李王靖, 李 蜜, 徐淑芬, 黎芳婷, 易湘茜, 劉永宏, 高程海*

( 1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 海洋藥物研究院/藥學(xué)院, 南寧 530200; 2. 廣西海洋藥物重點實驗室, 南寧530200 )

紅樹植物因受潮汐活動影響而長期被海水周期性淹沒,獨特的生境蘊藏豐富且特殊的微生物資源,由于生長環(huán)境特殊及現(xiàn)有分離技術(shù)手段有限,因此僅1%的紅樹林微生物資源可通過現(xiàn)有分離方法獲得(李蜜等,2020)。廣西茅尾海紅樹林地處亞熱帶海灣,海水溫度較高且鹽度較低, 適宜桐花樹和秋茄等鄉(xiāng)土紅樹植物生長,近幾年從國外引入大量無瓣海桑(黃祥娟等,2022),具有生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜、微生物群落結(jié)構(gòu)特殊和活性微生物多樣性豐富等特征。顏棟美等(2018)從茅尾海無瓣海桑根際土壤中,分離獲得57株細菌,其中有1株潛在新菌種,50.88%的菌株對甘蔗鞭黑粉菌具有抑制作用。鄭紅蕓等(2019)從茅尾海紅樹植物根際淤泥中獲得244株放線菌,60株隸屬鏈霉菌屬,4株為潛在新物種。抑菌實驗結(jié)果顯示,83株放線菌中有59株對多種致病菌具有抑制作用,包括1株潛在新菌,6株細菌表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。葉景靜等(2018)使用8種培養(yǎng)基從3種紅樹植物中分離獲得261株細菌,其中3株為潛在新物種,83株放線菌中有10株具有廣譜抑菌活性。Lu等(2019)從茅尾海紅樹植物土壤的1株小單孢菌中分離得到對耐藥大腸桿菌和藥敏肺炎克雷伯菌有較強抑制活性的7個喹諾啉類抗生素,包括quinomycin A, quinomycin monosulfoxide和5個新化合物。Li等(2019)和Gong等(2018)從茅尾海紅樹林分別發(fā)現(xiàn)5株具有產(chǎn)生核糖體抑制劑的細菌和16株含有I型聚酮合酶和II型聚酮合成酶的菌株。由此可見,茅尾海紅樹林菌株資源豐富,部分菌株對多種致病菌有抑菌效果且活性顯著,有開發(fā)成為抗生素的潛力。

富集培養(yǎng)作為一種分離未培養(yǎng)和難培養(yǎng)微生物的方法,被驗證能夠有效促進海洋細菌從休眠狀態(tài)下復(fù)蘇(王肖慢等,2019),分離得到多樣性豐富的微生物。該方法已在海洋沉積物中被應(yīng)用,Mu等(2018)研究結(jié)果顯示,富集培養(yǎng)后同一樣品相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法微生物物種多樣性提高2倍以上。目前還未有文獻報道使用富集培養(yǎng)法富集紅樹林根際土壤微生物。因此,本研究使用該方法富集微生物提高其物種多樣性,具有較大研究價值。

