王延茹，段金菊

（1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室，山西汾陽 032200；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 藥學(xué)部，山西太原 030001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）廣泛存在于自然界，是臨床分離率高且耐藥性強(qiáng)的條件致病菌[1-3]。綠膿菌素是PA 分泌的一種藍(lán)綠色吩嗪類次級代謝產(chǎn)物，不僅能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉(zhuǎn)運(yùn)、打斷細(xì)胞呼吸鏈、過量產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞死亡，還參與細(xì)菌外排泵的激活[4-5]，因此，綠膿菌素在PA 定植、感染以及耐藥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。綠膿菌素受多種調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)[6]，研究較為成熟的是群體感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）系統(tǒng)，該系統(tǒng)參與綠膿菌素在內(nèi)的多種毒力因子的調(diào)控[7-10]。喹諾酮信號分子（Pseudomonas Quinolone Signal，PQS）是QS 系統(tǒng)中至關(guān)重要的信號分子[11-12]，由于在慢性感染人群（如囊性纖維化患者）的臨床標(biāo)本中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)lasR缺陷突變菌[2,13]，該菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少量的內(nèi)源性PQS[2,7]，卻能增強(qiáng)綠膿菌素的表達(dá)[13]。本研究選取臨床分離lasR 缺陷菌株與正常菌株為研究對象，對比探究PQS 不同誘導(dǎo)方案對兩種菌株綠膿菌素活性的影響，旨在進(jìn)一步了解PQS對銅綠假單胞菌致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2021 年3 月至2022 年10 月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院經(jīng)全自動鑒定儀VITEK-2 鑒定的銅綠假單胞菌作為研究對象。正常組納入標(biāo)準(zhǔn)：由臨床血培養(yǎng)及胸水腹水等無菌體液分離得到；非重復(fù)菌株；QS基因正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)PCR 擴(kuò)增及DNA 測序檢測QS 基因lasR、rhlR、lasI、rhlI以及pqsR單一或多種基因缺失[14]。只有l(wèi)asR基因缺失菌株為缺陷組。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 15692（PAO1），為南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實(shí)驗(yàn)室惠贈。收集到的正常菌株和lasR缺陷菌株作為本研究的原始菌株。

1.1.2 試劑與儀器

PQS，HPLC 級，批號BCBR3314V，美國Sigma-Aldrich 公司；0.9%氯化鈉注射液，醫(yī)用級，石家莊四藥有限公司；氯仿，分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司；鹽酸，分析純，深圳市精成科技有限公司；血培養(yǎng)皿，濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司；綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，批號210322，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；一次性使用培養(yǎng)皿，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；LB 液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

SpectraMax 190 全波長酶標(biāo)儀，上海美谷分子儀器有限公司；BY-R20 型低溫高速離心機(jī)，北京白洋醫(yī)療器械有限公司；GNP-9270BS-Ⅲ隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LMQ.C 型立式高壓滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；21255 麥?zhǔn)媳葷醿x，生物梅里埃公司；Costar-3599 型96 孔板，美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 PQS 誘導(dǎo)方案

（1）復(fù)蘇菌株：將保存于-70 ℃的原始菌株接種于血培養(yǎng)皿，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)；（2）配制含PQS培養(yǎng)基：分別配制10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的含PQS 固體培養(yǎng)基；（3）傳代培養(yǎng)：將純化的銅綠假單胞菌用無菌0.9%NaCl 調(diào)成3.0 麥?zhǔn)蠁挝?，取菌?0 μL 接種于上述含藥培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)24 h后作為誘導(dǎo)一天的菌株；將誘導(dǎo)一天菌株用無菌0.9%NaCl 調(diào)成3.0 麥?zhǔn)蠁挝?，取菌?0 μL 接種于上述含PQS 新培養(yǎng)基中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h 作為誘導(dǎo)第二天的菌株；以此類推，分別誘導(dǎo)至第五天，將完成誘導(dǎo)的菌株分別在-70 ℃保存于液體培養(yǎng)基中。

