田懷志, 郭 豪, 田 浩, 熊興偉, 張素勤, 耿廣東,3*

( 1. 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025; 2. 遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 貴州 遵義 563000; 3. 貴州大學(xué)辣椒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 貴陽(yáng) 550025 )

辣椒(Capsicumannuum)作為世界上第二大茄科蔬菜,是我國(guó)種植面積最大的蔬菜(鄒學(xué)校等,2020)。伴隨著辣椒用途的不斷開(kāi)發(fā)和加工型產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,其已成為我國(guó)鄉(xiāng)村振興的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是,辣椒屬于淺根系作物,根系不發(fā)達(dá),再生能力弱,耐澇能力差。長(zhǎng)江中下游地區(qū)澇害頻繁發(fā)生,導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)減收嚴(yán)重(劉周斌等,2015)。目前,對(duì)辣椒耐澇脅迫方面的研究較少且主要集中于生理方面,對(duì)其分子機(jī)理的研究更少。耐澇是受多基因控制的性狀,難以定位,僅基于表型很難快速地將這些性狀加以利用。利用分子標(biāo)記進(jìn)行預(yù)選可減少群體規(guī)模,并可在辣椒生長(zhǎng)早期篩選出理想的基因型,可加速辣椒新品種培育進(jìn)程。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)利用高通量測(cè)序進(jìn)行基因表達(dá)水平分析,可以反映基因的轉(zhuǎn)錄水平,能快速有效地獲得基因序列。其因高通量、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)領(lǐng)域。RNA-seq技術(shù)加速了新基因表達(dá)模式和功能的分析(Jain et al., 2016),是分析生物體基因表達(dá)量變化的重要工具(Zhang et al., 2017),其對(duì)非模式植物的基因挖掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)均具有重要意義,是探究植物耐澇分子機(jī)制的有力工具。Kinga等(2021)對(duì)兩個(gè)耐澇性不同的黃瓜品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)在耐澇品種中所鑒定的基因與增強(qiáng)糖酵解、氨基酸代謝和不定根發(fā)育相關(guān)。Xu等(2017)對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)耐澇植株表現(xiàn)出更高的碳水化合物代謝以及三磷酸腺苷和還原型輔酶Ⅰ的再生,以應(yīng)對(duì)水澇脅迫帶來(lái)的能量危機(jī)。Pimprapai等(2011)研究了兩個(gè)不同耐澇性豌豆品種的分子響應(yīng)變化,通過(guò)對(duì)根的轉(zhuǎn)錄組研究,發(fā)現(xiàn)能量代謝通路、激素、細(xì)胞壁修飾、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和過(guò)氧化物酶相關(guān)的多個(gè)差異表達(dá)基因可能有助于豌豆的耐澇。Li等(2022)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)耐澇獼猴桃根系通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物和氨基酸代謝來(lái)應(yīng)對(duì)水澇脅迫。另外,葉鵬等(2019)通過(guò)對(duì)金花茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘,獲得SSR位點(diǎn)分布特征,為SSR引物設(shè)計(jì)與篩選提供依據(jù)。

