后進(jìn)行檢測(cè)。③LPS 組:更換無(wú)血清培養(yǎng)基12 h后,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),2 h后進(jìn)行檢測(cè)。④LPS+姜黃素組:更換無(wú)血清培養(yǎng)基12 h后,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入姜黃素(終濃度為10 μmol/L)和LPS溶液(終濃度為100 ng/ml)進(jìn)行刺激,2 h后進(jìn)行檢測(cè)。⑤LPS+尼日利亞菌素處理組:更換無(wú)血清培養(yǎng)基12 h后,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),4 h后實(shí)驗(yàn)孔加入尼日利亞菌素溶液(終濃度為10 μmol/ml),2 h后收細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。⑥LPS+尼日利亞菌素+姜黃素處理組(3個(gè)重復(fù)):更換無(wú)血清培養(yǎng)基12 h后,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入姜黃素(終濃度10 μmol/L)和LPS溶液(終濃度為100 ng/ml),4 h后實(shí)驗(yàn)孔加入尼日利亞菌素溶液(終濃度為10 μmol/ml),2 h后收細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞的活力:大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞,正常復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清、80%F12K培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng),每2～3天傳代1次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞NR8383離心處理,800 r/min,10 min,離心后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),之后接種于96孔板中,每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞,每孔加100 μl的細(xì)胞培養(yǎng)液。接種12 h后進(jìn)行分組,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加藥處理,6個(gè)孔/組。各組分別加入相應(yīng)的藥物或試劑后,置培養(yǎng)板于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h。2 h后加入CCK-8進(jìn)行反應(yīng),3 h檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值。

1.2.3Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平:大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞接種在196孔培養(yǎng)板內(nèi),各組給藥2 h后棄去培養(yǎng)基,加入裂解液提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白,根據(jù)蛋白濃度的檢測(cè)結(jié)果將含有20 μl蛋白的樣本用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè),依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)PVDF膜、5% 脫脂牛奶封閉、特異性一抗孵育、辣根過(guò)氧化物酶二抗孵育,最后在顯影系統(tǒng)內(nèi)采用電化學(xué)發(fā)光法曝光得到目的 蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD 及內(nèi)參蛋白的條帶,根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn);計(jì)量資料數(shù)據(jù)方差齊,或數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差齊,則采用組間兩兩比較的單因素方差分析方法;若數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊,采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。百分率的比較采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1姜黃素對(duì)LPS和尼日利亞菌誘導(dǎo)焦亡細(xì)胞增殖率的影響:胞培養(yǎng)在有血清的情況下,與空白組(0.977±0.088)相比,姜黃素(1.111±0.106)提高細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清的情況下,與LPS組(0.746±0.026)相比,LPS+姜黃素組(0.674±0.036)降低細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);同時(shí)在無(wú)血清的情況下,與LPS+尼日利亞菌素組(0.138±0.003)相比,LPS+姜黃素+尼日利亞菌素組(0.144±0.006)提高細(xì)胞活力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),促進(jìn)細(xì)胞增殖。

2.2Western印跡檢測(cè)姜黃素對(duì)LPS和尼日利亞菌誘導(dǎo)焦亡細(xì)胞NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)情況:與空白對(duì)照組比較,姜黃素組細(xì)胞的Caspase-1略微降低,NLRP3和GSDMD均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。與LPS組比較,姜黃素+LPS組細(xì)胞的NLRP3、Caspase-1兩個(gè)凋亡蛋白均上升,GSDMD凋亡蛋白均下降。與LPS+尼日利亞菌素組比較,LPS+尼日利亞菌素+姜黃素組細(xì)胞的NLRP3、Caspase-1、GSDMD三個(gè)凋亡蛋白均一致下降,而且下降幅度較大,提示在這個(gè)模型的條件下,姜黃素有抑制細(xì)胞凋亡的作用。見(jiàn)圖1。

圖2 Western印跡法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

ALI是常見(jiàn)的臨床危及重癥,關(guān)于ALI的發(fā)病機(jī)制以及治療ALI是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。感染是ALI常見(jiàn)的發(fā)生因素,其中內(nèi)毒素脂多糖是重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡與機(jī)體在病原體感染時(shí)的炎性反應(yīng)有密切的關(guān)系。細(xì)胞焦亡是經(jīng)由Gasdermin家族蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜膜孔形成的可調(diào)控性細(xì)胞死亡,經(jīng)常但并不總因炎性反應(yīng)性Caspase的活化而完成[6]。肺泡巨噬細(xì)胞約占肺內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)的 95%,巨噬細(xì)胞焦亡可以上調(diào)炎性反應(yīng)水平,進(jìn)一步加重免疫反應(yīng)失控,參與ALI的發(fā)展進(jìn)程[7]。

姜黃素是姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種脂溶性酚類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示:姜黃素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路的關(guān)鍵分子靶點(diǎn),發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗病毒、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等活性,從而保護(hù)臟器功能[8-11]。

細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要的免疫反應(yīng),能快速清除各種病原微生物,限制病菌生長(zhǎng),在拮抗感染和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮重要作用[12-14]。Rühl S及Kayagaki N等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),焦亡能發(fā)生在括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌等感染宿主細(xì)胞的細(xì)菌上,同時(shí)破壞細(xì)菌和宿主細(xì)胞,周?chē)幢桓腥镜慕】导?xì)胞則無(wú)任何損傷[15-16]。本研究提示姜黃素可能抑制感染細(xì)胞增殖的能力,從而加速機(jī)體清除病原。

2018年Kambara等[17]發(fā)現(xiàn)不依賴(lài)Caspase酶切割 GSDMD引發(fā)中性粒細(xì)胞焦亡現(xiàn)象,揭示細(xì)胞焦亡發(fā)生由其識(shí)別水解的底物 Gasdermin家族蛋白決定,不由Caspase 酶決定。本研究提示LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡損傷模型中,姜黃素可以通過(guò)非NLRP3-Caspase-1途徑通過(guò)下調(diào)GSDND蛋白,從而抑制細(xì)胞焦亡,具體機(jī)制尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

GSDMD蛋白介導(dǎo)細(xì)胞焦亡過(guò)度發(fā)生的伴隨大量的包括IL- 1β、IL-18等炎性細(xì)胞因子的釋放,因此過(guò)度的焦亡可能誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎性反應(yīng),機(jī)體可能出現(xiàn)敗血癥等嚴(yán)重不良反應(yīng)[18-19]。本研究結(jié)果提示在這個(gè)細(xì)胞焦亡劇烈的條件下,姜黃素有通過(guò)NLRP3炎性體信號(hào)通路抑制細(xì)胞焦亡的作用。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能夠顯著減輕 LPS/尼日利亞菌素所致致肺泡巨噬細(xì)胞的焦亡反應(yīng),其機(jī)制可能與其抑制抑制NLRP3炎性體信號(hào)通路有關(guān)。本研究存在不足之處,未同時(shí)進(jìn)行IL- 1β、IL-18炎性因子的檢測(cè)。目前細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制仍在進(jìn)一步探索中,姜黃素在生物體內(nèi)的安全性如何,作用的具體的分子機(jī)制如何,均需更多的研究深入探討。