滿麗娟，葉佳佳，張德鋒，鄒籽華，黃琳娟，王仲孚，王承健

（1.陜西省天然多糖資源利用工程研究中心,西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710069；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安 710069）

糖基化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，人體中大多數(shù)蛋白質(zhì)均可能被O-（Ser/Thr殘基上）或N-（Asn 殘基上）糖基化修飾，其在多種生物學(xué)過程和疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［1，2］.研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致部分糖蛋白上糖鏈的結(jié)構(gòu)和數(shù)量也隨之發(fā)生變化，而這些異常表達(dá)的糖鏈有可能成為一類重要的腫瘤早期診斷生物標(biāo)志物或藥物治療特異性靶標(biāo)分子［3］.最典型的例子是多種癌癥細(xì)胞表面高表達(dá)的糖蛋白Mucin-1（MUC1），其O-糖鏈具有截?cái)喱F(xiàn)象，從而產(chǎn)生只由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)單糖殘基構(gòu)成的較短O-糖鏈，而在正常細(xì)胞上這些糖鏈并不表達(dá)或表達(dá)量極低［3～6］.其中，一個(gè)GalNAc通過α型O-糖肽鍵連接到Ser/Thr殘基上形成的結(jié)構(gòu)被稱為Tn抗原（GalNAc-α-Ser/Thr），而在Tn 抗原上通過β1，3 糖苷鍵連接一個(gè)Gal 殘基形成的結(jié)構(gòu)被稱為T 抗原（Galβ1，3GalNAc-α-Ser/Thr），是最常見的癌細(xì)胞糖鏈抗原，可被免疫系統(tǒng)特異性識(shí)別［5，6］.目前，已有大量研究利用此類癌細(xì)胞特異性糖類抗原結(jié)構(gòu)來合成糖肽類抗癌疫苗候選分子，使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防腫瘤或延緩腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間的目的.同時(shí)，與細(xì)胞毒性療法（如放療和化療）相比，這類免疫療法對(duì)人體副作用更小，因此已成為癌癥預(yù)防和治療中最有前景的手段之一［7～11］.然而，在糖肽疫苗合成過程中，所需關(guān)鍵原料Tn 抗原或T 抗原需要具有正確的異頭構(gòu)型，導(dǎo)致其合成難度較大，生產(chǎn)成本較高，影響了廣泛應(yīng)用.因此，對(duì)天然來源Tn 和T 抗原的開發(fā)利用成為一種重要替代途徑.

絲膠蛋白是蠶繭中的一種水溶性糖蛋白，占總重的15%～35%，是絲綢工業(yè)的副產(chǎn)品，主要存在于繅絲廠廢水中，產(chǎn)量較大，具有重要的回收利用價(jià)值［12，13］.早期研究發(fā)現(xiàn)，以蛋白酶對(duì)絲膠蛋白進(jìn)行水解可獲得帶有多個(gè)氨基酸殘基的糖肽，其中包括帶有單糖或二糖結(jié)構(gòu)的O-糖肽，并且通過化學(xué)方法和糖苷酶法降解后分析推測(cè)，這些O-糖肽具有與腫瘤細(xì)胞Tn 和T 抗原一致的小分子糖鏈結(jié)構(gòu)［14，15］.然而，由于所用分析手段的局限性，尚無更直接、更明確的絲膠蛋白完整O-糖鏈結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)，而且不同O-糖鏈的豐度分布情況仍不清楚，更缺乏對(duì)這一O-糖鏈資源進(jìn)行開發(fā)利用的相關(guān)技術(shù)方法.