SSR因其具有豐富的數(shù)量、較高的多態(tài)性、良好的重復(fù)性以及共顯性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用(羅冉等,2010),但SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)需要經(jīng)過(guò)構(gòu)建文庫(kù)、篩選和測(cè)序等工作,既昂貴又繁瑣。如今,大規(guī)模開(kāi)展的cDNA測(cè)序工作以及飛速發(fā)展的生物信息學(xué),使得EST(expressed sequence tag)為SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、方便的方法。隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,EST數(shù)量逐步增加,使得EST-SSR標(biāo)記越來(lái)越豐富。與傳統(tǒng)SSR相比,EST-SSR具有開(kāi)發(fā)便宜、共顯性、穩(wěn)定、通用性好等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于基因標(biāo)記(Varshney et al., 2005;姜春芽等,2009)?，F(xiàn)已在木瓜(伍越等,2021)、香合歡(安琪等,2022)、黃精(陳友吾等,2020)、龍眼(胡文舜等,2019)、川芎(袁燦等,2017)、紅麻(萬(wàn)雪貝等,2017)、楓香(李輝等,2023)等植物上開(kāi)發(fā)與應(yīng)用,并廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種、基因定位、遺傳多樣性分析和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等研究。已有研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)或轉(zhuǎn)錄組有限的辣椒EST序列開(kāi)發(fā)了一些引物,并在實(shí)踐中得到了應(yīng)用(傅鴻妃等,2018;管俊嬌等,2019),但辣椒可公開(kāi)獲得的SSR標(biāo)記有限(Huang et al., 2000),已公開(kāi)報(bào)道可利用的SSR標(biāo)記僅有500多個(gè)(李永平等,2016),開(kāi)發(fā)數(shù)量偏少,難以適應(yīng)辣椒高密度作圖的要求,亟需開(kāi)發(fā)更多的SSR標(biāo)記用于遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定以及分子輔助育種等。

本研究在水澇脅迫下從耐澇辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測(cè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs),并對(duì)其進(jìn)行組裝與功能注釋;通過(guò)RNA-seq技術(shù)獲得豐富的辣椒SSR位點(diǎn)信息,進(jìn)行辣椒EST-SSR引物設(shè)計(jì),隨后采用PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)篩選出多態(tài)性好、穩(wěn)定的辣椒EST-SSR引物,并通過(guò)對(duì)不同辣椒品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析以驗(yàn)證引物的應(yīng)用效果。擬探討:(1)辣椒對(duì)水澇脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制;(2)辣椒EST-SSR位點(diǎn)的分布及序列特征;(3)辣椒多態(tài)性EST-SSR引物。本研究以期為今后辣椒遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化分析、功能基因標(biāo)記和分子輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為‘ZHC1’(不耐澇朝天椒)、‘ZHC2’(耐澇朝天椒)和‘大方皺椒’(線椒)?！甖HC1’和‘ZHC2’為遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)的純系材料,‘大方皺椒’為貴州當(dāng)?shù)胤N植的常規(guī)辣椒品種。

1.2 RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及基因功能注釋

以耐澇‘ZHC2’辣椒為試驗(yàn)材料,其培養(yǎng)及淹水處理參考郭豪等(2022)的方法。待辣椒植株長(zhǎng)至5片葉時(shí),分別進(jìn)行淹水6 h(T1)、淹水24 h(T2)和恢復(fù)1 h(T3)3個(gè)處理,并以正常培養(yǎng)的辣椒材料作為對(duì)照(CK)。試驗(yàn)包括3次生物學(xué)重復(fù),每次生物學(xué)重復(fù)由10株長(zhǎng)勢(shì)一致的辣椒根系混合而成,取樣后立即放入液氮中快速冷凍,然后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存,使用TRIzol?試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA,用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建在華大基因技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行,使用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)、Trinity軟件分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的雙末端測(cè)序、Clean reads組裝以及聚類(lèi)去冗余,獲得單基因(Unigene)。對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene Ontology)功能注釋,對(duì)Unigene與NT(NCBI non-redundant nucleotide sequence database)、NR(NCBI non-redundant protein sequences database)、SwissProt、Pfam(protein family)和KOG(euKaryotic Ortholog Groups)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)鑒別和引物設(shè)計(jì)

使用MISA V1.0在線軟件測(cè)定Unigene中的SSR,限定單核苷酸至六核苷酸序列SSR的重復(fù)次數(shù)至少為12個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、5個(gè)、4個(gè)和4個(gè);并限定復(fù)合微衛(wèi)星形成的標(biāo)準(zhǔn)為兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp(Thiel et al., 2003)。使用Primer 3在線工具設(shè)計(jì)引物(Andreas et al., 2012),引物設(shè)計(jì)原則:(1)引物長(zhǎng)度為18～24 bp;(2)產(chǎn)物大小為80～300 bp;(3)退火溫度為55～62 ℃,上下游引物退火溫度差值小于5 ℃;(4)GC含量為40%～60%;避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。從中任意挑選30對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

