金政森,翟弋焱,郭思宇,高藝菲,陶曉宇,張景媛,張繁芹,陸 珊,趙若琪,吳嘉瑞(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100029)

便秘是指在多種致病因素的作用下,結(jié)直腸、肛門結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的一種疾病,癥狀表現(xiàn)為排糞次數(shù)減少、排糞量少、糞便干硬,且有排糞不盡感[1]。我國成年人慢性便秘患病率為10.9%[2],且人群便秘患病率逐年升高[3]。短期內(nèi),促胃腸動(dòng)力藥物等西醫(yī)療法能起到一定效果,但不良反應(yīng)較多,停藥后便秘易復(fù)發(fā),而中醫(yī)治療便秘在安全性及長期治療方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[4]。中醫(yī)治療便秘有較為悠久的歷史,便秘最早記載于清代沈金鰲所著的《雜病源流犀燭》[5],認(rèn)為便秘主要是由飲食所傷、外感邪氣、情志不暢等原因引起,病位在大腸。芪黃通秘軟膠囊方中以黃芪、當(dāng)歸為君藥,補(bǔ)脾肺之氣,滋陰養(yǎng)血,潤腸通便;以大黃、肉蓯蓉、何首烏、黑芝麻、核桃仁、桃仁和決明子為臣藥,瀉熱通腸,滋陰潤燥;以枳實(shí)、苦杏仁為佐藥,消積導(dǎo)滯,下氣通便;大黃兼作使藥,取其瀉熱通腸、涼血解毒、推陳致新之功,適用于便秘辨證屬虛秘者,有補(bǔ)氣、潤腸、促排便的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是人工智能和大數(shù)據(jù)時(shí)代的新興學(xué)科,強(qiáng)調(diào)從生物網(wǎng)絡(luò)的宏觀角度出發(fā),探究藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),闡釋整體作用機(jī)制,交叉性、前沿性強(qiáng)[6];該研究方法通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),能在一定程度上解釋藥物各成分與相關(guān)靶點(diǎn)的復(fù)雜作用關(guān)系,特別適用于解釋中醫(yī)藥治療疾病“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的復(fù)雜作用機(jī)制[4,7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),探討芪黃通秘軟膠囊治療便秘的科學(xué)內(nèi)涵,為深入開展芪黃通秘軟膠囊臨床相關(guān)研究及應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 資料與方法

1.1 芪黃通秘軟膠囊化學(xué)成分的檢索

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)應(yīng)用系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù),給出了《中華人民共和國藥典》(2010年版)收錄的大部分中草藥的分子結(jié)構(gòu)、ADME參數(shù)及作用靶點(diǎn)等重要信息[8]。本研究依托TCMSP、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/)檢索黃芪、何首烏、當(dāng)歸、肉蓯蓉、黑芝麻、核桃仁、大黃、決明子、枳實(shí)、苦杏仁和桃仁等11味中藥的化學(xué)成分。

1.2 化學(xué)成分的篩選及其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選并預(yù)測(cè)其靶點(diǎn);部分化學(xué)成分來自TCM Database@Taiwan,將其2D結(jié)構(gòu)上傳至SwissTargetPrediction網(wǎng)站(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行篩選,將篩選所得化學(xué)成分上傳至PharmMapper網(wǎng)站(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)。

1.3 便秘相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

便秘相關(guān)靶點(diǎn)來自DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以關(guān)鍵詞“constipation”檢索上述2個(gè)數(shù)據(jù)庫中全部靶點(diǎn),合并后為便秘相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物信息與疾病信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件(https://cytoscape.org/),構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將所得化學(xué)成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),選擇打分值≥0.9的高置信區(qū)間進(jìn)行PPI分析,隱藏游離節(jié)點(diǎn)。

1.6 核心靶點(diǎn)的篩選

將所得PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,利用CytoHubba分析靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),以度值、介數(shù)中心性、緊密中心度為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點(diǎn)。

1.7 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)篩選出來的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析,并通過R軟件進(jìn)行結(jié)果可視化。

