李晴晴，孟盼盼，李敬

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）屬慢性終身性疾病，是一種高發(fā)病率、嚴(yán)重影響人們正常生活工作的慢性病[1]。近些年，全球糖尿病患病人數(shù)一直在大幅度增加，其中2 型糖尿病（Diabetic Mellitus Type 2，T2DM）患者約占糖尿病患者總數(shù)的90%，已經(jīng)成為威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。德谷胰島素（Insulin Degludec，IDeg）為超長效基礎(chǔ)胰島素類似物[2]，注射后形成多六聚體，從可溶性儲存庫中緩慢釋放，能夠持久、平穩(wěn)、長期降血糖，減輕病人的生理痛苦，增強病人順應(yīng)性[3-7]，廣泛用于2 型糖尿病的治療[8]。

德谷胰島素含量檢測方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC），其中紫外分光光度法采用紫外分光光度計進行直接測定，HPLC 通過色譜柱分離作用將有關(guān)物質(zhì)、雜質(zhì)等進行分離，故結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠[9]。江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司現(xiàn)采用HPLC 控制產(chǎn)品中德谷胰島素含量，德谷胰島素主峰出峰時間約為22 min,高效液相色譜法分析時間長、系統(tǒng)死體積較大，檢測成本高。與傳統(tǒng)的HPLC 相比，超高效液相色譜（UPLC）填料顆粒小、均勻，具有柱效高、分析速度快、分離度高、靈敏度好等特點[10-11]，因此被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物研究分析等領(lǐng)域[12]。因此，本研究采用UPLC 法測定德谷胰島素的含量，為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A 超高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；XS105 分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；ToledoXSR105 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，默克股份兩合有限公司；德谷胰島素，江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件及參數(shù)

色譜柱：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液（稱取無水硫酸鈉14.2 g，磷酸二氫鈉15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混勻）-乙腈（體積比90 ∶10），流動相B 為50%乙腈；梯度洗脫程序：0 ～20 min，50%B；20 ～21 min，50%B ～80%B；21 ～24 min，80%B；24 ～25 min，80%B ～50%B；25 ～30 min，50%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL/min；波長：214 nm，進樣量：2 μL。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 空白溶液

0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液：稱取1.56 g 二水合磷酸二氫鈉，加1 000 mL 水溶解混勻后，1 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.5，混勻，經(jīng)微孔濾膜（水系0.45μm）過濾后作為空白溶液。

1.2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液

取德谷胰島素適量，60 ℃烘箱放置2 ～5 d，使與主峰保留時間約為1.16 min 的雜質(zhì)分離度大于2.0。稱取以上樣品，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.2.3 對照品溶液

取德谷胰島素對照品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL的對照品溶液。

1.2.2.4 供試品溶液

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取德谷胰島素對照品約50 mg，置25 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成2 mg/mL 的對照品濃溶液，分別取對照品溶液適量，配制成約0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、1.0 mg/mL 與1.2 mg/mL 的對照品溶液。

（2）重復(fù)性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液，平行6 份。

（3）中間精密度溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。兩名分析人員分別處理6 份，并于不同日期使用不同儀器進行驗證測量。

（4）準(zhǔn)確度溶液：取德谷胰島素對照品約8 mg、10 mg、12 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成含德谷胰島素約80%、100%、120%的供試品溶液，每個濃度分別平行3 份。

（5）穩(wěn)定性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。在樣品配制完成后約0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 與36 h 進樣測定，記錄色譜圖。

（6）耐用性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。分別對柱溫（±2 ℃），流速（±0.01 mL/min）與波長（±2 nm）進行微小的變動，每次變動一個因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化過程

2.1.1 流動相的選擇

流動相①：A 為0.1 mol/L 磷酸鹽溶液（稱取磷酸二氫銨11.5 g，加水800 mL 溶解，加乙腈100 mL，混勻，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.7，加水定容至1 000 mL），流動相B 為80%乙腈。流動相②：A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液（稱取無水硫酸鈉14.2 g，磷酸二氫鈉15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混勻）-乙腈（體積比90 ∶10），流動相B為50%乙腈。樣品色譜檢測結(jié)果如圖1 所示，流動相②峰型對稱、響應(yīng)高、出峰時間早，適合作為流動相使用。

圖1 不同流動相檢測結(jié)果

2.1.2 色譜柱的選擇

色譜柱①：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；色譜柱②：Shim-pack GISS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）。樣品檢測結(jié)果如圖2 所示，色譜柱①主峰拖尾因子為0.98，且主峰與主峰后雜質(zhì)分離效果較好；色譜柱②主峰拖尾因子為1.23，主峰與主峰后雜質(zhì)不能有效分離，故選擇色譜柱①進行樣品檢測。

圖2 不同色譜柱檢測結(jié)果

2.2 專屬性試驗

將空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液依次進樣，記錄色譜圖，如圖3 所示。色譜結(jié)果顯示，空白溶液不干擾目標(biāo)色譜峰檢測，專屬性良好。

圖3 專屬性色譜圖

2.3 進樣精密度試驗

對照品溶液依次進樣6 次，記錄色譜圖。峰面積的RSD為0.08%，表明儀器的精密度良好。

2.4 線性與范圍

不同濃度下，德谷胰島素檢測峰面積見表1。以峰面積（y）對濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，得線性方程為y=147.37x-0.018 7，R2=0.999 9。結(jié)果顯示，在線性范圍內(nèi)，德谷胰島素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性

重復(fù)性溶液的RSD為0.05%，見表2，表明該分析方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 中間精密度

中間精密度溶液的RSD為0.34%，見表3，表明該分析方法中間精密度良好。

表3 中間精密度試驗結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度

回收率測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法下德谷胰島素的回收率在99.17%～101.27%，RSD＜5%，方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性

計算對照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD與供試品溶液含量的RSD，見表5。對照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD為0.28%；供試品溶液含量的RSD為0.21%。結(jié)果表明，對照品與供試品溶液至少36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 耐用性

將柱溫（±2 ℃）、流速（±0.01 mL/min）與波長（±2 nm）進行微小的變動，考察方法耐用性，見表6。結(jié)果表明，色譜條件進行微小變動時RSD均小于0.5%，方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗結(jié)果

2.10 實際樣品測定

分別稱取三批德谷胰島素產(chǎn)品（批號F01、F02、F03）約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL 的供試品溶液，按照1.2.1 項下色譜條件測定，結(jié)果見表7。

表7 實際樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了檢測德谷胰島素含量的UPLC 方法。該方法下，德谷胰島素出峰時間約為11 min，與普通高效液相色譜需要的22 min 相比，檢測時間縮短了50%，能快速檢測出德谷胰島素含量。該方法專屬性強，線性范圍廣，回收率高，重復(fù)性、穩(wěn)定性及耐用性良好，可用于提升德谷胰島素含量標(biāo)準(zhǔn)。