1.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增

以‘ZHC1’‘ZHC2’和‘大方皺椒’為材料,待植株長(zhǎng)至5葉1心時(shí),采集頂部?jī)扇~,液氮速凍后于-80 ℃中保存。通過(guò)CTAB法進(jìn)行DNA提取,用于引物的有效性篩選。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序見(jiàn)表1,PCR反應(yīng)在T100TMThermal Cycler PCR儀(BIO-RAD公司)上進(jìn)行。

表 1 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序Table 1 PCR reaction system and procedure

1.5 EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。于120 V電泳2.0 h后,進(jìn)行銀染顯色和照相,分析EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝分析

從耐澇‘ZHC2’辣椒不同淹水處理樣品中分離RNA,并對(duì)原始Reads進(jìn)行過(guò)濾和組裝,總共構(gòu)建了12個(gè)cDNA文庫(kù)。由表2可知,每個(gè)處理中Q20的比例均高于Q20規(guī)定的極限值(>80%),GC含量均低于50%,表明測(cè)序質(zhì)量良好。

對(duì)不同處理的辣椒植物根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,構(gòu)建了12個(gè)cDNA文庫(kù),獲得Clean reads共153.99 Gb,對(duì)其組裝去冗余后,得到128 939個(gè)Unigene(圖1)。總長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度、GC含量依次為55 082 725、1 101 bp和40.57%。在所有的Unigene中,57 243個(gè)基因長(zhǎng)度介于200～1 000 bp之間,所占比例為44.40%,35 213個(gè)基因長(zhǎng)度介于1 000～2 000 bp之間,所占比例為27.31%,19 321個(gè)基因長(zhǎng)度介于2 000～3 000 bp之間,所占比例為14.98%,17 162個(gè)基因長(zhǎng)度大于3 000 bp,所占比例為13.31%。

2.2 基因的功能注釋

將Unigene比對(duì)到NR、NT、SwissProt、KOG、KEGG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(表3)中,分別有102 123個(gè)(79.20%)、110 157個(gè)(85.43%)、70 203個(gè)(54.45%)、73 539個(gè)(57.03%)、77 646個(gè)(60.22%)、77 442個(gè)(60.06%)以及68 216個(gè)(52.91%)Unigene獲得功能注釋,被任意一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的Unigene有116 057個(gè),占Unigene總數(shù)的90.01%。

圖 1 辣椒單基因長(zhǎng)度分布Fig. 1 Distribution of Unigene length in hot pepper

表 2 辣椒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果Table 2 Results of hot pepper transcriptome sequencing

將水澇脅迫與對(duì)照相比的DEGs進(jìn)行GO功能注釋。共有43 446個(gè)DEGs被注釋在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中(圖2),可分成分子功能、細(xì)胞組分以及生物過(guò)程三大類(lèi)。分子功能中主要方面是結(jié)合、催化活性及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。細(xì)胞組分中主要方面是細(xì)胞解剖實(shí)體、細(xì)胞內(nèi)以及蛋白質(zhì)復(fù)合物。在生物過(guò)程中細(xì)胞過(guò)程占據(jù)主導(dǎo)地位,其次是代謝過(guò)程和生物調(diào)節(jié)。13 702個(gè)DEGs被注釋到KEGG通路中(圖3)。其中碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝與氨基酸代謝是主要的代謝途徑。與代謝相關(guān)的DEGs有8 404個(gè),包含碳水化合物(16.52%)、氨基酸(9.22%)、脂質(zhì)(7.03%)、其他次級(jí)代謝物的生物合成(6.08%)以及能量代謝(4.99%)等;在遺傳信息處理中,主要為翻譯和折疊、分類(lèi)和降解以及轉(zhuǎn)錄3個(gè)過(guò)程;在環(huán)境信息處理途徑中主要是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與跨膜運(yùn)輸;運(yùn)輸和分解代謝及環(huán)境適應(yīng)是細(xì)胞過(guò)程和有機(jī)系統(tǒng)中的主要途徑。這說(shuō)明在淹水過(guò)程中辣椒受到碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑的協(xié)同作用,這些通路可能在辣椒水澇脅迫應(yīng)答中起到重要作用。