1.8 分子對(duì)接

根據(jù)Cytoscape網(wǎng)絡(luò)找出與核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分,小分子受體的SDF文件來自PubChem數(shù)據(jù)庫,利用Chem3D軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化成PDB文件,配體PDB文件來自PDB數(shù)據(jù)庫,將PDB結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7軟件。對(duì)于配體分子,設(shè)置可旋轉(zhuǎn)的鍵及活動(dòng)鍵時(shí)需要移動(dòng)的最少的原子數(shù)目;對(duì)于受體分子,增加經(jīng)驗(yàn)電荷,加H,合并非共享電子對(duì),合并非極性H,并導(dǎo)出受體、配體PDBQT格式文件,計(jì)算其結(jié)合能。利用PyMol軟件進(jìn)行結(jié)果可視化。一般來說,結(jié)合能<-20.92 kJ/mol,說明受體與配體具有較好結(jié)合活性,對(duì)接效果好,結(jié)合能<-29.29 kJ/mol,表明兩者之間有強(qiáng)烈的對(duì)接活性[9]。

2 結(jié)果

2.1 芪黃通秘軟膠囊化學(xué)成分的篩選及靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出117個(gè)活性成分,15個(gè)來自大黃,4個(gè)來自核桃仁,7個(gè)來自黑芝麻,20個(gè)來自黃芪,14個(gè)來自決明子,19個(gè)來自苦杏仁,6個(gè)來自肉蓯蓉,23個(gè)來自桃仁,22個(gè)來自枳實(shí),其中有12個(gè)共有化學(xué)成分;通過Swiss Target Prediction網(wǎng)站篩選,共得到7個(gè)何首烏化學(xué)成分。經(jīng)預(yù)測(cè),共得到102個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的359個(gè)化合物靶點(diǎn),并將其轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名,有15個(gè)成分未預(yù)測(cè)到其靶點(diǎn)。疾病靶點(diǎn)共112個(gè)。

2.2 芪黃通秘軟膠囊成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

芪黃通秘軟膠囊“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖1。圖1中,橙色菱形節(jié)點(diǎn)代表化合物分子,青色矩形節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn),度值越大,節(jié)點(diǎn)形狀越大、顏色越深。成分與靶點(diǎn)之間平均度值為4.2,其中蛋白激酶B(Akt)1、腫瘤蛋白p53(TP53)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9),雌激素受體(ESR1)與其他10個(gè)以上化合物有相互作用關(guān)系,槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、刺芒柄花素(formononetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、異鼠李素(isorhamnetin)和柚皮素(naringenin)等33個(gè)化合物可以與20個(gè)以上的靶點(diǎn)相互作用,并且均具有較高的介數(shù)中心性和緊密中心度,提示芪黃通秘軟膠囊中多成分、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)共同作用機(jī)制。5個(gè)靶點(diǎn)中,Akt1和TP53的度值為17。33個(gè)化合物中,槲皮素的度值最高,可與151個(gè)靶點(diǎn)相互作用;其次為山柰酚,與62個(gè)靶點(diǎn)有相互作用關(guān)系。

圖1 芪黃通秘軟膠囊成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Diagram of “component-target” network of Qihuang Tongmi soft capsules

2.3 芪黃通秘軟膠囊靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

359個(gè)藥物靶點(diǎn)與112成分靶點(diǎn)相交,得到48個(gè)交集靶點(diǎn)。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了芪黃通秘軟膠囊潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共包括42個(gè)節(jié)點(diǎn)和104條邊,節(jié)點(diǎn)表示相關(guān)蛋白,邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系,蛋白顏色越深,度值越高,其在網(wǎng)絡(luò)圖中越重要。度值排序居前5位的蛋白分別為Akt1、TP53、EGFR、MMP9、ESR1,與成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致。此外,氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)、酪氨酸激酶受2(ERBB2)和細(xì)胞周期素D1 (CCND1)等蛋白均具有較高的度值、介數(shù)中心性和緊密中心度,在網(wǎng)絡(luò)中具有樞紐作用。

