劉保財, 陳菁瑛*, 張武君, 劉劍超, 黃穎楨, 趙云青, 劉紅躍

( 1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福州 350003; 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究中心, 福州 350003; 3. 福建省南平市邵武市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 福建 邵武 354000; 4. 福建省南平市邵武市林業(yè)局, 福建 邵武 354000 )

多花黃精(Polygonatumcyrtonema)屬于黃精屬多年生草本植物(Chen et al., 2000),為習用的藥食兩用物種(Li et al., 2022; Wu et al., 2022),具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效,用于治療脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳等疾病(國家藥典委員會, 2020)。現(xiàn)代藥理研究表明,多花黃精含有多糖、生物堿、黃酮等生化成分,具有降血糖、抗疲勞、抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等作用(Li et al., 2018, 2020; Gan et al., 2022)。隨著人們對多花黃精的認知加深,其倍受青睞,栽培面積逐步擴大(黃申等, 2020)。多花黃精等藥用植物的種子存在后熟的生理現(xiàn)象,收獲后需要沙藏貯存,常規(guī)曬干后迅速降低種子的發(fā)芽率(劉保財?shù)? 2015; 安瑞朋等, 2020),而多花黃精種子苗的繁育對多花黃精的生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義(劉保財?shù)? 2017)。

轉錄組測序技術已成為種子萌發(fā)( Chen et al., 2022)、生物合成( Liu et al., 2022; Song et al., 2022)等關鍵基因發(fā)現(xiàn)的有效手段?；谵D錄組方法,對重樓種子休眠解除過程中差異基因的表達情況及相關代謝通路進行研究,明確重樓種子的休眠與脫落酸、赤霉素、生長素、油菜甾醇、細胞分裂素、乙烯、茉莉酸和水楊酸相關(Song et al., 2022);粗莖秦艽種子萌發(fā)前、萌發(fā)中及萌發(fā)后3個階段的轉錄組分析結果表明,光照條件和激素水平為粗莖秦艽種子萌發(fā)過程的重要調(diào)控因子(楊曉等, 2021);雞骨草種子具有極低的發(fā)芽率,通過赤霉素處理,編碼CYP78A5、Bg7s、GA-20-ox、rd22、MYB4、LEA、CHS等蛋白的基因發(fā)生了上調(diào)(Shimizu et al., 2022);同屬黃精種子的轉錄組學研究揭示了變溫可打破種子上胚軸的休眠機制,明確植物激素、染色體修飾、DNA甲基化、mRNA降解、胚乳弱化和細胞壁結構相關的基因協(xié)同控制著黃精種子萌發(fā)、上胚軸休眠和幼苗形成(Liao et al., 2021)。在黃精種子發(fā)育與休眠解除過程中,與種胚形態(tài)建成、多糖分解及蛋白質合成等相關的差異基因表達上調(diào)且涉及多個代謝途徑的相互作用,構成復雜的休眠解除調(diào)控網(wǎng)絡(羅麗娜和向增旭, 2021; Zhang et al., 2022)。然而,當前關于多花黃精種子的萌發(fā)過程的基因研究報道較少,尤其是對種子萌發(fā)具有關鍵作用的特征性表達通路與基因尚不清楚,阻礙了多花黃精種子育苗、種子生理及其綜合開發(fā)利用。本研究利用轉錄組學方法,對多花黃精種子萌發(fā)過程中的4個階段開展了測序,擬探討:(1)多花黃精種子萌發(fā)后,哪些通路為關鍵通路;(2)這些關鍵通路上哪些基因進行了顯著變化。為打破多花黃精種子休眠、促進種子萌發(fā)及其生理生化等方面研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗材料采集于福建省泰寧縣,經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所陳菁瑛研究員鑒定為多花黃精(Polygonatumcyrtonema),種植于邵武市和平鎮(zhèn)和平村林下。2019年11月采集10株果皮發(fā)黑的成熟的果實,經(jīng)8 d堆置發(fā)酵后,用手捏碎變軟的果實,漂去果皮等雜質并用水清洗,干凈的種子作為試驗材料備用。

DP441-RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit,購自Illumina, Inc.; TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(AT341),PerfectStart?Green qPCR SuperMix (DyeⅡ),購自北京全式金生物技術有限公司;無水乙醇,購自西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器和設備

