征 征,郁 悅,劉庭秀,楊靚靚,王裕星,劉新敏(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院婦科,北京 100053; 2.中國中醫(yī)科學院研究生院,北京 100091; 3.北京中醫(yī)藥大學研究生院,北京 100029; .大連醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)科,遼寧 大連 116023)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)為常見的女性生殖內(nèi)分泌疾病,發(fā)病率高達15%～20%[1],且呈逐年升高趨勢[2]。目前,PCOS發(fā)病機制不明,可能涉及遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應激及慢性炎癥等[3-4]。PCOS患者發(fā)病以高雄激素血癥、卵巢多囊樣變和排卵障礙為特征,主要表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕、多毛、痤瘡、肥胖及胰島素抵抗(IR)等,長期患病可引發(fā)2型糖尿病、心血管疾病和子宮內(nèi)膜癌等不良結(jié)局。西醫(yī)治療主要以口服藥物為主,但其不良反應較多,且停藥后易反復。近年來,中醫(yī)藥治療PCOS受到廣泛認可,2018年《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[5]認為中醫(yī)藥為該病的有效治療手段。PCOS患者多伴有黃體生成素(LH)水平升高,中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院劉新敏教授根據(jù)多年臨證經(jīng)驗,認為PCOS高LH血癥多與肝陽上亢有關(guān)。PCOS患者常情志不暢,急躁易怒,易引發(fā)肝火,上擾清陽,常眼干眼脹、失眠多夢;內(nèi)耗陰血,則見月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)。故予以鎮(zhèn)肝熄風湯加減治療。其中“白芍-牡蠣”藥對是處方的核心部分,白芍酸甘,可滋陰柔肝,平抑肝陽;牡蠣咸澀,可收斂固澀,重鎮(zhèn)潛陽,兩藥一酸一澀,一柔一斂,可有效降低PCOS患者的LH水平,有助自主月經(jīng)產(chǎn)生?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),白芍有一定的抗炎、降糖作用[6];牡蠣具有抗氧化、降糖、免疫調(diào)節(jié)作用[7],對PCOS慢性炎癥、氧化應激狀態(tài)及IR均可起到改善作用。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接,從基因、蛋白、通路等多角度探討“白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的機制,為后續(xù)相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 “白芍-牡蠣”的活性成分及靶點提取

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、HERB(http://herb.ac.cn)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫獲取白芍、牡蠣的主要活性成分及其作用靶點,選取口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18,或BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中參數(shù)得分≥20,P<0.05,或經(jīng)文獻檢索[8-9]證實為核心成分的化合物作為藥物活性成分予以初步納入,通過TCMSP、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、BATMAN-TCM、中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)及PubMed(http://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫對上述化合物的作用靶點進行查詢,去除無對應人類相關(guān)靶點的化合物,作為“白芍-牡蠣”藥對最終的活性成分,并在Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)將靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因ID,對其靶點進行進一步提取與歸類。

1.2 PCOS疾病靶點預測及其與“白芍-牡蠣”的交互靶點采集

以“Polycystic ovarian syndrome”“PCOS”為關(guān)鍵詞,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)收集PCOS疾病靶點,獲取“白芍-牡蠣”藥對與PCOS的交互靶點,得到“白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的預測靶點,并作韋恩圖進行可視化分析。

1.3 “白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

通過Excel軟件整理藥物-成分-靶點之間的聯(lián)系,將其導入Cytoscape軟件,建立藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡,并選取其中度值排序居前3位的化合物作為“白芍-牡蠣”藥對的核心活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建

通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡,去除游離節(jié)點,并采用Cytoscape軟件進行可視化分析,選取度值>2倍中位數(shù)的節(jié)點作為核心靶點。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因百科全書(KEGG)通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO及KEGG分析,得到富集的GO條目及KEGG通路后,選取P<0.05,Count值排序居前10位(含并列第10位)的GO條目/通路,使用微生信作圖網(wǎng)站分別作Bar圖及氣泡圖,進行進一步可視化分析。

