邵明辰，董偉峰，劉兆潔

（1.山東省魯南牧工商有限公司，山東 棗莊 277500；2.山東省萊州市文昌路畜牧獸醫(yī)站，山東 萊州 261499；3.廣東省華晟生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 511400）

H9N2 是A 型流感病毒的一個(gè)亞型，具有高度空氣傳播性，可引發(fā)商品肉雞流感，同時(shí)該病毒還嚴(yán)重影響人類公共衛(wèi)生安全。我國(guó)自1998 年就開始進(jìn)行H9N2 亞型禽流感病毒（AIV）的防疫，但目前其疫苗株與流行株的抗原性已經(jīng)出現(xiàn)了較大的差異[1]。商品肉雞因養(yǎng)殖密度大、通風(fēng)不良等原因，冬春季極易引起流行，造成生產(chǎn)中的嚴(yán)重?fù)p失。雖然H9N2 亞型流感病毒屬于低致病性，但與大腸桿菌、支原體等混合感染后可引起免疫抑制和死亡增多，造成肉雞養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。

H9N2 禽流感病毒自1966 年首次在美國(guó)分離后，逐漸在北美、亞洲、中東、非洲和歐洲許多國(guó)家家禽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)地理位置不同可分為北美和歐亞兩個(gè)體系。目前該病在亞洲地區(qū)分布較廣。

1994 年我國(guó)廣東地區(qū)首次公開報(bào)道H9N2 亞型禽流感病毒。 HA 基因是A 型流感病毒致病性的主要影響因子。 根據(jù)HA 序列，將H9N2 分為h9.1～h9.4，共4 個(gè)主干進(jìn)化分支。當(dāng)前，我國(guó)流行的主要為h9.4.2.5 和h9.4.2.6 兩個(gè)分支，但仍以h9.4.2.5 為主。本文選取了來自山東地區(qū)發(fā)病商品肉雞分離的15 株H9N2 禽流感病毒，用特異性引物對(duì)HA 基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，比對(duì)其HA 基因同源率，探討HA 基因遺傳演化特點(diǎn)，為商品肉雞低致病性禽流感H9N2 的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 毒株

15 株H9N2 亞型商品肉雞分離株由廣東省華晟生物技術(shù)有限公司分離鑒定保存，方法參照文獻(xiàn)[3]，并分別命名為A/CK/SD/11/2022/H9N2、A/CK/SD/15/2022/H9N2、A/CK/SD/16/2022/H9N2、A/CK/SD/17/2022/H9N2、A/CK/SD/19/2022/H9N2、A/CK/SD/21/2022/H9N2、A/CK/SD/29/2022/H9N2、A/CK/SD/30/2022/H9N2、A/CK/SD/31/2022/H9N2、A/CK/SD/32/2022/H9N2、A/CK/SD/50/2022/H9N2、A/CK/SD/51/2022/H9N2、A/CK/SD/52/2022/H9N2、A/CK/SD/53/2022/H9N2、A/CK/SD/54/2022/H9N2。

H9-2203-C（4.2.5c）、HeB210813-2F6-b（4.2.5b）、H9-2102-a（4.2.5a）參考毒株HA 序列由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 主要材料和試劑

SPF 雞（胚）由廣東新興大華農(nóng)禽蛋有限公司提供。試驗(yàn)所用分子生物學(xué)試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物合成

利用參考文獻(xiàn)[3]中的H9N2 禽流感病毒HA基因引物序列，由廣州核源生物科技有限公司合成，用于擴(kuò)增HA 基因全長(zhǎng)序列，預(yù)期擴(kuò)增的HA基因大小為1 687 bp。擴(kuò)增所用引物序列詳見表1。

表1 擴(kuò)增所用引物序列

1.4 病毒RNA 的提取及RT-PCR 擴(kuò)增、測(cè)序

參照試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA 提取。RTPCR 擴(kuò)增、連接克隆、序列測(cè)定參照文獻(xiàn)提出的方法進(jìn)行[4]。

1.5 遺傳進(jìn)化分析

15 株分離毒株、8 株H9N2 禽流感參考毒株的HA 基因序列（表2）以及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供分型的3 株H9N2 毒株HA 基因序列，用MEGA6.0 進(jìn)行遺傳演化分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