NanoPhotometer(德國Implen公司);Agilent 2100 Bioanalyzer (安捷倫科技有限公司);5424R高速低溫離心機(德國Eppendorf 公司);2100凝膠成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司);水平電泳裝置(北京市六一儀器廠);海爾MI-2270M (N)微波爐(青島海爾微波制品有限公司);微量紫外-可見光分光光度計(NanoDrop One)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];AE124/JY10002型電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.3 材料處理

將洗干凈的種子用無菌水沖洗10遍,立即取約3 g種子,放入液氮中凍存10 min,然后移入-80 ℃冰箱中保存,直到RNA提取(圖1: A)。剩下的種子用于沙藏,沙藏所需的河沙需經(jīng)過121 ℃滅菌30 min,并用少量的無菌水保持河沙濕潤,沙藏期間每周定期檢查并用無菌水補充水分。沙藏150 d后,挑選胚剛突破種皮的種子(圖1: B)和初步形成的第一個微根狀莖的種子(圖1: C),種植20 d后,挑選變綠的微根狀莖的種子(圖1: D),以上萌發(fā)階段各取樣約3 g,用清水沖洗干凈,吸干表面的水分,立即放入液氮中凍存10 min,再移入-80 ℃冰箱中保存,用于RNA提取。上述取樣均3次生物學重復。

1.4 建庫測序

取上述沙藏前(A)、萌發(fā)后(B)、微根狀莖(C)、綠色微根狀莖(D)4個萌發(fā)階段的種子各約0.5 g,采用DP441-RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]分別提取各萌發(fā)階段的總RNA,3次生物學重復。NanoPhotometer:檢測RNA純度(OD 260/280及OD 260/230比值)和Agilent 2100 Bioanalyzer:檢測RNA完整性。進一步使用試劑盒Illumina 的 NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit,參照說明書構建文庫。構建文庫后,先使用Qubit 2.0 Fluorometer初步定量,再使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的insert size,符合預期后,用qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量。庫檢合格后,由北京諾禾致源科技股份有限公司應用Illumina HiSeq 2500完成序列的測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)組裝及注釋 將獲得的 Raw reads 去除帶接頭、含N和低質量 reads,獲得Clean data,并進行 Q20、Q30和GC含量計算。當前多花黃精尚無參考基因組序列,因此本研究采用denovo組裝方法,使用Trinity軟件對Clean data進行拼接、組裝,進一步通過Corset(Davidson &Oshlack, 2014)軟件,對轉錄本聚類去冗余,最終每個cluster被定義為“Unigene”,用BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs) 對拼接得到的Trinity. fasta,unigene. fasta和cluster. fasta 進行拼接質量評估,作為后續(xù)分析的參考序列。使用NCBI blast對Unigene進行Nt注釋,Diamond對Unigene進行Nr、KOG/COG、Swiss-Prot注釋, HMMER對Unigene進行Pfam注釋,KAAS對Unigene進行KEGG注釋,Blast2 GO進行GO注釋。

1.5.2 基因表達水平分析 采用RSEM軟件(Li &Dewey, 2011),調(diào)用Bowtie2對比并對結果進行統(tǒng)計,以Trinity拼接得到的轉錄組作為參考序列(Ref),將每個樣品的clean reads往Ref上做匹配,獲得單個樣品的匹配率,統(tǒng)計每個樣品中某基因比對到的reads數(shù)目,然后進行FPKM (expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Mil-lions base pairs sequenced) 轉換,進而得到單個樣品中基因和轉錄本的表達水平。

1.5.3 差異基因表達分析 使用基于負二項分布的模型確定數(shù)字基因表達數(shù)據(jù)中的差異表達的DESeq R包(1.10.1)進行兩個條件/組的差異表達分析,使用Benjamini和Hochberg的方法校正得到P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率,Padj<0.05的基因認定為差異表達?；?GOseq( Young et al., 2010)所述方法對篩選到的DEGs進行GO富集分析?；贙EGG注釋結果,使用 KOBAS,進行 KEGG Pathway富集分析(Mao et al., 2005)。

1.5.4 qRT-PCR驗證 經(jīng)過差異表達基因分析后,在植物信號轉導通路中,隨機選取6個差異基因,設計引物(表1),以沙藏前后的RNA 為模板,按照 TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(AT341)試劑盒進行反轉錄合成cDNA。參照 PerfectStart?Green qPCR SuperMix(+DyeⅡ)試劑盒說明書,以cDNA為模板,在ABI QuantStudio 3儀上完成 qRT-PCR。用2-ΔΔCt方法計算每個基因在不同樣品中的相對表達量(Livak &Schmittgen, 2001)。Actin為內(nèi)參基因。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序和 de novo組裝