1.2.2 綠膿菌素活性的測定

（1）綠膿菌素測定用培養(yǎng)基的配制：按每100 mL蒸餾水中含4.64 g 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、1 g 甘油的比例進(jìn)行配制，充分搖勻，以121 ℃高壓滅菌20 min，室溫冷卻至50 ～60 ℃，傾倒于一次性培養(yǎng)皿中（大約20 mL），靜置至完全凝固，于4 ℃冰箱保存，備用（七天內(nèi)用完）[15]。

（2）OD600的測定：復(fù)蘇菌株后，挑取單個菌落于經(jīng)高壓滅菌的LB 培養(yǎng)液中，使用比濁儀調(diào)節(jié)菌懸液的麥?zhǔn)蠁挝粸?.5，吸取200 μL 于96 孔板中，用酶標(biāo)儀測OD600（LB 培養(yǎng)液做空白對照）。

（3）菌懸液的培養(yǎng)：取上述2 mL LB 菌懸液于24 孔板中，置于振蕩器上振蕩培養(yǎng)24 h（130 r/min，37 ℃）。

（4）OD520的測定：將24 孔板中的菌懸液吸取到滅菌EP 管中，經(jīng)高速離心機(jī)12 000 r/min 離心5 min，取上清于滅菌試管中，加入3 mL 氯仿，吸打混勻，輕輕搖動萃取20 min；將下層溶液移入干凈的試管，加入1 mL 0.2 mol/L 的鹽酸，吸打混勻，輕輕搖動萃取20 min；取上層鹽酸溶液于96 孔板，酶標(biāo)儀測OD520（空白對照為LB 培養(yǎng)液經(jīng)雙相萃取后的鹽酸溶液）。

（5）活性計(jì)算。綠膿菌素活性=OD520/OD600。

1.3 觀察指標(biāo)與評價標(biāo)準(zhǔn)

觀察正常組和缺陷組經(jīng)不同濃度PQS（10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）和不同時間（1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d）誘導(dǎo)綠膿菌素活性的變化，以未進(jìn)行PQS誘導(dǎo)的原始菌株的OD520/OD600值作為基值，高于或低于原始菌株的基值被認(rèn)為促進(jìn)或抑制綠膿菌素的活性。誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的大小與質(zhì)控菌株進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；原始菌株經(jīng)不同濃度PQS 和不同時間誘導(dǎo)對綠膿菌素活性的影響采用重復(fù)測量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的收集

從臨床分離得到符合條件的原始菌株共10 株，正常組和缺陷組各5 株，分別經(jīng)不同濃度PQS 和不同時間誘導(dǎo)最終共保存160 株銅綠假單胞菌。

2.2 PQS 誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

PQS 誘導(dǎo)前正常組與缺陷組綠膿菌素活性比較的結(jié)果見表1，P=0.008，表明誘導(dǎo)前兩組的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性低于正常組，缺陷組的綠膿菌素活性低于PAO1。

表1 誘導(dǎo)前兩組綠膿菌素活性的比較

2.3 PA 經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案后正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

不同誘導(dǎo)方案下，正常組和缺陷組綠膿菌素活性結(jié)果如表2 所示，相關(guān)分析見2.3.1 和2.3.2。

表2 正常組和缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較

2.3.1 正常組與缺陷組組內(nèi)比較

正常組與缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較見表3。結(jié)果表明，不考慮誘導(dǎo)濃度間的差異（即不同誘導(dǎo)時間下的活性均值），正常組在不同時間的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺陷組活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不考慮誘導(dǎo)時間之間的差異（即不同誘導(dǎo)濃度下的活性均值），正常組在不同誘導(dǎo)濃度下的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺陷組活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 正常組和缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較

具體地，正常組隨誘導(dǎo)時間的延長綠膿菌素的活性不同程度地增加（除了誘導(dǎo)3 d 時活性較1 d 和2 d稍有降低），其中10 μmol/L 和80 μmol/L 的誘導(dǎo)濃度下差異顯著（P＜0.05），40 μmol/L 時差異不顯著（P＞0.05）；缺陷組在同一誘導(dǎo)濃度下隨誘導(dǎo)時間的延長綠膿菌素的活性變化不明顯（P＞0.05）。除了正常組在誘導(dǎo)3 d 時隨誘導(dǎo)濃度的增加綠膿菌素的活性變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），兩組在同一誘導(dǎo)時間下隨誘導(dǎo)濃度的增加綠膿菌素的活性變化均不明顯（P＞0.05）。正常組和缺陷組的誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)濃度之間均無交互作用（正常組F=0.612，P=0.643；缺陷組F=0.919，P=0.446），表明兩組分別在不同PQS 誘導(dǎo)濃度下，綠膿菌素活性隨誘導(dǎo)時間的延長變化的趨勢相近。