1.6 分子對接驗證

選取“白芍-牡蠣”藥對中的核心活性成分以及PPI網(wǎng)絡中得到的核心靶點進行分子對接驗證。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchemncbi.nlmnih.gov/)獲取核心活性成分的結(jié)構(gòu),通過PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu),通過PlayMolecule網(wǎng)站(playmolecule.com)預測分子的活性口袋,最后使用AutoDock軟件進行分子對接,獲取各個對接方式所需的最低結(jié)合能,并使用微生信網(wǎng)站作出對應的Heatmap以進一步可視化分析。選取最低結(jié)合能排序居前5位的藥靶對接方式,通過PyMol軟件進行分析,選取其中能夠以較穩(wěn)定氫鍵結(jié)合的對接方式作圖,展示其氫鍵數(shù)目、距離及分子間相連接的氨基酸殘基名稱等對接細節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 “白芍-牡蠣”的活性成分及靶點提取

最終篩選得到15個化合物,其中9個來源于白芍,6個來源于牡蠣,見表1。在Uniprot網(wǎng)站將靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因ID。去除重復靶點后,最終得到117個靶點,其中89個來源于白芍,30個來源于牡蠣(兩藥有2個共同靶點)。

表1 “白芍-牡蠣”的活性成分Tab 1 Active components of “radix paeoniae alba-concha oyster”

2.2 PCOS疾病靶點預測及其與“白芍-牡蠣”的交互靶點采集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲取到3 142個PCOS疾病作用靶點,將其與“白芍-牡蠣”藥對的作用靶點取交集,發(fā)現(xiàn)PCOS與“白芍-牡蠣”藥對共有71個共同靶點。

2.3 “白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

將“白芍-牡蠣”藥對的主要成分及其與PCOS的交互靶點導入Cytoscape軟件,得到由84個節(jié)點及102條邊構(gòu)成的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡,見圖1。圖1中,橙色為藥物,黃色為成分,成分圖形面積與對應的靶點數(shù)目成正比,藍色為靶點。其中,BS4(山柰酚,度值為38)、BS3(β-谷甾醇,度值為22)、BS1[(+)-兒茶素,度值為7]為度值排序居前3位的化合物,即為“白芍-牡蠣”藥對中的核心活性成分。

圖1 “白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡Fig 1 “Drug-ingredient-target” network of “radix paeoniae alba-concha oyster” in the treatment of PCOS

2.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中得到由70個節(jié)點及463條邊構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡,導入Cytoscape軟件進一步可視化分析,見圖2。圖2中,紅色部分為核心靶點。分析得出PPI網(wǎng)絡的度值中位數(shù)為11,選取度值>2倍中位數(shù)的節(jié)點作為核心靶點,共選取到11個核心靶點,見表2。

圖2 PPI網(wǎng)絡圖Fig 2 PPI network

表2 核心靶點列表Tab 2 List of core targets

2.5 GO功能富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對相關(guān)靶點進行GO分析,共富集到514條GO條目。將P<0.05的GO條目進行進一步篩選,最終得到264條,包含生物過程(BP)相關(guān)GO條目191條,細胞組分(CC)相關(guān)GO條目30條,分子功能(MF)相關(guān)GO條目43條。選取排序居前10位(包含并列第10位)的條目,使用微生物作圖網(wǎng)站(www.bioinformatics.com.cn)對其進行可視化分析,Bar圖見圖3。BP主要集中在信號轉(zhuǎn)導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控、細胞增殖負調(diào)控、蛋白磷酸化、凋亡過程的調(diào)控及負調(diào)控、細胞黏附、正向調(diào)節(jié)細胞遷移、離子跨膜運輸、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、血管生成的正向調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)等方面;CC主要集中在膜整體組分、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞質(zhì)、外泌體、高爾基體、線粒體、細胞質(zhì)核周區(qū)、細胞內(nèi)面細胞器、核染色質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等方面;MF主要集中在轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合、氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、Scaffold蛋白結(jié)合、單氧酶活性、β-淀粉樣蛋白結(jié)合、蛋白酶結(jié)合和肽酶活性等方面。