測序后,獲得的具體數(shù)據(jù)見表2,各樣本獲得了42 589 470以上的Raw reads,過濾后得到6.03 Gb以上的測序量,Q30≥93.04%,GC含量為46.98%～49.47%。由于尚無多花黃精的全基因組作為參考,因此采用denovo方法對序列進行組裝,分別獲得了388 231 Transcripts (361 956 157 bp)和178 319 Unigenes (146 022 913 bp),Transcripts和Unigenes的最大長度、N50長度分別為15 875、15 875、1 294、1 059 bp。獲得的178 319個Unigenes在Nt、Nr、KOG/COG、Swiss-Prot、Pfam、KEGG、GO全部100%注釋,各數(shù)據(jù)注釋個數(shù)及比例見表3,7個數(shù)據(jù)庫共注釋了178 319個Unigenes。

2.2 萌發(fā)前后基因表達水平

以組裝后的序列為模板,將沙藏前A1、A2、A3和萌發(fā)后B1、B2、B3各樣本的Clean reads與之比對,各樣本的匹配reads數(shù)目和匹配率見表4,沙藏前的匹配率為75.19%～75.67%,萌發(fā)后的匹配率為71.63%～74.23%。對各樣品表達的Unigenes數(shù)目進行統(tǒng)計并轉換為FPKM,然后根據(jù)FPKM大小劃分區(qū)間,各區(qū)間的表達量及所占比例見表5,萌發(fā)后的B1、B2和B3 FPKM>15的Unigenes數(shù)量均高于沙藏前的A1、A2和A3,說明經(jīng)沙藏萌發(fā)后,高表達的基因數(shù)目得到了增加。

2.3 萌發(fā)前后基因表達差異分析

比較萌發(fā)前后的各樣品基因(圖2: A),共有顯著性差異的Unigenes 11 817個,其中表達上調(diào)的有6 405個,表達下調(diào)的有5 412個。進一步將上調(diào)或下調(diào)差異基因在GO數(shù)據(jù)庫中富集(圖2: B),無論是上調(diào)還是下調(diào)的差異基因,均主要富集在生物過程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)中,相對而言,細胞組成(cellular component,CC)富集的轉錄本較少。而在BP中差異表達基因主要參與代謝過程、單生物代謝過程等,如參與代謝過程的顯著差異表達基因中上調(diào)的有2 251個,下調(diào)的有1 516個,包括Cluster-40845.0、Cluster-11099.0等上調(diào)的基因和Cluster-68615.79372、Cluster-68615.87349等下調(diào)的基因。在MF中差異表達基因主要參與催化活性、氧化還原酶活性等, 如參與催化活性的顯著差異表達基因中上調(diào)的有1 815個,下調(diào)的有1 327個,包括Cluster-68615.88556、Cluster-68615.88402等上調(diào)的基因和Cluster-68615.29401、Cluster-68615.62361等下調(diào)的基因。在CC中差異表達基因主要參與核糖體、核糖核蛋白復合物生成等,如參與核糖體的顯著差異表達基因中上調(diào)的有222個,下調(diào)的有95個。值得關注的是,在富集的這些GO Terms中,幾乎所有的上調(diào)差異基因數(shù)目都高于下調(diào)差異基因數(shù)目。

表 1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

表 2 測序reads質量統(tǒng)計Table 2 Quality statistics of sequencing reads

表 3 Unigenes注釋率Table 3 Unigenes annotation rate

表 4 各樣品reads 與組裝轉錄本比對Table 4 Mapped results of sample reads and assembly transcripts

為了明確差異表達基因相互協(xié)調(diào)及其生物學功能, 通過KEGG pathway顯著性富集確定差異表達基因參與的最主要生化代謝和信號轉導途徑,挑選富集最顯著的20個pathway進行展示(圖3)。差異表達基因主要富集于核糖體、植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、脂肪酸生物合成和延伸、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、花青素生物合成等通路中,顯著性差異表達的基因分別富集到核糖體通路中307個、淀粉和蔗糖代謝通路中124個、植物激素信號轉導通路中104個、類黃酮生物合成種37個、脂肪酸生物合成34個和延長34個,以及花青素生物合成中8個、黃酮和黃酮醇生物合成中5個。這些通路與種子萌發(fā)前后的生理變化和形態(tài)結構的形成有著緊密的關系。