抗生素作為人類對抗感染性疾病的有效武器,在人類社會中扮演著重要角色。由于抗生素在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等各個領(lǐng)域的濫用,因此促使了致病菌耐藥性的產(chǎn)生,從而推動了抗生素耐藥危機爆發(fā)(王旭陽等,2020),人類將面臨無有效抗生素可用的“后抗生素時代”。預(yù)計到2050年,抗生素耐藥危機每年可能造成約1 000萬人死亡(El-Kurdi et al.,2020)。2014—2019年臨床研究結(jié)果顯示,金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌是臨床上最為常見的人體致病菌,對當(dāng)前常見的抗生素具有耐藥性(全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng),2021)。因此,開發(fā)新型有效的抗生素迫在眉睫,而尋找能夠產(chǎn)生新型抗生素的菌株是前提條件。本研究以茅尾海不同種類紅樹植物根際土壤為對象,首次嘗試用富集培養(yǎng)法分離共生細菌,用紙片法對菌株代謝產(chǎn)物粗提物進行抑菌活性篩選,擬探討:(1)富集培養(yǎng)法能否從紅樹植物根際土壤中分離得到多樣性豐富的微生物;(2)富集培養(yǎng)法能否有效從紅樹植物根際土壤中分離到未培養(yǎng)和難培養(yǎng)的微生物;(3)紅樹林環(huán)境樣品是否存在具有抑菌活性的微生物資源。以期挖掘更多潛在新物種和具有抑制人類致病菌活性的微生物資源,為抗生素的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土壤樣品的采集 2021年9月于茅尾海紅樹林自治區(qū)級自然保護區(qū)采集紅樹植物紅海欖、黃槿、無瓣海桑、桐花樹、闊苞菊的根際泥土樣本。采集5～10 cm深度的紅樹植物根際土壤,除去石塊和斷根等雜質(zhì)后裝入無菌采樣袋存放于4 ℃保溫箱中,帶回實驗室進行菌株分離實驗。樣品采集信息詳情如表1所示。

表 1 茅尾海紅樹根際土壤樣品采集的信息Table 1 Information of collected mangrove rhizosphere soil samples from the Maowei Sea

1.1.2 檢定菌來源 表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由廣東省微生物研究所提供。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院提供。

1.1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 二甲基亞砜(DMSO)和甲醇為國產(chǎn)分析純,購于西隴科學(xué)股份有限公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物(27F, 1492R)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;Chelex-100 樹脂購于美國 BioRad 公司;Taq PCR Master Mix (2 ×)購于康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基:氯化銨1.0 g,乙酸鈉2.0 g,七水硫酸鎂0.20 g,酵母提取物0.20 g,蛋白胨0.20 g,EDTA-Na21.0 g,丙酮酸鈉1.1 g,海水1 L,滅菌后另加無菌的10% NaHCO3和2% KH2PO4溶液(10 mL·L-1)。分離培養(yǎng)基:參考李蜜等(2020)使用2216E瓊脂培養(yǎng)基(2216E)、2216E/10培養(yǎng)基、酪氨酸-天冬酰胺培養(yǎng)基(P7)、改良ISP5培養(yǎng)基(M7)、Am6-1培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基(P3)。滅菌后添加重鉻酸鉀使其終濃度為25 mg·L-1。純化及保藏培養(yǎng)基:ISP2和LB固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基:AM3和AM6液體培養(yǎng)基。檢定菌培養(yǎng)基:LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品的處理 參照王肖慢等(2019)的方法,取20 g土壤加入滅菌后的500 mL液體富集培養(yǎng)基(Mu et al.,2018)中,震蕩混勻,置于28 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng),分別于第0天和第7天取原液、10-1和10-3稀釋液,在6種不同的分離培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)(李蜜等,2020)。

1.2.2 菌株的分離純化和保藏 參考李蜜等(2020)的方法,將涂布后的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別于第5、第17、第41天從涂布培養(yǎng)基中挑選單一菌落,采用三區(qū)劃線法在ISP2培養(yǎng)基上分離純化,編號且記錄其生長培養(yǎng)基類型和形態(tài)特征;將純化的菌株保藏于25%(M/M)無菌甘油管中。

1.2.3 菌株的鑒定 純化的菌株根據(jù)形態(tài)特征進行排重,采用Chelex-100法(周雙清等,2010)對已排重細菌的基因組DNA進行提取,參照Walsh 等(1991)的方法對細菌基因組DNA進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。經(jīng)SeqMan軟件整理16S rRNA基因測序結(jié)果,并在數(shù)據(jù)庫EzBioClou(http://www.eztaxon.org/)進行相似性比對,根據(jù)16S rRNA相似度對菌株的種屬進行確定。

1.2.4 可培養(yǎng)細菌活性篩選

1.2.4.1 可培養(yǎng)細菌粗提物的提取 參考李蜜等(2020)的方法,將對數(shù)生長期的菌株分別接種于100 mL的AM3和AM6液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液3次,取乙酸乙酯萃取溶液進行減壓旋蒸,揮干得到細菌粗提物,粗提物置于4 ℃環(huán)境保存。