圖2 芪黃通秘軟膠囊PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network diagram of Qihuang Tongmi soft capsules

2.4 GO功能富集分析

依托DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的68個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,共得到414個(gè)條目,根據(jù)FDR<0.01確定了102個(gè)條目,表1根據(jù)FDR值列出了部分GO條目及基本信息,圖3展示了GO功能富集分析部分結(jié)果。102個(gè)條目中,有55個(gè)條目涉及生物過程,主要集中在正調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction)和蛋白磷酸化(protein phosphorylation)等條目上;31個(gè)條目涉及分子功能,主要集中在蛋白結(jié)合(protein binding)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)和蛋白激活酶活性(protein kinase activity)等條目上;16個(gè)條目涉及細(xì)胞組分,主要集中在質(zhì)膜(plasma membrane)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)和染色質(zhì)(chromatin)等條目上,提示芪黃通秘軟膠囊可能通過影響以上功能達(dá)到治療便秘的目的。

表1 芪黃通秘軟膠囊中部分GO功能基本信息Tab 1 Basic information of partial GO function in Qihuang Tongmi soft capsules

圖3 GO富集分析圖Fig 3 GO enrichment analysis diagram

2.5 KEGG通路富集分析

依托DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的68個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,共得到115個(gè)通路,根據(jù)FDR<0.01確定了73個(gè)通路,表2根據(jù)FDR值列出了部分KEGG通路及基本信息,圖4展示了KEGG通路富集分析部分結(jié)果。115個(gè)通路中主要集中在內(nèi)分泌耐藥(Endocrine resistance)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等通路上。

圖4 KEGG富集分析圖Fig 4 KEGG enrichment analysis diagram

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

使用AutoDockTools 1.5.7軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)受體及其對(duì)應(yīng)的小分子配體化合物進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè),并可視化展示,分子對(duì)接結(jié)果見圖5。

A.山柰酚與Akt1(結(jié)合能為-25.52 kJ/mol);B.槲皮素與CCND1(結(jié)合能為-38.49 kJ/mol);C.木犀草素與ERBB2(結(jié)合能為-38.07 kJ/mol);D.鞣花酸與ESR1(結(jié)合能為-34.31 kJ/mol);E. 川陳皮素與PPARG(結(jié)合能為-30.54 kJ/mol);F.山柰酚與STAT1(結(jié)合能為-26.78 kJ/mol)。A.kaempferol and Akt1 (with the binding energy is -25.52 kJ/mol); B.quercetin and CCND1 (with the binding energy is -38.49 kJ/mol); C.luteolin and ERBB2 (with the binding energy is -38.07 kJ/mol); D.ellagic and ESR1 (with the binding energy is -34.31 kJ/mol); E.nobiletin and PPARG (with the binding energy is -30.54 kJ/mol); F.kaempferol and STAT1 (with the binding energy is -26.78 kJ/mol).圖5 核心成分分子對(duì)接圖Fig 5 Molecular docking diagram of core component

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),探討了芪黃通秘軟膠囊治療便秘的作用機(jī)制。在明確了芪黃通秘軟膠囊中化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),分析了化合物、靶點(diǎn)與疾病之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系,解釋了芪黃通秘軟膠囊治療便秘“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的復(fù)雜作用機(jī)制。

槲皮素、山柰酚、木犀草素和柚皮素均屬于黃酮類化合物,來源較為廣泛,一般具有抗氧化、抗炎、抗感染和抗腫瘤等諸多作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果指出,槲皮素對(duì)心血管疾病、糖尿病和腫瘤等病程較緩的疾病有著較好的防治作用,并能通過促進(jìn)腸道功能恢復(fù)、保護(hù)腸黏膜、調(diào)節(jié)腸道水分等起到治療便秘的作用[10-11];有學(xué)者篩選分析了中藥治療便秘的臨床干預(yù)文獻(xiàn)并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚等化合物是治療便秘的關(guān)鍵成分[12]。其他研究結(jié)果也表明,槲皮素、山柰酚、木犀草素和柚皮素等化合物在其他中藥復(fù)方中均是治療便秘的關(guān)鍵成分[13-14]。