A1. 氧化還原過程; A2. 代謝過程; A3. 脂肪酸生物合成過程; A4. 碳水化合物代謝過程; A5. 脂肪酸代謝過程; A6. 脂質代謝過程; A7. 細胞碳水化合物代謝過程; A8. 一元羧酸生物合成過程; A9. 脂質生物合成過程; A10. 細胞多糖代謝過程; A11. 核糖體生成; A12. 單生物代謝過程; A13. 核糖核蛋白復合物生成; A14. 細胞葡聚糖代謝過程; A15. 葡聚糖代謝過程; A16. 細胞壁; A17. 外部封裝結構; A18. 核糖體; A19. 質外體; A20. 脂肪酸合成酶復合物; A21. 核糖核蛋白復合物; A22. 脂質顆粒; A23. 單層包圍的脂質儲存體; A24. 催化活性; A25. 氧化還原酶活性; A26. 水解酶活性,作用于糖基鍵; A27. 水解酶活性,水解O-糖基化合物; A28. 四吡咯結合; A29. 血紅素結合; A30. 鐵離子結合; A31. 氧化還原酶活性,作用于配對供體,結合或減少分子氧; A32. 核糖體的結構成分; A33. 轉移酶活性,轉移除氨基酰基以外的?；?。A1. Oxidation-reduction process; A2. Metabolic process; A3. Fatty acid biosynthetic process; A4. Carbohydrate metabolic process; A5. Fatty acid metabolic process; A6. Lipid metabolic process; A7. Cellular carbohydrate metabolic process; A8. Monocarboxylic acid biosynthetic process; A9. Lipid biosynthetic process; A10. Cellular polysaccharide metabolic process; A11. Ribosome biogenesis; A12. Single-organism metabolic process; A13. Ribonucleoprotein complex biogenesis; A14. Cellular glucan metabolic process; A15. Glucan metabolic process; A16. Cell wall; A17. External encapsulating structure; A18. Ribosome; A19. Apoplast; A20. Fatty acid synthase complex; A21. Ribonucleoprotein complex; A22. Lipid particle; A23. Monolayer-surrounded lipid storage body; A24. Catalytic activity; A25. Oxidoreductase activity; A26. Hydrolase activity, acting on glycosyl bonds; A27. Hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds; A28. Tetrapyrrole binding; A29. Heme binding; A30. Iron ion binding; A31. Oxidoreductase activity, acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen; A32. Structuralconstituent of ribosome; A33. Transferase activity, transferring acyl groups other than amino-acyl groups.圖 2 萌發(fā)前(A)與萌發(fā)后(B)的基因表達差異Fig. 2 Different expression genes before (A) and after (B) germination

A. 芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成; B. 淀粉與蔗糖的代謝; C. 鞘脂代謝; D. 核糖體; E. 植物激素信號轉導; F. 苯丙烷類生物合成; G. 苯丙氨酸代謝; H. 吞噬體; I. 戊糖和葡萄醛酸相互轉化; J. 亞油酸代謝; K. 檸檬烯和蒎烯降解; L. 谷胱甘肽代謝; M. 半乳糖代謝; N. 類黃酮生物合成; O. 黃酮和黃酮醇的生物合成; P. 脂肪酸延長; Q. 脂肪酸合成; R. 氰基氨基酸代謝; S. 晝夜節(jié)律-植物; T. 花色素苷生物合成。A. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; B. Starch and sucrose metabolism; C. Sphingolipid metabolism; D. Ribosome; E. Plant hormone signal transduction; F. Phenylpropanoid biosynthesis; G. Phenylalanine metabolism; H. Phagosome; I. Pentose and glucuronate interconversions; J. Linoleic acid metabolism; K. Limonene and pinene degradation; L. Glutathione metabolism; M. Galactose metabolism; N. Flavonoid biosynthesis; O. Flavone and flavonol biosynthesis; P. Fatty acid elongation; Q. Fatty acid biosynthesis; R. Cyanoamino acid metabolism; S. Circadian rhythm-plant; T. Anthocyanin biosynthesis.圖 3 差異基因KEGG通路富集Fig. 3 KEGG pathway enrichment of differential genes