表2 8株H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列信息

2 結(jié)果

2.1 HA 基因的同源性和遺傳分析

將11 株（8+3）參考毒株與15 株H9N2 病毒分離株的HA 基因進(jìn)行遺傳演化分析，獲得如圖1 所示的進(jìn)化樹。

圖1 HA基因遺傳進(jìn)化樹

從圖1 進(jìn)化樹可以看出，15 株分離毒株均屬于4.2.5 分支，細(xì)分為2 個(gè)亞分支。其中，12 株分離毒株屬于4.2.5c 分支，3 株分離毒株屬于4.2.5a分支。圖2 中，15 株H9N2 分離毒株之間的HA序列相似性在93.3%～99.9%之間。同一亞分支4.2.5a 分支間的毒株相似性在99.8%～99.9%之間，4.2.5c 分支間的毒株相似性在95.6%～99.9%之間，差異較小，但不同亞分支間的毒株相似性差異較大。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，相似性差異大于1.5%就能形成分支間的差異，因此分析這些毒株的抗原性可能也會(huì)存在明顯差異。

圖2 HA基因核苷酸同源率

2.2 關(guān)鍵位點(diǎn)分析

15 株分離株的HA 裂解位點(diǎn)呈現(xiàn)弱毒株的序列特征，均為RSSR ↓GLF。受體結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)W161 和G236 符合其絕對(duì)保守氨基酸位點(diǎn)的特征，沒有出現(xiàn)其他氨基酸的突變。12 株病毒（11/15/16/17/19/30/50/51/52/53/54）在163 位點(diǎn)為N 突變，3 株病毒（29/31/32）在163 位點(diǎn)為T 突變，198 位點(diǎn)均為V 突變。所有分離株存在234L和236G（表3）。以上突變位點(diǎn)均與受體特異性相關(guān)，說明所有分離株都有感染哺乳動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 HA基因關(guān)鍵位點(diǎn)分析

3 討論

流感病毒的HA 基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列是其致病性和毒力的主要影響因子[5]。本研究中15個(gè)H9N2 分離毒株的HA 基因裂解位點(diǎn)具有低致病性流感病毒分子特征，裂解位點(diǎn)氨基酸序列為RSSR ↓GLF，沒有連續(xù)的多個(gè)堿性氨基酸插入。

測(cè)序鑒定的15株H9N2毒株均屬于4.2.5分支，此分支是當(dāng)前國(guó)內(nèi)商品肉雞H9N2 病毒的主要流行分支。病毒分布在4.2.5 分支內(nèi)部的2 個(gè)亞分支中，2 個(gè)分支之間病毒的HA 基因存在明顯的相似性差異，暗示病毒的抗原性之間也可能存在較大差異。Sun 等[6]發(fā)現(xiàn)，H9N2 病毒流行株同源性之間呈現(xiàn)時(shí)間和地理位置的一致性；不同的是，較早期病毒均有不同程度的變異和進(jìn)化。本研究中，通過對(duì)15 株H9N2 分離毒 HA 基因進(jìn)化樹分析可知，從地理位置上分離毒呈現(xiàn)出兩種不同的同源性關(guān)系，從分支上隸屬于4.2.5a 和4.2.5c 亞分支，出現(xiàn)了地理位置的不一致性。當(dāng)前國(guó)內(nèi)商品肉雞使用的H9N2 滅活疫苗基本是單一毒株，抗體交叉可能存在差異，提示肉雞場(chǎng)需要兼顧兩種不同亞分支毒株的免疫。

H9N2 禽流感病毒對(duì)公共安全也有潛在威脅[7]。15 株分離毒株的HA 基因關(guān)鍵位點(diǎn)突變均呈現(xiàn)出典型的人流感受體結(jié)合特性，具有234L和236G 的特征，以上突變位點(diǎn)均與受體特異性相關(guān)，病毒均具備感染哺乳動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)，提示相關(guān)從業(yè)人員應(yīng)該加強(qiáng)生物安全防護(hù)，避免其產(chǎn)生嚴(yán)重的公共危害。