陳彩霞，黃敏，趙怡，曹傳取，王吉升，史志話，汪葛峰，高俊山

（1安徽農業(yè)大學生命科學學院，合肥 230036；2合肥華綠種苗有限公司，合肥 230041）

0 引言

秋海棠屬為全球第六大屬被子植物，目前已知近2050種物種，也是世界著名的觀賞花卉[1-4]。大花海棠‘比哥’是多年生草本花卉，隸屬于秋海棠科秋海棠屬，是德國班納利(Benary)種子公司選育出來的雜交一代品種，以四季秋海棠和竹節(jié)秋海棠為主要親本的雜種后代[5-6]?！雀纭盗邪慈~色和花色可分為綠葉紅花型、銅葉紅花型、銅葉玫紅花型?！雀纭盗衅贩N結合了多種秋海棠的優(yōu)點，具有早花、花大、花多、花葉顏色豐富、花期長、抗性強以及枝葉繁茂等優(yōu)點，曾榮獲“2008年莫斯科國際花展特別大獎”。

大花海棠是理想的室內外觀花盆栽，一般用于園林花帶、花鏡、花壇以及室內花盆或花籃種植，美化室內外環(huán)境，同時也是花園及綠地大面積群植的優(yōu)良品種，具有較高的觀賞和經濟價值，開發(fā)前景廣闊[7]。目前，大花海棠僅在景觀應用、栽培管理技術[8]以及扦插繁殖[9]等方面有報道，關于其組織培養(yǎng)快速繁殖方面尚無報道。大花海棠仍采用傳統(tǒng)的有性繁殖，雜交F1代具有較高的雜種優(yōu)勢，田間生長性狀良好，如果自留種，其F2代發(fā)生性狀分離，且種子發(fā)芽率低，不能保持親本的優(yōu)良特性，所以一般不用F2代種子播種。市場調查發(fā)現(xiàn)，國內種植的大花海棠主要依賴進口，一粒種子價格高達0.7～0.8 元，大大增加了花卉企業(yè)的成本。鑒于此，本研究采用不同植物激素配比，篩選適合大花海棠組織培養(yǎng)快繁的培養(yǎng)基，建立大花海棠組織培養(yǎng)再生體系，旨在為大花海棠離體快速繁殖提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料選擇與外植體消毒

試驗于2021 年8 月—2022 年10 月在安徽農業(yè)大學生命科學學院植物細胞工程實驗室進行。選取大花海棠品種‘比哥’系列的綠葉紅花型為試驗材料，種植于合肥華綠種苗有限公司智能化溫室，當植株長到40～50 cm高后，選擇園藝性狀表現(xiàn)好的植株作為母本。采集剛展開的葉片，并將其用自來水流水沖洗30 min，置于超凈工作臺，首先用70%酒精消毒10 s，再用蒸餾水沖洗2 次，接著用0.1%的升汞消毒8 min，最后用蒸餾水沖洗5 次，沿著主葉脈方向切成1 cm×1 cm 大小的葉片組織，接種到不定芽分化培養(yǎng)基上[10-12]。

1.2 主要儀器

試驗使用的主要儀器包括FST-IV-20 普利菲爾超純水儀（上海富詩特儀器設備有限公司）、YP3002電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、HVE-50 高壓滅菌鍋（平山加工株式會社日本）、SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、PHS-3E型號PH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、金尼克超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）、接種器械滅菌器（濟南格艾特儀器設備有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基配制

1.3.1 不定芽分化培養(yǎng)基誘導不定芽分化的基礎培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、2.4-D 和NAA，一共設計9 種(B1～B9)培養(yǎng)基配方（表1）。每種培養(yǎng)基接種60片葉片，每3片葉片接種在同一瓶培養(yǎng)基內，共計20瓶，接種8周后觀察不定芽分化情況，分別統(tǒng)計愈傷誘導率和不定芽誘導率，如式(1)～(2)[13]，其中，發(fā)生不定芽的外植體數(shù)包括同時發(fā)生不定芽和愈傷組織的外植體。

表1 誘導不定芽分化的培養(yǎng)基配方

1.3.2 不定芽增殖培養(yǎng)基將分化培養(yǎng)基中已分化的不定芽切割下來，接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖基本培養(yǎng)基為MS附加不同濃度的6-BA和NAA，共設計9種(P1～P9)培養(yǎng)基配方（表2）。每種培養(yǎng)基接種120團芽，每6團芽接種在一瓶培養(yǎng)基內，共計20瓶，4周繼代1次，觀察不定芽增殖情況，并統(tǒng)計增殖系數(shù)，如式(3)。