圖A: A. 芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成; B. 甾體生物合成; C. 淀粉與蔗糖的代謝; D. 核糖體; E. 植物激素信號轉導; F. 光合作用-天線蛋白; G. 光合作用; H. 苯丙烷類生物合成; I. 吞噬體; J. 戊糖和葡萄醛酸相互轉化; K. 氧化磷酸化; L. 檸檬烯和蒎烯降解; M. 類黃酮生物合成; N. 脂肪酸延長; O. DNA復制; P. 氰基氨基酸代謝; Q. 晝夜節(jié)律-植物; R. 光合生物中的碳固定; S. 生物素代謝; T. 花色素苷生物合成。圖B: A. 泛醌和其他萜類-醌的生物合成; B. 酪氨酸代謝; C. 芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成; D. 淀粉與蔗糖的代謝; E. 鞘脂代謝; F. 倍半萜和三萜生物合成; G. 植物激素信號轉導; H. 苯丙烷類生物合成; I. 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成; J. 苯丙氨酸代謝; K. 亞油酸代謝; L. 檸檬烯和蒎烯降解; M. 谷胱甘肽代謝; N. 半乳糖代謝; O. 類黃酮生物合成; P. 黃酮和黃酮醇的生物合成; Q. 脂肪酸合成; R. 晝夜節(jié)律-植物; S. 類胡蘿卜素合成; T. α-亞油酸代謝。Fig. A: A. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; B. Steroid biosynthesis; C. Starch and sucrose metabolism; D. Ribosome; E. Plant hormone signal transduction; F. Photosynthesis-antenna proteins; G. Photosynthesis; H. Phenylpropanoid biosynthesis; I. Phagosome; J. Pentose and glucuronate interconversions; K. Oxidative phosphorylation; L. Limonene and pinene degradation; M. Flavonoid biosynthesis; N. Fatty acid elongation; O. DNA replication; P. Cyanoamino acid metabolism; Q. Circadian rhythm plant; R. Carbon fixation in photosynthetic organisms; S. Biotin metabolism; T. Anthocyanin biosynthesis. Fig. B: A. Ubiquinone and other terpenoid quinone biosynthesis; B. Tyrosine metabolism; C. Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; D. Starch and sucrose metabolism; E. Sphingolipid metabolism; F. Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis; G. Plant hormone signal transduction; H. Phenylpropanoid biosynthesis; I. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; J. Phenylalanine metabolism; K. Linoleic acid metabolism; L. Limonene and pinene degradation; M. Glutathione metabolism; N. Galactose metabolism; O. Flavonoid biosynthesis; P. Flavone and flavonol biosynthesis; Q. Fatty acid biosynthesis; R. Circadian rhythm plant; S. Carotenoid biosynthesis; T. Alpha Linolenic acid metabolism.圖 4 前20條差異基因KEGG通路富集Fig. 4 TOP 20 KEGG pathway enrichment of differential genes

表 5 各樣品表達水平FPKM區(qū)間數(shù)量統(tǒng)計Table 5 FPKM interval quantity statistics of sample expression levels

為了進一步解析差異基因參與的通路變化,將上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進行KEGG pathway富集,分別展示挑選富集的前20條通路(上調(diào)圖4: A;下調(diào)圖4: B)。在上調(diào)的顯著性差異表達基因中,主要富集于核糖體(ribosome,231個)、吞噬體(phagosome,74個)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism,76個)、植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction,56個)、脂肪酸延伸(fatty acid elongation,24個)等通路中,其中富集到核糖體、淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸伸長等通路中的差異表達基因數(shù)顯著富集;而下調(diào)的差異表達基因主要富集在苯丙烷類生物合成(phenylpropanoid biosynthesis,48個)、植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction,48個)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism,48個)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis,22個)等通路中,并且植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等通路的差異表達基因顯著富集。可見,參與植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等通路中的差異表達基因,無論是上調(diào)還是下調(diào),均有較多的差異表達基因富集,這些基因可能與植物休眠、萌發(fā)等有著緊密的關系。