2.3.2 正常組與缺陷組組間比較

正常組與缺陷組經(jīng)不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組間比較見表4，兩組菌株在誘導(dǎo)1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 時綠膿菌素活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性均顯著低于正常組。兩組菌株在誘導(dǎo)濃度10 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 時，綠膿菌素活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性均低于正常組。

表4 正常組與缺陷組經(jīng)不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組間比較

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染與其自身產(chǎn)生的毒力因子密切相關(guān)，毒力因子活性越強(qiáng)，引起的感染癥狀越嚴(yán)重。PA 的毒力因子主要受三個QS 系統(tǒng)，即以高絲氨酸內(nèi)酯為信號分子的Las 系統(tǒng)、Rhl 系統(tǒng)和以喹諾酮類為信號分子的PQS 系統(tǒng)的調(diào)控。三個系統(tǒng)相互制約，構(gòu)成一個錯綜復(fù)雜而又井然有序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Las 系統(tǒng)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，由轉(zhuǎn)錄激活因子lasR 和信號合成酶lasI 組成，正向調(diào)控Rhl 和PQS系統(tǒng)；PQS 系統(tǒng)位于中間層級，起連接作用，可正調(diào)節(jié)rhlI、lasI基因的表達(dá)，又受Rhl 系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)[7-9,16]。綠膿菌素的生成主要受Rhl 和PQS 系統(tǒng)的調(diào)控，PQS可直接上調(diào)phzA-G 操縱子的表達(dá)，促進(jìn)吩嗪類的合成[17-18]，如DIGGLE 等[19]發(fā)現(xiàn)外源性PQS 能促進(jìn)綠膿菌素的提前表達(dá)。本課題組前期研究[12]已表明，與誘導(dǎo)前相比，外源性PQS 不同誘導(dǎo)方案對銅綠假單胞菌綠膿菌素的活性有促進(jìn)作用，但是只研究了基因正常的銅綠假單胞菌，可能忽略了內(nèi)源性PQS 對綠膿菌素活性的影響。

研究表明，囊性纖維化患者臨床標(biāo)本中經(jīng)常出現(xiàn)的lasR缺陷突變株不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少量的內(nèi)源性PQS，部分突變株能生成綠膿菌素，甚至有研究顯示Las 系統(tǒng)對綠膿菌素的生成呈負(fù)向調(diào)控，PAO1 的lasR缺陷突變株比野生型菌株生成綠膿菌素的能力增強(qiáng)[2,10,13]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前l(fā)asR缺陷菌株的綠膿菌素活性低于正常菌株和PAO1，可能與菌株的來源有關(guān)，菌株所處的環(huán)境不同，相應(yīng)的適應(yīng)性改變也有所差異。缺陷菌株因無法激活Las 系統(tǒng)，影響中下游PQS 和Rhl 系統(tǒng)的功能，不利于綠膿菌素的生成。

本研究中兩組菌株經(jīng)不同PQS 誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性變化有差異，其中正常組菌株在不同誘導(dǎo)方案下綠膿菌素活性呈不同程度地促進(jìn)，缺陷組菌株在不同誘導(dǎo)方案下綠膿菌素活性變化不明顯，缺陷組菌株綠膿菌素活性始終低于正常組。一方面說明lasR 可能在綠膿菌素的生成過程中發(fā)揮重要的作用，推測綠膿菌素的表達(dá)可能也受Las 系統(tǒng)調(diào)控；另一方面表明，PQS 信號分子雖然可促進(jìn)綠膿菌素表達(dá)，但可能不是主要影響因素。對于這些推測尚需進(jìn)行基因和蛋白水平的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。