表2 不定芽增殖培養(yǎng)基配方

1.3.3 組培苗生根培養(yǎng)基將高度大于2.5 cm 單株組培苗切下，接種到生根培養(yǎng)基中，生根基本培養(yǎng)基為1/2MS 和MS，附加不同濃度的IBA 和NAA，共設計8種(R1～R8)培養(yǎng)基配方（表3）。每種培養(yǎng)基接種100 株苗，每5株組培苗接種在同一瓶培養(yǎng)基內，共計20瓶，4周后觀察其生根情況，統(tǒng)計生根數(shù)，如式(4)。

表3 生根培養(yǎng)基配方

1.4 培養(yǎng)條件

研究采用的培養(yǎng)基中含有25 g/L 蔗糖和7 g/L 瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)室溫度(26±2)℃，光照2000～3000 lx，每天光照12 h、黑暗12 h，培養(yǎng)室相對空氣濕度70%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2010 整理后采用DPS 軟件進行方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 大花海棠愈傷組織誘導和不定芽分化

如表4所示，外植體在大部分培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d均長出愈傷，但是單獨使用6-BA無法獲得愈傷，只是原組織無效膨大，隨著6-BA濃度的升高，外植體死亡速度加快（圖1A～B）。當6-BA 和2.4-D 同時使用，誘導出愈傷并完成分化，且2 種激素比值在10:1 時，愈傷組織誘導率和芽分化率較高，分別為100%和85%以上（圖1E、H），比值偏低或偏高都影響愈傷組織誘導和芽分化，甚至導致死亡（圖1C～D）。當6-BA、2.4-D和NAA 3 種激素同時使用（B8組合），愈傷誘導速度最快，芽分化速度最快，效果最好，愈傷組織誘導率、芽分化率分別為100%、92.4%（圖1H）。因此最佳不定芽分化的培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L 2.4-D+0.2 mg/L NAA。

圖1 不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導和不定芽分化的影響

2.2 大花海棠不定芽增殖

如表5 所示，隨著6-BA 濃度的升高，不定芽分化速度和增殖倍數(shù)提高，當6-BA濃度達到1 mg/L時，芽生長勢快，而且植株強壯（圖2B～D），當6-BA 濃度達到3 mg/L時，分化芽最多，但是芽長勢減弱，并出現(xiàn)玻璃化（圖2I）。提高NAA濃度易生成根，根生成后不定芽增殖速度減慢，但是不定芽也變強壯。當植物激素6-BA和NAA同時使用，不定芽增殖系數(shù)為4.5～7.5，雖然P2組合不定芽增殖系數(shù)不是最高，但是不定芽長勢表現(xiàn)最佳（圖2B），最佳不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表5 不同激素配比對不定芽繼代增殖的影響

2.3 大花海棠組培苗生根

大花海棠組培苗培養(yǎng)4 周后組培苗長勢如表6 所示。當基本培養(yǎng)基為1/2MS、激素為IBA時，IBA濃度的升高對大花海棠生根有促進作用，但是也對根系有毒害作用，后期抑制其發(fā)育。當基本培養(yǎng)基為1/2MS、激素為NAA 時，NAA 濃度的升高促進了大花海棠生根，根系多且質量好，R8組合根數(shù)量最多，每株達10條以上（圖3）。綜上所述，最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+1.0 mg/L NAA。

圖3 不同培養(yǎng)基對組培苗生根的影響

3 結論

本研究總結了一套大花海棠快繁再生體系的完整方案。以葉片為外植體，大花海棠組織培養(yǎng)再生體系最佳的不定芽分化培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2.4-D+ 0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)6 周后分化率高達92.4%。6周后再將不定芽按團塊方向性切割下來，繼代到增殖培養(yǎng)基上，最佳的不定芽繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA，增殖系數(shù)為6.6。根據(jù)生產需要進行增殖，每4周繼代1次，叢生芽多，而且芽粗壯，無玻璃化。將植株高度達2.5 cm 以上的單株芽接種到生根培養(yǎng)基上，最佳的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+1.0 mg/L NAA，其根系數(shù)量可達10 條以上，而且根質量好，當組培生根苗根長達到1.5 cm 以上時可移栽馴化。研究結果可為大花海棠的大規(guī)模培養(yǎng)、繁殖及轉基因遺傳轉化提供理論依據(jù)。