2.4 萌發(fā)前后激素信號轉導通路差異表達基因

基于上述分析,參與植物激素和信號轉導的基因在種子休眠與萌發(fā)過程中起著關鍵作用,為此將萌發(fā)前后顯著的差異基因進一步匹配到植物激素信號通路中,差異富集及表達量見圖5,結果表明富集于生長素通路中關鍵酶的Unigenes共有40個(27個上調(diào),3個下調(diào)),主要編碼的酶:生長素內(nèi)向轉運載體(auxin influx carrier,AUX1)、運輸抑制響應蛋白1(transport inhibitor response 1,TIR1)、生長素響應蛋白/吲哚-3-乙酸(auxin-responsive protein /indole-3-acetic acid,AUX/IAA)、生長素響應因子(auxin response factor,ARF)、生長素響應酰胺合成酶(gretchen hagen 3,GH3)基因家族(auxin responsive GH3 gene family)、SAUR(small auxin up RNA)家族蛋白(SAUR family protein), 并且除SAUR之外,與萌發(fā)前相比,萌發(fā)后多數(shù)為上調(diào),即萌發(fā)后表達量得到提高。而在油菜素內(nèi)酯生物合成過程中,參與編碼關鍵酶的Unigenes僅有6個,除編碼油菜素內(nèi)酯信號激酶(brassinosteroids-signaling kinase,BSK)的Unigenes外,編碼其他關鍵基因油菜素內(nèi)酯激酶受體抑制因子1(BRI1 kinase inhibitor 1,BRI1)、抗油菜素內(nèi)酯1/2(brassinosteroid resistant 1/2, BZR1/2)、木葡聚糖[木葡糖基轉移酶活性(Xyloglucan:xyloglucosyl transferase TCH4, TCH4)]、細胞周期素D3 (Cyclin D3, CYCD3) 的Unigenes均上調(diào),即萌發(fā)后表達量得到提高。

圖 5 萌發(fā)前后參與編碼植物激素信號轉導關鍵酶Unigenes表達水平Fig. 5 Expression levels of Unigenes encoding enzymes involved in plant hormone signal transduction before and after germination

圖 6 萌發(fā)前后參與編碼淀粉和糖代謝關鍵酶Unigenes表達水平Fig. 6 Expression levels of Unigenes encoding enzymes involved in starch and sucrose metabolism before and after germination

2.5 萌發(fā)前后淀粉和糖代謝通路差異表達基因

前述結果表明,淀粉和糖代謝在萌發(fā)前后發(fā)生急劇的變化,將萌發(fā)后較萌發(fā)前的所有顯著差異基因匹配到淀粉和糖代謝(ko00500)通路中,獲得差異基因編碼的關鍵蛋白。由圖6可知,蔗糖磷酸合酶(EC 2.4.1.14: sucrose-phosphate synthase)、海藻糖6-磷酸合酶(EC 2.4.1.15: trehalose 6-phosphate synthase)、1,4-α-葡聚糖分支酶(EC 2.4.1.18: 1,4-alpha-glucan branching enzyme)、海藻糖 6-磷酸酶(EC 3.1.3.12: trehalose 6-phosphate phosphatase)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2: beta-amylase)、果糖激酶(EC 2.7.1.4: fructokinase)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(EC: 5.3.1.9: glucose-6-phosphate isomerase)等關鍵酶的Unigenes均下調(diào),相反地,糖原磷酸化酶(EC 2.4.1.1: glycogen phosphorylase)、4-α-葡聚糖轉移酶(EC 2.4.1.25: 4-alpha-glucanotransferase)、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶(EC 2.7.7.27: glucose-1-phosphate adenylyltransferase)、內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4: endoglucanase)、胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員(EC 3.1.4.1: ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member)等關鍵酶的Unigenes均上調(diào),而麥芽糖酶-葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.20: maltase-glucoamylase)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21: beta-glucosidase)等酶的Unigenes既有上調(diào)也有下調(diào)。編碼這些關鍵酶的Unigenes中上調(diào)的Unigenes與淀粉降解和種子萌發(fā)有關,而下調(diào)的Unigenes則與種子的休眠、物質的貯藏有關。

2.6 差異基因qRT-PCR分析

為了驗證轉錄組獲得的數(shù)據(jù),于植物信號轉導通路中,隨機選擇具有顯著差異表達的6個基因,采用qRT-PCR進行分析,由圖7可知,各樣本的表達量與轉錄組表達的趨勢基本一致。

3 討論與結論

植物的種子萌發(fā)受自身激素和生理(He et al., 2022),以及環(huán)境中水分(Alquraan et al., 2022)、溫度(Yang et al., 2022)等因素影響。黃精種子因果實的成熟度、著生部位不同,種子的含水率、可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉種類、粗脂肪、超氧化物歧化酶等生理生化成分存在差異,從而導致種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢不同(常暉等, 2022)。沙藏是打破種子休眠的常用方法之一,多花黃精種子經(jīng)過約150 d沙藏后,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢得到顯著提高(劉保財?shù)? 2015)。