基于此，本文以絲膠蛋白為研究對(duì)象，以電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）和在線液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Online LC-MS）為主要檢測(cè)手段，對(duì)其O-糖鏈的結(jié)構(gòu)、豐度分布及含量進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步建立了對(duì)其O-連接單糖進(jìn)行非還原性釋放和分離制備的新方法，發(fā)展了以其為原料通過鏈霉蛋白酶E（Pronase E）釋放制備Tn抗原和T抗原的新方法，為絲膠蛋白O-糖鏈資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)癌癥糖肽疫苗及靶向檢測(cè)試劑的合成制備有重要的潛在價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

家蠶蠶繭，初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品，四川藏曦堂生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氫氧化鈉（NaOH）、苯磺酰肼（BSH）、吉拉德試劑P（GP）和二甲亞砜（DMSO），分析純，德國Merck KGaA 公司；乙腈（ACN），色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司；PNGase F，純度≥95%（SDS-PAGE），德國Merck KGaA公司；鏈霉蛋白酶E（Pronase E），7000 U/g，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；C18固相萃取小柱，250 mg/4 mL，美國Waters 公司；多孔石墨碳（PGC）固相萃取小柱，250 mg/3 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

LC-2010A 型高效液相色譜（HPLC）儀，日本Shimadzu 公司；LTQ-XL 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）儀，美國Thermo Scientific公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 蠶繭絲膠蛋白的提取 參照文獻(xiàn)［16］方法，將2 g 蠶繭剪碎后用二次蒸餾水清洗3 次，加入400 mL二次蒸餾水，于100 ℃水浴中加熱40 min，冷卻過濾，將濾液減壓濃縮至50 mL，冷凍干燥后得到白色絲膠蛋白粉末.

1.2.2O-糖鏈的“一釜法”釋放及純化 參照文獻(xiàn)［17］報(bào)道的“一釜法”對(duì)絲膠蛋白O-糖鏈進(jìn)行釋放并同時(shí)進(jìn)行PMP標(biāo)記.將5 mg絲膠蛋白粉末溶于2 mL含2.5 mol/L PMP 和2.0 mol/L NaOH 的50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液中，置于80 ℃水浴中密閉反應(yīng)24 h.反應(yīng)結(jié)束后，將樣品溶液轉(zhuǎn)移至4 mL離心管中，用0.3 mL12 mol/L濃鹽酸將pH值調(diào)至中性，然后加入1.5 mL二氯甲烷萃取多余的PMP，再用20 μL冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4～5，并用二氯甲烷重復(fù)萃取2次.通過真空濃縮對(duì)所得上層清液進(jìn)行干燥，并用1 mL水復(fù)溶，用于C18固相萃取小柱分級(jí)純化.在純化過程中，先用體積分?jǐn)?shù)分別為20%和25%的ACN溶液各50 mL依次對(duì)C18固相萃取小柱進(jìn)行清洗，然后用12 mL ACN進(jìn)行活化，用15 mL水進(jìn)行平衡.加入樣品溶液并等待其被小柱充分吸附后，以6倍柱體積的水洗柱除鹽，再依次用25%和35%的ACN溶液各3 mL洗脫目標(biāo)物，洗出液經(jīng)離心濃縮儀干燥后在-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3O-糖鏈PMP 衍生物的全甲基化 參考文獻(xiàn)［18］方法，將100 mg 干燥的NaOH 顆粒研磨成粉末后加入1 mL 無水DMSO，充分混合均勻后將400 μL 該混合液加入冷凍干燥后的糖鏈樣品中，并加入100 μL 碘甲烷（CH3I），室溫下避光、振蕩反應(yīng)30 min.反應(yīng)結(jié)束后，加入1 mL 水終止反應(yīng)，然后加入1 mL 二氯甲烷，充分振蕩后以18313g的轉(zhuǎn)速離心3 min，棄去上層清液.向所得有機(jī)相中加入1 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，充分混合均勻后以18313g轉(zhuǎn)速離心3 min，棄去上層清液，重復(fù)此萃取操作3次.最后，將所得有機(jī)相減壓濃縮干燥，并用甲醇重新溶解，用于多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MSn）分析.