圖3 GO功能富集分析Fig 3 GO functional enrichment analysis

2.6 KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對相關(guān)靶點進行KEGG分析,共富集到126條通路。將P<0.05的通路進行進一步篩選,最終得到53條通路。選取排序居前10位(包含并列第10位)的通路,進行可視化分析,氣泡圖見圖4。作用通路主要集中在磷脂酰肌醇3激酶-Akt(PI3K-Akt)通路、神經(jīng)活性配體-受體交互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路和NOD樣受體信號通路等方面。

圖4 KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG functional enrichment analysis

2.7 分子對接驗證

選取“白芍-牡蠣”藥對中的核心活性成分山柰酚、β-谷甾醇、(+)-兒茶素與PPI網(wǎng)絡中得到的11個核心靶點,進行分子對接,分子對接熱圖見圖5,可見其結(jié)合能主要集中于-35～-10 kJ/mol,分子間結(jié)合較好。選取最低結(jié)合能排序居前5位的藥靶對接方式,通過PyMol軟件進行分析,選取其中能夠以較穩(wěn)定氫鍵結(jié)合的對接方式,分別為β-谷甾醇-TNF、β-谷甾醇-CAT,將其對接細節(jié)進行展示,見圖6—7。β-谷甾醇可與TNF中的TYR-151氨基酸殘基形成1個距離為2.4?的氫鍵,與CAT中的ARG-66氨基酸殘基形成3個距離分別為2.3 ?、2.3 ?和2.6 ?的氫鍵。

圖5 分子對接熱圖Fig 5 Molecular docking heat map

圖6 β-谷甾醇-TNF分子對接細節(jié)Fig 6 Detail of Beta-sitosterol-TNF molecular docking

圖7 β-谷甾醇-CAT分子對接細節(jié)Fig 7 Detail of Beta-sitosterol-CAT molecular docking

3 討論

“白芍-牡蠣”藥對取自近代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》中的鎮(zhèn)肝熄風湯,劉新敏教授認為PCOS伴見高LH血癥的患者多為肝腎陰虛,肝陽上亢,屬上盛下虛態(tài),使用白芍可補肝陰、柔肝體;牡蠣可斂肝陽、平肝風,兩藥相合,使上亢之陽得以沉降,下竭之陰得以斂潤,陰平陽秘,機體調(diào)和。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法,發(fā)現(xiàn)山柰酚、β-谷甾醇和(+)-兒茶素為“白芍-牡蠣”藥對的核心活性成分。文獻報道,慢性低度炎癥狀態(tài)、氧化應激在PCOS的發(fā)病過程中具有重要作用[3-4]。研究結(jié)果表明,山柰酚具有抗氧化、抗炎、防治糖尿病以及抑制蛋白激酶等多方面的作用,可顯著抑制脂質(zhì)微粒系統(tǒng)中的還原型輔酶Ⅱ或Fe2+誘導的脂質(zhì)過氧化,清除超氧化物陰離子,從而產(chǎn)生抗氧化應激作用[10];其抗炎的作用機制主要包括調(diào)控炎癥相關(guān)基因表達,抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子相關(guān)表達以及細胞中PI3K和Akt的磷酸化[11],可改善PCOS患者的慢性炎癥狀態(tài);降糖方面,山柰酚可提高脂肪細胞攝取葡萄糖的能力,有效降低小鼠空腹血糖和IR,改善糖脂代謝紊亂,從而提高機體胰島素敏感度,對PCOS所致IR可起到治療作用[12]。β-谷甾醇具有明顯的抗氧化活性,抗炎、降糖和降脂作用。研究結(jié)果顯示,β-谷甾醇可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性,降低過氧化氫酶活性,清除羥自由基及超氧陰離子,從而抑制氧化應激反應的發(fā)生[13];研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可通過減少機體的NO合成而減少IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌,從而達到抗炎效果[14];β-谷甾醇可通過下調(diào)PI3K、Akt的表達,對葡萄糖的吸收、脂肪的合成與分解發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,故不僅可治療PCOS導致的IR,還可用于控制肥胖型PCOS患者的體重[15]。兒茶素具有很強的清除自由基和抗氧化的作用,相較于(-)-兒茶素,(+)-兒茶素更能有效阻止雜環(huán)胺所致DNA氧化損傷[16];兒茶素還能改善胰島素敏感性,從而治療IR,并可加快脂代謝,促進脂肪分解,這對于PCOS患者的IR、肥胖均可起到改善作用[17]。