1.2.4.2 細菌粗提物的抑菌實驗 參考鄭紅蕓等(2019)的方法,將致病菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、180 r·min-1的搖床中培養(yǎng)7 h獲得種子液。種子液加到未凝固的LB固體培養(yǎng)基中滅菌后冷卻至50 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基中,稀釋至0.2%濃度。充分振搖后傾注到培養(yǎng)皿中,待其冷卻后備用。

參考葉景靜等(2018)的方法。使用甲醇溶解細菌粗提物,最終配制成20 mg·mL-1溶液,取15 μL分多次滴加到直徑6 mm的無菌濾紙片中。等體積甲醇、DMSO、空白AM3培養(yǎng)基、空白AM6培養(yǎng)基的濾紙片作陰性對照。以分別加入3 μL甲氧芐啶和環(huán)丙沙星的濾紙片作為陽性對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,觀察抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細菌多樣性分析

使用6種分離培養(yǎng)基從7份紅樹植物根際土壤樣品中分離到266株可培養(yǎng)細菌。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生長情況進行排重,通過16S rRNA基因序列測序比對,鑒定獲得120種細菌,包括放線菌門、厚壁菌門和變形菌門,隸屬于35科47屬,分離情況如表2所示。紅樹植物根際土壤中放線菌資源豐富,分離得到49種放線菌占分離菌株總數(shù)的40.8%。鏈霉菌屬 (Streptomyces)分離獲得最多,共17種,占細菌物種總數(shù)的14.2%;其次為芽孢桿菌屬(Bacillus),共獲得9種。分離得到5種潛在新菌,與有效發(fā)表菌株相比較最高相似度均低于97.00%,其中MarmoricolasilvestrisGXIMD2799、ActinomycetosporachiangmaiensisGXIMD3297、ShewanellamangroviGXIMD2807、FulvimarinamanganoxydansGXIMD2794均來源于桐花樹的根際土壤,詳細物種信息如表3所示。

2.2 不同樣品和培養(yǎng)基的獲得菌株種類分析

經(jīng)過富集培養(yǎng)處理后,不同樣品獲得可培養(yǎng)細菌多樣性差異明顯,樣品B(黃槿根際土壤)中分離得到的菌種數(shù)目最多(為43種),優(yōu)勢菌屬為微桿菌屬(Microbacterium)。其次是樣品F(桐花樹根際土壤)分離得到35種細菌,鏈霉菌屬最為豐富。樣品E(桐花樹根際土壤)中分離得到的菌種數(shù)目最少,而放線菌占比最高(57.89%)。此外,各樣品中均能分離得到芽孢桿菌屬和希瓦氏菌屬(Shewanella)菌株。不同樣品菌株分離情況如圖1所示。

由于不同培養(yǎng)基存在營養(yǎng)成分差異,因此分離得到的細菌物種多樣性差異顯著。就菌種多樣性而言,P7培養(yǎng)基分離效果最好,獲得60種細菌,隸屬于18個屬,其中56.67%為放線菌,鏈霉菌屬最為豐富。P3培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)目最少,分別得到11種和14種菌,隸屬于10個屬和12個屬,優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬。與2216E培養(yǎng)基相比,具有相同種類成分的2216E/10培養(yǎng)基分離得到的菌株種類更為多樣,共獲得35種菌,隸屬于20個屬。此外,壤霉菌屬(Agromyces)、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和Rossellomorea在6種分離培養(yǎng)基中均有生長。不同培養(yǎng)基菌株分離情況如圖2所示。