2.3 EST-SSR的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

EST-SSR的長(zhǎng)度范圍為12～110 bp,其中12 bp和15 bp分布最多,分別有5 331個(gè)(20.06%)和5 523個(gè)(20.78%)SSR位點(diǎn)(圖4)。在單核苷酸和二核苷酸中,最常見(jiàn)的片段長(zhǎng)度為12 bp,在單核苷酸中有2 909個(gè)(10.95%)位點(diǎn),二核苷酸中有2 422個(gè)(9.11%)位點(diǎn)。單核苷酸和二核苷酸最長(zhǎng)的片段分別是102 bp和96 bp。在三核苷酸中,主要長(zhǎng)度類(lèi)型是15 bp和18 bp,二者分別有4 510個(gè)(16.97%)個(gè)和1 945個(gè)(7.32%)位點(diǎn),二者占三核苷酸位點(diǎn)總數(shù)的78.36%。四核苷酸及五核苷酸均以20 bp為主,分別有235個(gè)(0.88%)和340個(gè)(1.28%)位點(diǎn)。六核苷酸中最長(zhǎng)的為90 bp,檢測(cè)到4個(gè)位點(diǎn),24 bp占絕大多數(shù)(568,2.14%)。在本研究中,SSR有6 018條SSR的長(zhǎng)度大于20 bp,占SSR總數(shù)的22.65%;20 556條SSR分布于12～19 bp之間,占SSR總數(shù)的77.35%。

2.4 EST-SSR的頻率和分布特點(diǎn)

使用MISA V1.0在線軟件對(duì)所有的Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)26 574個(gè)SSR位點(diǎn)分布在24 889個(gè)Unigene中,其中23 451個(gè)Unigene含有單一SSR,1 438個(gè)Unigene包含3 123個(gè)SSR位點(diǎn),SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率(SSR數(shù)目占Unigene總數(shù)百分比)為20.61%,SSR發(fā)生頻率(含SSR的Unigene數(shù)占Unigene總數(shù)百分比)為19.30%。從表4可以看出,辣椒EST-SSR序列主要以4～10次重復(fù)為主,共15 411個(gè),占總EST-SSR的57.99%;其次是11～20次重復(fù),共10 125個(gè),占總EST-SSR的38.10%;20次以上的重復(fù)較少,共1 038個(gè),占總EST-SSR的3.91%。在已鑒定的SSR中,單核苷酸基序SSR最豐富(9 902,37.26%),其次是三核苷酸(8 238,31.00%)、二核苷酸(6 760,25.44%)、六核苷酸(838,3.15%)、五核苷酸(466,1.75%)和四核苷酸(370,1.39%)的基序SSR。