1.2.4O-糖鏈PMP 衍生物的反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離分析 采用Supersil ODS2 C18 反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對(duì)O-糖鏈PMP衍生物樣品進(jìn)行RP-HPLC分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=4.5），洗脫梯度：0 min，86%A+14%B；30 min，84%A+16%B.流速為0.8 mL/min.

1.2.5O-連接單糖的氨水催化法非還原性釋放 將10 mg絲膠蛋白置于10 mL密閉玻璃小瓶中，加入3 mL氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～28%）并搖勻，在一定溫度水浴中進(jìn)行反應(yīng)，最佳條件為40 ℃反應(yīng)16 h.反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)真空濃縮除去氨水，然后用1 mL水重新溶解樣品，用PGC固相萃取小柱進(jìn)行分級(jí)純化.在純化過程中，將樣品溶液加載到PGC 小柱上，收集洗出液并重復(fù)上樣3 次，然后用10 mL 水洗脫糖鏈，并以每管0.5 mL對(duì)洗出液進(jìn)行分部收集，最終通過ESI-MS進(jìn)行檢測(cè)分析.

1.2.6 還原性O(shè)-單糖的苯磺酰肼（BSH）衍生化 參照文獻(xiàn)［18］方法，將1 mg從絲膠蛋白中釋放的還原性O(shè)-糖鏈樣品和10 mg BSH溶解于1 mL乙醇/水/冰乙酸（體積比10∶9∶1）混合液中，搖勻后置于60 ℃水浴中反應(yīng)45 min，再加入1 mL二氯甲烷萃取過量的BSH，重復(fù)萃取操作3次，最后收集上層清液并干燥，用100 μL體積分?jǐn)?shù)為50%的ACN水溶液重新溶解，用于HPLC分離分析.

1.2.7O-單糖BSH 衍生物的親水相互作用液相色譜（HILIC）分離 用TSK-GEL Amide-80 酰胺柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對(duì)O-糖鏈BSH 衍生物樣品進(jìn)行HILIC 分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=4.5）溶液，流速為0.8 mL/min，洗脫梯度：0 min，86%A+14%B；30 min，84%A+16%B.對(duì)所有色譜峰組分分別進(jìn)行收集并干燥，以ESI-MS 檢測(cè)分析.

1.2.8 還原性O(shè)-單糖單體的再生 參照文獻(xiàn)［18］方法，將HILIC分離后收集到的O-糖鏈BSH衍生物組分溶于1 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的冰乙酸溶液中，在70 ℃反應(yīng)30 min.反應(yīng)結(jié)束后，加入2 mL 二氯甲烷，振蕩混合均勻并以18313g的轉(zhuǎn)速離心3 min，收集上層清液且重復(fù)萃取操作3次.最終將所得水相溶液減壓濃縮干燥并用水重新溶解，用于ESI-MS檢測(cè).

1.2.9 絲膠蛋白源Tn 和T 抗原的Pronase E 水解法釋放及純化 參照文獻(xiàn)［19］報(bào)道的反應(yīng)條件，將10 mg 絲膠蛋白和10 mg Pronase E 置于4 mL 離心管中，加入1 mL 1 mol/L（pH=8.0）磷酸鹽緩沖液溶解后，于37 ℃反應(yīng)24 h，然后以C18 固相萃取小柱進(jìn)行分級(jí)純化.在純化過程中，首先用5 mL ACN 對(duì)C18小柱進(jìn)行活化，再用10 mL水平衡，然后加載樣品溶液，并用20 mL水洗脫糖鏈，以每管0.5 mL對(duì)洗出液進(jìn)行分部收集，最終通過ESI-MS和MS/MS對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)分析.