2.3 細菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌實驗結(jié)果

9種菌株對至少一種致病菌有抑菌活性,其中7種分離自P7培養(yǎng)基。菌株StreptomyceshyderabadensisGXIMD3077、AgromyceskandeliaeGXIMD3249、StreptomycessundarbansensisGXIMD3242、CurtobacteriumluteumGXIMD3684、MicromonosporarifamycinicaGXIMD3699對3種人體致病菌均具有抑制活性。GordoniadidemniGXIMD3861、ShewanellaalgaeGXIMD3241對MRSA和銅綠假單胞菌具有抑制活性。NocardiaarthritidisGXIMD3088、GXIMD3297對銅綠假單胞菌具有一定的抑制活性。放線菌在抑菌活性研究方面有較大潛力,通過篩選發(fā)現(xiàn)8種活性菌株為放線菌,2種來源于鏈霉菌屬,其余6種菌株分別來自壤霉菌屬、短桿菌屬(Curtobacterium)、小單孢菌屬(Micromonospora)、戈登氏菌屬(Gordonia)、諾卡氏菌屬(Nocardia)和放線孢菌屬(Actinomycetospora),其中GXIMD3297為潛在新菌,對銅綠假單胞菌具有一定的抑菌活性。同一菌株不同發(fā)酵培養(yǎng)基其代謝產(chǎn)物抑菌活性檢測結(jié)果不同,部分菌株的抑菌活性只存在于其中一種發(fā)酵培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物,9株活性菌株中GXIMD3699和GXIMD3061在2種發(fā)酵培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物均有抑菌活性。抑菌活性實驗結(jié)果如表4和圖3所示。

3 討論

茅尾海紅樹林海水鹽度較低且紅樹植物種類多樣,其根際土壤微生物群落復(fù)雜。據(jù)2015—2021年的文獻報道,通過傳統(tǒng)分離方法從茅尾海紅樹林土壤分離得到的潛在新菌(<98.65%)比例為2.34% (張榮燦等,2015;吳家法等,2017;顏棟美等,2018;葉景靜等,2018;石松標(biāo)等,2018;鄭紅蕓等,2019)。由于海洋環(huán)境難以模擬、某些微量的營養(yǎng)物質(zhì)缺失、不同微生物之間的生物聯(lián)系切斷等制約條件,導(dǎo)致部分微生物為避免外界環(huán)境威脅,啟動自我保護機制而陷入休眠狀態(tài)(王保軍等,2013),因此在實驗室分離得到的菌株種類極其有限。為分離未培養(yǎng)和難培養(yǎng)微生物,本研究采用富集培養(yǎng)法富集土壤樣品中的微生物,以期復(fù)蘇休眠菌株,提高微生物多樣性,獲得更多潛在新物種,最終分離得到5株相似度低于97.00%的菌種,潛在新菌比例為4.17%。富集培養(yǎng)所用培養(yǎng)基是在寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了丙酮酸鈉和乙酸鈉,為合成細菌生長所需的丙酮酸和乙酰輔酶A提供底物,進而增強細菌基礎(chǔ)代謝,促進細菌復(fù)蘇,同時降解富集過程中細菌產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物,在富集過程中打破部分微生物的受脅迫狀態(tài)(Mu et al.,2018;王肖慢等,2019),使其可以正常生長,盡可能多的分離出未培養(yǎng)和難培養(yǎng)細菌。

圖 1 不同茅尾海紅樹根際土壤分離得到的細菌種類Fig. 1 Bacteria isolated from different mangrove rhizosphere soils of the Maowei Sea

圖 2 不同培養(yǎng)基分離得到的細菌總數(shù)Fig. 2 Total number of bacteria isolated from different media

表 2 茅尾海紅樹林樣品根際土壤可培養(yǎng)細菌Table 2 Culturable bacteria of mangrove rhizosphere soil from the Maowei Sea

表 3 潛在疑似新物種Table 3 Potential new species

本研究在富集培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,采用6種分離培養(yǎng)基對茅尾海7份不同地點的紅樹植物根際土壤進行細菌的分離純化,共獲得120種細菌,隸屬于35科47屬,鏈霉菌屬數(shù)量最多,優(yōu)勢屬與葉景靜等(2018)、鄭紅蕓等(2019)研究結(jié)果相同。不同培養(yǎng)基的菌株分離結(jié)果顯示,P7培養(yǎng)基(甘油、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、復(fù)合鹽溶液)分離得到的菌株多樣性最豐富,共分離得到60種細菌,占總菌種數(shù)的50.00%,包括7種活性菌株。P3和2216E培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,分離效果遜于寡營養(yǎng)的P7培養(yǎng)基。這說明在紅樹林特殊生境中,較多微生物的生長需要補充氨基酸,并要求培養(yǎng)基微量元素多樣、非營養(yǎng)豐富,P7培養(yǎng)基可作為紅樹植物根際土壤微生物分離的參考培養(yǎng)基。