1. 結(jié)合; 2. 催化活性; 3. 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性; 4. 結(jié)構(gòu)分子活性; 5. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性; 6. 分子功能調(diào)節(jié)活性; 7. 抗氧化活性; 8. 翻譯調(diào)節(jié)活性; 9. 分子換能器活性; 10. 其他; 11. 細(xì)胞解剖實(shí)體; 12. 細(xì)胞內(nèi); 13. 蛋白質(zhì)復(fù)合物; 14. 細(xì)胞過(guò)程; 15. 代謝過(guò)程; 16. 生物調(diào)節(jié); 17. 對(duì)刺激的反應(yīng); 18. 生物過(guò)程的調(diào)節(jié); 19. 定位; 20. 發(fā)育過(guò)程; 21. 信號(hào)傳導(dǎo); 22. 多細(xì)胞生物過(guò)程; 23. 繁殖; 24. 繁殖過(guò)程; 25. 生物過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié); 26. 生物過(guò)程正調(diào)節(jié); 27. 多生物過(guò)程; 28. 生物間的相互作用; 29. 增長(zhǎng); 30. 其他。1. Binding; 2. Catalytic activity; 3. Transporter protein activity; 4. Structural molecule activity; 5. Transcription regulator activity; 6. Molecular functional regulation activity; 7. Antioxidant activity; 8. Translation regulator activity; 9. Molecular transducer activity; 10. Other; 11. Cellular anatomical entity; 12. Intracellular; 13. Protein complex; 14. Cellular process; 15. Metabolic process; 16. Biological regulation; 17. Response to stimulus; 18. Regulation of biological process; 19. Localization; 20. Development process; 21. Signaling; 22. Multicellular organismal process; 23. Reproduction; 24. Reproductive process; 25. Negative regulation of biological process; 26. Positive regulation of biological process; 27. Multibiological processes; 28. Interspecies interaction between organisms; 29. Growth; 30. Other.圖 2 辣椒DEGs的GO注釋Fig. 2 GO annotation of hot pepper DEGs

1. 核苷酸代謝; 2. 聚糖生物合成和代謝; 3. 萜類(lèi)和聚酮類(lèi)的代謝; 4. 輔因子和維生素的代謝; 5. 其他氨基酸的代謝; 6. 能量代謝; 7. 其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成; 8. 脂質(zhì)代謝; 9. 氨基酸代謝; 10. 碳水化合物代謝; 11. 全局和概覽圖; 12. 復(fù)制和修復(fù); 13. 轉(zhuǎn)錄; 14. 折疊、分類(lèi)和降解; 15. 翻譯; 16. 膜運(yùn)輸; 17. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 18. 運(yùn)輸和分解代謝; 19. 環(huán)境適應(yīng)。1. Nucleotide metabolism; 2. Glycan biosynthesis and metabolism; 3. Metabolism of terpenoids and polyketides; 4. Metabolism of cofactors and vitamins; 5. Metabolism of other amino acids; 6. Energy metabolism; 7. Biosynthesis of other secondary metabolites; 8. Lipid metabolism; 9. Amino acid metabolism; 10. Carbohydrate metabolism; 11. Global and overview maps; 12. Replication and repair; 13. Transcription; 14. Folding, sorting and degradation; 15. Translation; 16. Membrane transport; 17. Signal transduction; 18. Transport and catabolism; 19. Environmental adaptation.圖 3 辣椒DEGs的KEGG注釋Fig. 3 KEGG annotation of hot pepper DEGs

表 3 單基因功能注釋Table 3 Function annotation of Unigene

2.5 EST-SSR基序重復(fù)類(lèi)型和頻率特征

從辣椒EST-SSR核苷酸的基序類(lèi)型來(lái)看,EST-SSR以單核苷酸為主要類(lèi)型,約9 902個(gè),占總SSR的37.26%,其次是三核苷酸8 238個(gè)(31.00%)和二核苷酸6 760個(gè)(25.44%),三者共占檢測(cè)出的SSR總數(shù)的93.70%。在單核苷酸中,A/T是主要類(lèi)型,占全部單核苷酸的95.58%,其次為三核苷酸,以TTG/CAA、ACA/TGT為主要類(lèi)型,分別占三核苷酸SSR的18.10%、12.71%。在二核苷酸中, 以AG/CT、TC/GA、AT和TA的比例最高,占所有二核苷酸SSR的23.30%、21.02%、20.58%和17.25%。而四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸3種核苷酸基序出現(xiàn)頻率均較低,三者一起共占SSR總數(shù)的6.30%。在四核苷酸中,以TTTA/TAAA、AATA/TATT和AAAT/ATTT的比例最高,分別占四核苷酸SSR的13.78%、10.27%和9.73%;在五核苷酸中,以ATGGT、ACTCA所占比例最高,各占五核苷酸SSR的6.01%和4.08%;在六核苷酸中,以GAAGAG、GAGCTG的數(shù)量最多,各占六核苷酸SSR的3.82%和3.10%(表5)。