1.2.10 質(zhì)譜分析條件 利用LTQ XL 線性離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行ESI-MS，MS/MS 和LC-MS分析.一級(jí)質(zhì)譜采用正離子模式掃描，質(zhì)荷比（m/z）范圍為100～2000，離子傳輸毛細(xì)管溫度為275 ℃，管透鏡電壓為350 V.二級(jí)質(zhì)譜（MS2）和多級(jí)質(zhì)譜（MSn）采用碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）方法進(jìn)行，歸一化碰撞能量設(shè)置為25.0～35.0，激活q值為0.25，激活時(shí)間為30 ms，其它質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置參照文獻(xiàn)［20］方法.以Supersil ODS2 C18反相色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）進(jìn)行在線LC-MS分析，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相A 和B 分別為ACN 和10 mmol/L 乙酸銨（pH=5.5），采用等度洗脫：0 min，19%A+81%B；70 min，19%A+81%B，流速為0.2 mL/min.此過程中質(zhì)譜參數(shù)同上.質(zhì)譜分析完成后，借助GlycoWorkbench軟件［21］對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析和注釋.

2 結(jié)果與討論

2.1 絲膠蛋白O-糖組的定性和定量分析

為了在已有研究［14，15］基礎(chǔ)上進(jìn)一步從完整分子的角度確定絲膠蛋白O-糖鏈的具體種類和結(jié)構(gòu)，采用“一釜法”［17］對(duì)其同時(shí)進(jìn)行了非還原性釋放與PMP標(biāo)記，樣品經(jīng)過富集純化后，以ESI-MS進(jìn)行檢測(cè)分析.由圖1（A）可見，在ESI-MS正離子模式下共檢測(cè)到4個(gè)質(zhì)譜峰，其中m/z552.33和574.33處分別為O-連接單糖HexNAc 的PMP 衍生物的［M+H］+和［M+Na］+信號(hào)峰，而m/z714.42 和736.42 處為分別為O-連接二糖HexHexNAc 的PMP衍生物的［M+H］+和［M+Na］+信號(hào)峰，表明絲膠蛋白中僅有這兩種O-糖鏈，而且都是小分子.相比之下，其它已報(bào)道的許多糖蛋白［22］中的O-糖鏈種類通常更加多樣，分子量也更大，與絲膠蛋白明顯不同.

Fig.1 Structural identification and quantification of intact O-glycans as PMP derivatives released from sericin by ESI-MS,MS/MS,RP-HPLC and LC-MS

為了從完整分子的角度解析絲膠蛋白O-連接二糖HexHexNAc 內(nèi)部的糖苷鍵連接方式，對(duì)“一釜法”釋放的O-糖鏈PMP衍生物全甲基化修飾后，以MSn進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1（B）所示.該糖鏈全甲基化衍生物的理論分子量為839，m/z62.50處為其［M+Na］+信號(hào)峰，將其作為母離子進(jìn)行MS2分析，產(chǎn)生的碎片離子m/z626.33（Y1）和644.33（Z1）均為糖苷鍵斷裂所形成的碎片峰.進(jìn)一步對(duì)m/z644.33（Z1）進(jìn)行MS3分析，獲得了碎片離子m/z510.33（0，3A1），其為該糖鏈中1，3-連接糖苷鍵的特征信號(hào)峰.根據(jù)O-糖鏈生物合成過程［23］以及相關(guān)文獻(xiàn)［15］報(bào)道可知，該糖苷鍵應(yīng)為β構(gòu)型，可以判斷該O-糖鏈的糖苷鍵為β1，3-連接.