放線菌是抗生素的主要來源,為應(yīng)對抗生素耐藥危機提供重要菌種資源。抑菌活性篩選結(jié)果顯示,有9種細菌具有抑菌活性, 其中8種為放線菌。GXIMD3077、GXIMD3249、GXIMD3242、GXIMD3684、GXIMD3699對3種人體致病菌均有一定的抑制作用。GXIMD3249為秋茄壤霉菌(Agromyceskandeliae),最早發(fā)現(xiàn)于2020年(Wang et al., 2020),目前未見有抑菌活性方面的報道。GXIMD3699和GXIMD3061在兩種發(fā)酵培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物均有抑菌活性,其余活性菌株只篩選到一種培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物具有活性,說明培養(yǎng)基的組成變化對菌株的次級代謝產(chǎn)物合成有一定的影響(孫志敏等,2022)。銅綠假單胞菌是臨床上常見的病原菌,容易感染人體導(dǎo)致肺炎、菌血癥和敗血癥等,對于免疫力低下人群具有嚴(yán)重的危害。其外膜通透性較低,并能產(chǎn)生碳青霉烯酶和多種β-內(nèi)酰胺酶對抗生素進行滅活,對多種常用抗菌藥物具有明顯耐藥性(岳卓等,2020)。本研究分離得到1株最高相似度為96.61%的稀有放線菌GXIMD3297(Actinomycetosporachiangmaiensis),為潛在新物種,該菌在AM6液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物對銅綠假單胞菌具有一定的抑制作用。據(jù)文獻報道,該屬菌株僅在蘭花(Sakdapetsiri et al., 2018)、地衣(Yamamura et al., 2011)和土壤(Zhang et al., 2014)中被發(fā)現(xiàn),目前暫無關(guān)于該屬抑菌活性的相關(guān)研究。因此,本研究篩選到的潛在新物種GXIMD3297具有深入開發(fā)研究的潛力。下一步計劃開展?jié)撛谛戮亩囗椃诸愯b定及活性菌株的條件優(yōu)化、活性化合物分離純化等,為新型抗生素的研發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1. 銅綠假單胞菌; 2. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌; 3. 表皮葡萄球菌; A. AM3培養(yǎng)基; B. AM6培養(yǎng)基; C. 甲醇; D. 二甲基亞砜; E. 甲氧芐啶; F. 環(huán)丙沙星。1. Pseudomonas aeruginosa; 2. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; 3. S. epidermidis; A. AM3 medium; B. AM6 medium; C. MeOH; D. DMSO; E. TMP; F. CPFX.圖 3 3種人體致病菌抑菌活性實驗結(jié)果圖Fig. 3 Results of antibacterial activity from three kinds human pathogenic bacteria

表 4 具有抑制3種人類致病菌活性的紅樹林根際土壤可培養(yǎng)菌株Table 4 Culturable strains of mangrove rhizosphere soil with inhibitory activity against three human pathogenic bacteria

4 結(jié)論

本研究結(jié)果可為富集培養(yǎng)方法在紅樹植物根際土壤微生物分離的應(yīng)用提供參考。從茅尾海紅樹植物根際土壤中分離得到120種細菌,包括5種潛在新物種,說明茅尾海紅樹植物根際土壤蘊藏的微生物資源豐富,具有較大的開發(fā)價值。抑菌實驗結(jié)果顯示,8種放線菌對多種致病菌表現(xiàn)出抑制作用,其中包括1株潛在新菌,說明海洋放線菌是新型抗生素生產(chǎn)來源的潛力菌株,并且具有較大研究潛力。