本研究對多花黃精種子經(jīng)沙藏萌發(fā)前后差異表達基因進行GO富集分析,結果發(fā)現(xiàn)顯著性差異基因主要參與代謝過程、催化活性、單生物代謝過程、氧化還原酶活性、核糖體等。Li等(2022)對多花黃精不同生長年限根莖進行轉錄組測序分析,差異基因的GO富集分析也主要參與催化活性、代謝過程等,這與本研究結果基本一致,也與羅麗娜和向增旭(2021)報道的黃精種子休眠解除的差異基因GO富集結果基本一致。

KEGG pathway顯著性富集分析表明萌發(fā)后較萌發(fā)前的差異表達基因主要富集于核糖體、植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等通路中,上調(diào)的差異基因主要富集在核糖體(231個)、吞噬體(74個)、淀粉和蔗糖代謝(76個)、植物激素信號轉導(56個)等通路中;下調(diào)的差異基因主要富集在苯丙烷生物合成(48個)、植物激素信號轉導(48個)、淀粉和蔗糖代謝(48個)等通路中,而富集到淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導等通路中的差異基因,無論是上調(diào)還是下調(diào),均有較多的差異表達基因參與,與前人報道結果基本一致(張紅瑞等, 2021)。因此,這兩條通路可作為種子萌發(fā)前后的特征性通路。KEGG pathway富集到植物激素通路的基因有354個,萌發(fā)前后有顯著差異表達的基因有104個,其中上調(diào)的有56個和下調(diào)的48個,尤其是富集于生長素通路中關鍵酶的基因有40個(27個上調(diào),3個下調(diào)),這與報道多花黃精種子萌發(fā)過程中IAA、ABA、GA3和TZR含量存在變化結果一致(陳怡等, 2020; 張武君等,2022),即種子沙藏過程中,許多基因參與了植物激素的代謝與轉導,特別是編碼生長素類通路上關鍵酶的基因。值得引起關注的是油菜素內(nèi)酯在種子萌發(fā)過程中作用,雖然參與編碼關鍵酶的Unigenes僅有6個,但萌發(fā)后,基本上都是表達上調(diào)。富集到淀粉和蔗糖的代謝通路的基因有397個,萌發(fā)前后有顯著差異表達的基因有124個,其中上調(diào)的有76個,下調(diào)的有48個,編碼蔗糖磷酸合酶、海藻糖6-磷酸合酶等基因表達量下調(diào),而編碼磷酸化酶、4-α-葡聚糖轉移酶等基因的表達量上調(diào),這與報道的多花黃精種子中含有淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性糖等結果一致(王晶晶等, 2022),即種子在沙藏過程中,淀粉的種類、糖的形態(tài)逐步由萌發(fā)前的貯藏形式變?yōu)樗庑问?增加這些物質的水溶性,以滿足種子萌發(fā)的生理需要。可見,編碼植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝植物激素通路上的基因,可作為種子萌發(fā)前后的主要特征性基因。此外,有部分差異基因參與了脂肪酸延伸、脂肪酸生物合成途徑,這與報道的多花黃精種子內(nèi)分布脂肪油一致(祝明珠等, 2020)。而本研究中與光合相關通路的差異基因均出現(xiàn)下調(diào),與報道的光照對多花黃精種子萌發(fā)未有顯著影響結果基本一致(周新華等, 2016)。有8個差異顯著表達的基因參與了花青素通路,是否與多花黃精植株莖稈顏色有綠色和紫色有關(姜武等, 2021),有待進一步研究。

A. 萌發(fā)前; B. 萌發(fā)后。A. Before germination; B. After germination.圖 7 萌發(fā)前后6個差異基因的qRT-PCR驗證Fig. 7 Verification of six selected differentially expressed genes by qRT-PCR before and after germination

綜上所述,多花黃精種子經(jīng)沙藏萌發(fā)后發(fā)生了系列的生理與形態(tài)結構變化,本研究初步分析了種子萌發(fā)前后關鍵基因的變化,明確了植物激素信號轉導與淀粉和蔗糖代謝在多花黃精種子萌發(fā)前后起著關鍵作用,進一步闡明了植物激素信號轉導與淀粉和蔗糖代謝通路的關鍵基因,可作為多花黃精種子的萌發(fā)特征,為多花黃精種子的生理、育苗等深入研究提供參考。