為了確定絲膠蛋白O-連接單糖的種類以及不同O-糖鏈的豐度比例，以GlcNAc和GalNAc的PMP衍生物為參照標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)絲膠蛋白O-糖鏈PMP衍生物進(jìn)行了RP-HPLC定性定量分析，結(jié)果如圖1（C）所示.通過對(duì)比單糖PMP衍生物的保留時(shí)間發(fā)現(xiàn)，絲膠蛋白O-連接單糖HexNAc的PMP衍生物的保留時(shí)間與GalNAc的PMP衍生物保留時(shí)間高度一致，而與GlcNAc的PMP衍生物保留時(shí)間差異較大，因此可以確定絲膠蛋白中只存在一種O-連接單糖，即O-GalNAc.因?yàn)榻z膠蛋白中的O-糖鏈只有這一種核心單糖，所以結(jié)合文獻(xiàn)［15］報(bào)道可以判斷，其O-連接二糖的結(jié)構(gòu)應(yīng)為Galβ1，3GalNAc.由此可見，絲膠蛋白中含有與癌癥Tn抗原和T抗原相同的O-糖鏈結(jié)構(gòu).此外，通過對(duì)RP-HPLC洗脫組分進(jìn)行ESI-MS檢測(cè)確定了絲膠蛋白O-Galβ1，3GalNAc 的PMP衍生物所對(duì)應(yīng)的色譜峰，進(jìn)而通過色譜峰面積計(jì)算可知，絲膠蛋白中O-GalNAc與O-Galβ1，3GalNAc的豐度比約為5.3∶1.

為了進(jìn)一步測(cè)定這兩種O-糖鏈在絲膠蛋白中的含量，參照文獻(xiàn)［17］報(bào)道的O-糖鏈穩(wěn)定同位素試劑標(biāo)記及質(zhì)譜定量分析方法，向來源于5 mg絲膠蛋白的O-糖鏈PMP衍生物中加入0.11 μg GalNAc 標(biāo)準(zhǔn)品的氘代PMP（d5-PMP）衍生物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行LC-MS 定性定量分析，所得絲膠蛋白O-Gal-NAc的PMP衍生物的提取離子流圖（EIC）如圖1（D）所示.根據(jù)分析得到的內(nèi)標(biāo)與O-GalNAc的EIC峰面積比值計(jì)算可知，絲膠蛋白中O-GalNAc 的含量為1.58 μg/g，并且根據(jù)絲膠蛋白中不同O-糖鏈的豐度比值進(jìn)一步計(jì)算得出O-Galβ1，3GalNAc的含量為0.54 μg/g.以上結(jié)果為Tn抗原和T抗原的釋放提供了重要理論依據(jù).

2.2 絲膠蛋白還原性O(shè)-連接單糖的釋放及分離制備

在癌癥O-糖肽疫苗候選分子合成過程中，通常需要以單糖GalNAc為原料合成用于增強(qiáng)免疫響應(yīng)的糖簇配體［10，11］.為了從天然原材料中獲取高純度GalNAc，進(jìn)一步建立了一種在氨水中從絲膠蛋白中釋放制備還原性O(shè)-GalNAc 的新方法.首先，參考本課題組［24］已建立的氨水催化釋放糖蛋白N-糖鏈的反應(yīng)條件，將絲膠蛋白溶于體積分?jǐn)?shù)為25%～28%的氨水中，濃度為1 g/L，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為16 h，對(duì)不同溫度（25，30，35，40，45，50和55 ℃）下釋放并純化獲得的糖鏈產(chǎn)物進(jìn)行ESI-MS檢測(cè)，以GalNAc的質(zhì)譜峰信號(hào)強(qiáng)度為指標(biāo)來判斷其釋放效率，從而對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2（A）所示.可見，最佳反應(yīng)溫度為40 ℃，而繼續(xù)升高溫度時(shí)糖鏈產(chǎn)率反而會(huì)下降，其原因可能是產(chǎn)物發(fā)生了降解.在此最佳溫度下以類似方法進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)時(shí)間（4，8，12，16，20和24 h）進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖2（B）所示，最佳反應(yīng)條件下所釋放糖鏈樣品的質(zhì)譜圖如圖2（C）所示.由圖2（B）可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從4 h延長(zhǎng)至16 h，GalNAc 的釋放產(chǎn)率不斷升高，而反應(yīng)16 h 后產(chǎn)率不斷下降，因此最佳反應(yīng)時(shí)間為16 h.由圖2（C）可知，以該方法從絲膠蛋白中釋放出的糖鏈為O-GalNAc，而未發(fā)現(xiàn)O-Galβ1，3GalNAc 的質(zhì)譜信號(hào)，其原因可能是釋放的二糖因含有1，3-連接糖苷鍵而在堿性條件下發(fā)生了剝皮降解反應(yīng)［25］，而釋放的單糖在相同條件下則具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性.此外，發(fā)現(xiàn)樣品雖已通過固相萃取柱分級(jí)純化，但糖鏈純度依然不高，在質(zhì)譜圖中觀察到許多雜質(zhì)信號(hào)峰.