4 討論

理論上植物體細胞具有全能性，經體外培養(yǎng)后，在激素作用下進行重編程，通過細胞脫分化和再分化發(fā)育成為一個獨立的植株[14]。但實際應用上，植物的品種和器官分化能力不同，選擇合適的外植體是產生優(yōu)質再生植株的前提。張悅圓等[15]研究表明，雙腺藤快繁再生選擇帶腋芽的莖段作為外植體優(yōu)于頂芽；李丹等[16]研究蟆葉秋海棠發(fā)現(xiàn)葉片的愈傷組織誘導效果優(yōu)于葉柄；鄭志勇[17]則選擇莖段誘導中華秋海棠不定芽。本研究選擇葉片作為外植體，其分化能力強，且材料來源充足，采集時不傷害母本，故對于大規(guī)模工廠化組培生產種苗，葉片是理想的外植體材料。

增殖系數(shù)被認為是衡量組培苗繼代培養(yǎng)的重要指標，其受到諸多因素的影響，如培養(yǎng)基、光照、濕度、植物生長調節(jié)劑等，植物生長調節(jié)劑是影響增殖系數(shù)最關鍵的因素。一般來說，生長素和細胞分裂素比值高利于根形成，反之利于莖芽的發(fā)生。針對組培不同階段植物生長的需求，對激素種類和濃度進行篩選，是組培工作的重點和難點[18-19]。國內對于秋海棠科秋海棠屬植物研究植物生長調節(jié)劑對組培苗增殖系數(shù)的影響早已有相關報道，麗格海棠繼代增殖培養(yǎng)最佳植物激素配比為6-BA 2 mg/L+NAA 0～0.1 mg/L，增殖系數(shù)可達5.8[20]；李丹等[16]認為蟆葉秋海棠芽增殖激素濃度為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖系數(shù)可達6.8。但本研究發(fā)現(xiàn)大花海棠芽增殖時植物生長調節(jié)劑配比為6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖系數(shù)高達7.5。

合適濃度的糖和氮源有利于植物組培苗生根誘導。研究表明，低糖、低氨鹽培養(yǎng)基有利于多數(shù)植物試管苗生根[21-22]。蔗糖濃度不適合會引起異養(yǎng)無根苗的饑餓，或滲透壓低于或超出最適水平從而不利于生根，低鹽培養(yǎng)基可能是因為培養(yǎng)基中的氮源降低到了一個有利于試管苗生根的水平[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽培養(yǎng)基1/2MS 比高鹽培養(yǎng)基MS 更適合生根培養(yǎng)，而R8培養(yǎng)基的生根效果更好，可能是因為R8培養(yǎng)基的成分更適合大花海棠組培苗不定根的生長。生長素IAA、IBA和NAA常用于誘導生根，研究證明IAA在啟動不定根形成時起關鍵作用[24]，而IBA促進IAA的形成、運輸，間接促進生根[25]。NAA促進組培苗儲存的淀粉水解成為還原糖，有利于不定根的形成[26]。生長素的作用機理不同，因此對不同品種生根作用不同，本研究發(fā)現(xiàn)IBA和NAA對于生根的影響在一定濃度范圍內，高濃度促進生根，而NAA更適合大花海棠生根。

大花海棠組培再生體系的建立是一個復雜的過程，從愈傷組織誘導、不定芽分化、不定芽繼代增殖、最后到組培苗生根都是環(huán)環(huán)相扣，前一個階段生長長勢間接影響下一階段生長。從試驗結果看出，對于雙子葉植物大花海棠而言，單一的生長素不利于誘導愈傷，需要添加細胞分裂素，合適的細胞分裂素和生長素比例濃度促進脫分化及再分化[27]。從大花海棠組培苗繼代增殖可看出，此過程對激素較敏感，較低濃度的細胞分裂素6-BA 和NAA 便可滿足其生長需求，濃度過高無效芽增多，而且后期玻璃化嚴重。高濃度的IBA 對大花海棠組培苗生根前期形成有促進作用，但是后期抑制其發(fā)育，而NAA 為1.0 mg/L 時促進植株生長，根系發(fā)達。因此，組培再生是一個復雜的動態(tài)過程，在組培生產中應根據(jù)組培苗的長勢而調節(jié)培養(yǎng)基配方。