本研究在PPI網(wǎng)絡構(gòu)建中,篩選出IL-6、TNF、Akt1、PTGS2、PPARG、CASP3、CAT、ESR1、NOS3、HMOX1和MAPK8為“白芍-牡蠣”藥對治療PCOS的核心靶點。IL-6、TNF作為炎癥相關(guān)因子,在PCOS的發(fā)生發(fā)展中,起到了較為關(guān)鍵的作用。IL-6在PCOS患者體內(nèi)表達水平升高,與高雄激素血癥、肥胖和IR等表現(xiàn)關(guān)系密切[18]。IL-6可調(diào)節(jié)胰島素受體底物-1(IRS1)以及激活Akt,從而抑制胰島素信號通路,最終導致IR[19]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-6可通過Akt-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路使脂肪細胞增殖,從而導致PCOS患者超重、肥胖。IL-6也是PCOS患者遠期產(chǎn)生心血管疾病的危險因素之一[20]。研究結(jié)果表明,TNF是PCOS治療中的潛在關(guān)鍵靶點之一,不僅參與了系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生、發(fā)展,還在黃體細胞和顆粒細胞的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用,TNF的過高表達也是PCOS的特征性表現(xiàn)[21]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PCOS大鼠血清TNF-α與睪酮水平呈正相關(guān),且TNF可激活PI3K-Akt-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路下調(diào)胰島素信號通路,促使PI3K、Akt等磷酸化IRS1,從而抑制機體對葡萄糖的攝取,并導致機體對胰島素敏感度下降,導致IR的發(fā)生[22]。本研究的分子對接驗證中,β-谷甾醇與TNF對接較好,或可說明“白芍-牡蠣”藥對通過影響以上通路發(fā)揮作用。

本研究的GO功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),“白芍-牡蠣”藥對主要通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導、蛋白磷酸化、凋亡過程的調(diào)控及負調(diào)控、細胞黏附、離子跨膜運輸、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合和氧化還原酶活性等方面治療PCOS。KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt等通路為“白芍-牡蠣”藥對作用的關(guān)鍵通路。研究結(jié)果顯示,PI3K-Akt信號傳導可影響PCOS患者的卵泡發(fā)育及顆粒細胞功能,并且是PCOS患者產(chǎn)生糖耐量異常的主要機制,與PCOS所致IR關(guān)系密切[23]。作為胰島素信號傳導的主要途徑,課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),中藥可通過PI3K-Akt通路改善PCOS相關(guān)癥狀,提高患者胰島素敏感性,從而治療PCOS所致IR[24]。研究結(jié)果表明,PCOS導致的IR可使胰島素代償性升高,而升高的胰島素又可使PCOS患者促性腺激素釋放激素和LH的分泌量及分泌頻次顯著升高,并可促進LH的活性。因此,通過治療PCOS所致IR,提高胰島素敏感性,可起到降低LH水平的作用[25]。

綜上所述,“白芍-牡蠣”藥對主要通過山柰酚、β-谷甾醇和(+)-兒茶素等核心成分,作用于IL-6、TNF和Akt1等靶點及PI3K/Akt等通路,起到抗炎、抗氧化應激、增強胰島素敏感性、降低LH水平等效果,從而治療PCOS。本研究為臨床使用“白芍-牡蠣”藥對治療PCOS提供了基礎(chǔ)依據(jù),未來仍需進一步的細胞實驗、動物研究以明晰結(jié)論,指導臨床。