表 4 辣椒EST-SSR的類(lèi)型、數(shù)量及分布頻率Table 4 Type, number and distribution frequency of EST-SSR in hot pepper

表 5 辣椒EST-SSR基序的分布Table 5 Distribution of EST-SSR motif in hot pepper

2.6 辣椒EST-SSR引物篩選與驗(yàn)證

使用Primer 3在線工具對(duì)含有SSR的21 008條EST序列設(shè)計(jì)了10 002對(duì)SSR引物。為驗(yàn)證其有效性,隨機(jī)選擇30對(duì)引物進(jìn)行合成,引物信息見(jiàn)表6,以‘大方皺椒’‘ZHC1’ 和‘ZHC2’ 3個(gè)辣椒材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增與引物篩選。所挑選的全部引物均可擴(kuò)增,由圖5可知,其中7對(duì)引物在3個(gè)辣椒材料中可以擴(kuò)增出目的條帶,占挑選引物總數(shù)的23.33%,推測(cè)可用的EST-SSR數(shù)量有2 333對(duì),可作為后續(xù)參考使用。引物分別為Unigene12971_All_10480、CL10067.Contig1_All_6591、CL10579.Contig2_All_6940、CL10070.Contig1_All_6593、CL10751.Contig1_All_7072、CL10564.Contig1_All_6936、CL10056.Contig8_All_6589。

3 討論與結(jié)論

3.1 辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝與功能注釋

通過(guò)植物RNA-seq技術(shù)可以獲取大量的轉(zhuǎn)錄本信息,這為植物基因表達(dá)的綜合分析提供了合理而可信的數(shù)據(jù)資源(賈新平等,2014)。因此,在淹水脅迫下辣椒轉(zhuǎn)錄組信息的系統(tǒng)分析為全面了解辣椒耐澇分子機(jī)制和挖掘新的耐澇基因奠定基礎(chǔ)。本研究對(duì)不同淹水時(shí)間的辣椒根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)數(shù)據(jù)組裝共獲得128 939個(gè)Unigene。把這些Unigene在NR、NT、SwissProt、KEGG、KOG、Pfam和GO數(shù)據(jù)庫(kù)中加以注釋,得到注釋Unigene共有116 057個(gè),占總Unigene的90.01%,有12 882個(gè)Unigene沒(méi)有得到注釋。與其他植物相比(夏銘澤,2022;張小紅等,2023),在水澇脅迫下辣椒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因數(shù)量及注釋效率均較高。組裝得到的Unigene不能在已知相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋,這種現(xiàn)象是普遍存在的,這與所得部分Unigene片段太短、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋信息缺乏、辣椒中存在新基因等因素都有關(guān)聯(lián)(張少平等,2016)?？梢赃M(jìn)一步研究未被注釋的基因,確定這些基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用,從而豐富基因數(shù)據(jù)庫(kù)(馬彥軍等,2020)。本研究在對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG注釋時(shí),發(fā)現(xiàn)碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)等代謝注釋最多,其次為翻譯、折疊、遺傳信息分類(lèi)和降解以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。植物在受到水澇脅迫的時(shí)候,植物根系缺氧導(dǎo)致線粒體有氧呼吸受到極大抑制。碳水化合物代謝對(duì)植物存活至關(guān)重要,在此過(guò)程中,植物通過(guò)積累易利用糖類(lèi)和額外丙酮酸等物質(zhì)以保持其能量供應(yīng)。氨基酸代謝在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用(Hildebrandt et al., 2018)。其中,對(duì)脯氨酸的研究最為廣泛, 但其他氨基酸, 如支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)也同樣重要(Huang et al., 2017),其氧化會(huì)產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷(Hildebrandt et al., 2015);而丙氨酸和天冬氨酸在其相應(yīng)氨基轉(zhuǎn)移酶作用下通過(guò)影響草酰乙酸的量而參與丙酮酸的再生,可以為植物逆境生存提供物質(zhì)與能量,這可能是‘ZHC2’辣椒耐澇性強(qiáng)的原因之一。在脂質(zhì)代謝過(guò)程中,耐缺氧型個(gè)體脂質(zhì)分解加強(qiáng),其分解為甘油和游離脂肪酸。甘油可用于碳和能量供應(yīng)以及不定根發(fā)育,而游離脂肪酸可為新生成的細(xì)胞提供成分。當(dāng)辣椒受到水澇脅迫時(shí),碳水化合物代謝可以產(chǎn)生足夠能量使植物維持多種生理生化反應(yīng),同時(shí)植物需要合成大量的酶來(lái)催化體內(nèi)的多種生理生化反應(yīng),將受到的刺激信號(hào)進(jìn)行傳導(dǎo),以便植物能產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)不良環(huán)境造成的影響。試驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)重要差異基因進(jìn)行分析,篩選出與辣椒耐澇緊密相關(guān)的基因,并解釋辣椒耐澇的分子機(jī)制。