為了進(jìn)一步對(duì)氨水催化法釋放的絲膠蛋白還原性O(shè)-糖鏈樣品進(jìn)行精細(xì)分離純化，利用本課題組［18］已建立的還原性糖鏈HPLC分離制備策略，對(duì)其進(jìn)行BSH標(biāo)記后，再進(jìn)行HILIC分離和組分收集，最后對(duì)收集到的糖鏈BSH衍生物組分進(jìn)行了脫標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果如圖2（D）～2（F）所示.如圖2（D）所示，從絲膠蛋白釋放的O-GalNAc 標(biāo)記上BSH 后，其質(zhì)譜圖中信號(hào)峰為m/z398.08（［M+Na］+）和m/z414.08（［M+K］+）.圖2（E）為該樣品的HILIC 分離色譜圖，可見多種雜質(zhì)成分與目標(biāo)糖鏈被有效分開.在HILIC分離過程中，根據(jù)保留時(shí)間對(duì)樣品中的GalNAc BSH衍生物組分進(jìn)行收集和干燥，然后在弱酸性水溶液中加熱脫除BSH，產(chǎn)物的ESI-MS檢測(cè)結(jié)果如圖2（F）所示.可見，GalNAc 的BSH衍生物已完全轉(zhuǎn)化為還原性GalNAc，且其中雜質(zhì)信號(hào)峰極低，說明樣品純度顯著提高.以上結(jié)果表明，氨水催化法釋放的絲膠蛋白GalNAc 可通過色譜方法實(shí)現(xiàn)精細(xì)分離純化，此釋放純化策略的建立為獲取高純度GalNAc提供了一種重要天然來源，同時(shí)也為絲膠蛋白資源的深度利用提供了一種新的可能途徑.

Fig.2 Reaction condition optimization and product chromatographic separation of the ammoniacatalyzed method for non-reductive release of sericin O-linked monosaccharide

2.3 絲膠蛋白源Tn和T抗原的釋放純化及質(zhì)譜分析

Tn抗原和T抗原是合成癌癥特異性糖肽疫苗的關(guān)鍵原料，其易得性和結(jié)構(gòu)可靠性對(duì)癌癥疫苗的合成和生產(chǎn)有重要影響［8～11］.絲膠蛋白作為一種天然糖蛋白，由于其小分子O-糖鏈在結(jié)構(gòu)上與癌癥Tn抗原和T抗原完全相同，因而理論上可作為制備這兩種癌癥抗原的天然原材料.為了進(jìn)一步從絲膠蛋白中提取Tn抗原和T抗原，利用不同量的Pronase E對(duì)絲膠蛋白進(jìn)行水解，并以C18固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)純化，最終在不同時(shí)間段的水洗液中分別獲得了Tn抗原和T抗原組分，產(chǎn)物的ESI-MS檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其結(jié)構(gòu)的MS/MS分析鑒定結(jié)果如圖4所示.