1-21. 點(diǎn)樣順序?yàn)閁nigene12971_All_10480、CL10067.Contig1_All_6591、CL10579.Contig2_All_6940、CL10070.Contig1_All_6593、CL10751.Contig1_All_7072、CL10564.Contig1_All_6936、CL10056.Contig8_All_6589引物的擴(kuò)增結(jié)果,每對(duì)引物中以‘ZHC1’‘ZHC2’‘大方皺椒’的順序點(diǎn)樣。M. DL2000 Marker。1-21. The orders of sampling are the amplification results of Unigene12971_All_10480, CL10067.Contig1_All_6591, CL10579.Contig2_All_6940, CL10070.Contig1_All_6593, CL10751.Contig1_All_7072, CL10564.Contig1_All_6936, CL10056.Contig8_All_6589 primers, respectively. Among each pair of primers, the samples are ‘ZHC1’, ‘ZHC2’ and ‘Dafangzhoujiao’, respectively. M. DL2000 Marker.圖 5 7對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 Amplification results of seven pairs of EST-SSR primers

3.2 辣椒轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的重復(fù)類(lèi)型與頻率特征

本研究發(fā)現(xiàn),26 574個(gè)SSR位點(diǎn)分布于128 939個(gè)辣椒無(wú)冗余Unigene中,EST-SSR出現(xiàn)頻率為20.61%,高于Yi等(2006)、劉峰等(2012)和魏兵強(qiáng)等(2013)的辣椒EST-SSR結(jié)果,低于蓖麻(Qiu et al., 2010)、木薯(Kunkeaw et al., 2011)、灰氈毛忍冬(劉思思等,2021)的EST-SSR結(jié)果,這可能是由物種間SSR信息的差異所造成的,也可能是因?yàn)橛糜诜治龅腅ST數(shù)量在不同物種間各不相同,或者用于搜索SSR所使用的軟件算法及所設(shè)定的參數(shù)不同(吳智明等,2012)。辣椒EST-SSR單核苷酸頻率最高(37.26%),其次是三核苷酸(31.00%)和二核苷酸(25.44%)。在辣椒單核苷酸EST-SSR中,絕大部分基元為A/T,這與魏兵強(qiáng)等(2013)和劉峰等(2012)的結(jié)果一致。在二核苷酸重復(fù)類(lèi)型中,出現(xiàn)頻率最高的是AG/CT和TC/GA,其次是AT和TA,而GC/CG出現(xiàn)頻率低,這與Yi等(2006)、Kantety等(2002)和張宇等(2010)在辣椒上的研究結(jié)果基本一致,而且與珍珠粟(Selthilvel et al., 2008)、石蒜(李青竹等,2021)、蝴蝶蘭(張水明等,2012)和毛竹(張智俊等,2011)的結(jié)果相似,說(shuō)明EST-SSR在其發(fā)生和進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。GA/TC在mRNA水平上可以代表遺傳密碼子GAG、AGA、UCU和CUC,并可以分別翻譯成精氨酸、谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸,而丙氨酸和亮氨酸分別以8%和10%的高頻率存在于蛋白質(zhì)中,這可能是GA/TC在EST中高頻出現(xiàn)的原因(Kantety et al., 2002)。在三核苷酸中,出現(xiàn)頻率高的是TTG/CAA和ACA/TGT,這與Kumpatla等(2005)和Yi等(2006)對(duì)辣椒EST-SSR的研究結(jié)果相符合。但劉峰等(2012)研究認(rèn)為,除單核苷酸A/T重復(fù)序列外,辣椒EST-SSR最多的是三核苷酸重復(fù)序列AAC/GTT和AAG/CTT,其次是二核苷酸重復(fù)序列。這可能是由SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)(基序長(zhǎng)度、重復(fù)次數(shù)等)、分析軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)大小不同所造成。