Fig.3 ESI-MS profiles of Tn antigen(A) and T antigen(B) derived from sericin

Fig.4 MS/MS analysis of Tn antigen and T antigen derived from sericin

從絲膠蛋白中釋放的Tn 抗原的理論相對(duì)分子質(zhì)量為308（GalNAc-Ser）和322（GalNAc-Thr），圖3（A）中m/z331.17和353.17處分別為GalNAc-Ser的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號(hào)峰，而m/z345.17和367.17處分別為GalNAc-Thr的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號(hào)峰.同時(shí)，從絲膠蛋白中釋放的T抗原的理論相對(duì)分子質(zhì)量為470（GalGalNAc-Ser）和484（GalGalNAc-Thr），圖3（B）中m/z493.25和515.25處分別為GalGalNAc-Ser的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號(hào)峰，而m/z507.25和529.25處分別為GalGalNAc-Thr的［M+Na］+和［M+2Na-H］+信號(hào)峰.進(jìn)一步以m/z331.17，345.17，493.25 和507.25 作為母離子進(jìn)行MS/MS分析時(shí)，產(chǎn)生的碎片離子信號(hào)均能夠與Tn抗原和T抗原結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)（圖4）.由于已確定T抗原中的二糖為β1，3-連接，而且現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的天然糖蛋白中的O-糖肽鍵均為α-構(gòu)型，文獻(xiàn)［15］報(bào)道的絲膠蛋白O-糖肽鍵也同樣具有此構(gòu)型，因此可以判斷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為GalNAc-α-Ser/Thr 和Galβ1，3GalNAc-α-Ser/Thr，與癌癥Tn抗原和T抗原的結(jié)構(gòu)相同.

此外，研究中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)Pronase E用量較少時(shí)無法從絲膠蛋白中釋放出Tn抗原和T抗原，而當(dāng)該酶的用量增加至與絲膠蛋白原料等重時(shí)才能夠得到較多的Tn抗原和T抗原，說明利用Pronase E 法可從絲膠蛋白中有效釋放出Tn抗原和T抗原，并且對(duì)絲膠蛋白肽鏈的水解程度明顯影響產(chǎn)物產(chǎn)率.同時(shí)，在產(chǎn)物的質(zhì)譜圖（圖3）中還有少量低豐度未知物的信號(hào)，其可能是樣品中未除凈的少量肽段雜質(zhì)，說明樣品純化方法仍有必要進(jìn)一步改進(jìn).此外，目前該方法中Pronase E的用量較大，未來可考慮與其它蛋白酶聯(lián)合使用，并實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的準(zhǔn)確估算，以進(jìn)一步提高反應(yīng)效率，并降低成本，為Tn抗原和T抗原的大量生產(chǎn)制備奠定基礎(chǔ).

3 結(jié)論

以ESI-MS，MS/MS及在線LC-MS為主要檢測(cè)手段，通過O-糖組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，蠶繭絲膠蛋白中僅存在GalNAc和Galβ1，3GalNAc兩種小分子O-糖鏈，二者在結(jié)構(gòu)上分別與Tn抗原與T抗原相同，豐度比約為5.3：1，其中GalNAc 的含量約為1.58 μg/g，Galβ1，3GalNAc 的含量為0.54 μg/g.利用氨水催化法從絲膠蛋白中釋放O-糖鏈，獲得了還原性O(shè)-連接單糖，而O-連接二糖被降解，最佳反應(yīng)條件為在體積分?jǐn)?shù)為25%～28%的氨水中于40 ℃反應(yīng)16 h，并通過液相色譜實(shí)現(xiàn)了樣品的精細(xì)分離純化，得到了高純度的還原性單糖GalNAc，由此表明絲膠蛋白中的O-連接單糖在氨水中被釋放的過程中具有較好的穩(wěn)定性.通過Pronase E水解法可從絲膠蛋白中有效釋放出Tn抗原和T抗原，并發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白肽鏈的水解程度對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率有重要影響.該研究為獲取高純度GalNAc，Tn 抗原和T 抗原提供了一種重要天然來源，同時(shí)也為絲膠蛋白資源的開發(fā)利用提供了一種新的可能途徑.