3.3 辣椒轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的多態(tài)性

在本研究中,共有6 018條SSR長(zhǎng)度大于20 bp,占全部SSR總數(shù)的22.65%;20 556條SSR長(zhǎng)度介于12～19 bp之間,占所有SSR總數(shù)的77.35%,說(shuō)明辣椒EST-SSR具有較好的多態(tài)性(Temnykh et al., 2001),這與盛文濤等(2019)的研究結(jié)果基本一致,可用于辣椒分子標(biāo)記研究。根據(jù)26 574條EST序列設(shè)計(jì)了10 002對(duì)SSR位點(diǎn)特異性引物,從中隨機(jī)挑選了30對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,都可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增,較大的數(shù)據(jù)量和較高的拼接質(zhì)量應(yīng)是EST擴(kuò)增效率高的原因。在30對(duì)擴(kuò)增引物中,有7對(duì)(23.3%)引物在3份辣椒中表現(xiàn)出多態(tài)性,低于李永平等(2016)的研究結(jié)果(35.5%),其原因可能與本研究所選用的3份辣椒材料均為貴州地方品種,并且‘ZHC1’和‘ZHC2’為朝天椒,材料間的遺傳背景差異小有關(guān)。EST-SSR來(lái)自基因組轉(zhuǎn)錄區(qū),而轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列通常比較保守。因此,一般來(lái)講,EST-SSR所檢測(cè)到的多態(tài)性要低于基因組SSR。多態(tài)性檢測(cè)能力的大小也與所測(cè)試的植物材料有關(guān),如果所用的植物材料遺傳背景差異較大,則標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性就高,反之,則標(biāo)記的多態(tài)性就會(huì)大大降低。應(yīng)用EST-Genome、Phrap、Clustalw、BLAST等軟件對(duì)EST序列進(jìn)行精確分析以增加供試材料的基因型與數(shù)量是提高EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性和價(jià)值性的有效途徑(張宇等,2010)。因?yàn)镋ST-SSR是對(duì)基因內(nèi)部變異的一種直接評(píng)價(jià),所以它將可能與某些表型、生理生化特征或某個(gè)特定的環(huán)境適應(yīng)型相聯(lián)系,反映植物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄部分(姚利華等,2008)。挑選的EST-SSR標(biāo)記可用于遺傳多樣性分析與分子標(biāo)記輔助育種。由于其豐富的多態(tài)性信息含量,因此EST-SSR可為遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)。下一步可尋找與辣椒耐澇基因連鎖的EST-SSR標(biāo)記,以應(yīng)用于辣椒耐澇育種研究。