Akt1屬于AGC激酶家族中的成員[15]。研究結(jié)果顯示,Akt1可與棉子低聚糖強(qiáng)結(jié)合達(dá)到治療便秘的效果,其過程主要涉及炎癥、免疫和抗氧化[16]。較多研究結(jié)果表明,方劑益氣開秘湯,中藥黃芪、肉蓯蓉中的化學(xué)成分均能通過與Akt1的結(jié)合達(dá)到治療便秘的效果[14,17-18]。PPARG是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,屬于核受體超家族,具有抗炎、參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及影響動(dòng)脈粥樣硬化形成等功能[19]。有研究結(jié)果指出,刺激PPARα可增加PDZK1的表達(dá),有可能恢復(fù)炎癥誘導(dǎo)的腸黏膜上皮損傷并改善其吸收功能[20]。同時(shí)有證據(jù)表明,PPARG、Akt1也是葛根芩連湯用于潰瘍性結(jié)腸炎治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[21]。ESR1是一種編碼雌激素受體α的基因,是一個(gè)龐大的基因,具有復(fù)雜的內(nèi)在(染色質(zhì)環(huán)境、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路)和外在(腫瘤微環(huán)境、分泌因子)機(jī)制,受多種調(diào)控元件的調(diào)控[22]。對(duì)山楂的一項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示,山楂作用于MTOR、ESR1和PPARG等靶點(diǎn),可減少腸道炎癥反應(yīng),增加腸道運(yùn)動(dòng),減少便秘[23]。STAT1是7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族(STAT1、2、3、4、5a、5b和6)的成員,能調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫、細(xì)胞生長等多種生物事件[24]。有研究結(jié)果表明,炮制后的大戟可以通過下調(diào)STAT1減輕腸道炎癥引起的損傷[25]。

一項(xiàng)基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果表明,陳皮、木香等芳香中藥可作用于內(nèi)分泌耐藥通路,達(dá)到治療便秘的目的[26]。有研究結(jié)果指出,MAPK信號(hào)通路可改變屏障功能和內(nèi)臟超敏反應(yīng),從而改善腸易激綜合征伴隨便秘的癥狀[27]。內(nèi)分泌耐藥通路和MAPK信號(hào)通路均是芪黃通秘軟膠囊活性成分發(fā)揮作用的重要通路。

對(duì)于芪黃通秘軟膠囊的臨床研究,有學(xué)者采用隨機(jī)、雙盲雙模擬、陽性藥平行多對(duì)照的多中心研究方法,對(duì)223例患者服用芪黃通秘軟膠囊的療效和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),有效率>80%且期間未發(fā)生不良反應(yīng)[28]。有研究結(jié)果表明,芪黃通秘軟膠囊可以改善5項(xiàng)便秘癥狀指標(biāo)和8項(xiàng)中醫(yī)證候指標(biāo),總有效率為92.3%[29]。對(duì)284例患者的臨床觀察發(fā)現(xiàn),采用芪黃通秘軟膠囊治療后,治療組患者便秘癥狀的愈顯率和有效率均高于對(duì)照組,且兩組患者均未發(fā)生不良反應(yīng)[30]。有學(xué)者采用開放、多中心設(shè)計(jì),分析2 400例功能性便秘患者服用芪黃通秘軟膠囊后的癥狀改善情況,治療21 d后總有效率為98.8%;54例不良事件中,僅6例被判為不良反應(yīng),不良反應(yīng)發(fā)生率為0.2%,且均為輕度胃腸道不良反應(yīng)[31]。以上研究結(jié)果提示,芪黃通秘軟膠囊在臨床上應(yīng)用是安全、有效的,不良反應(yīng)發(fā)生率低且均為輕微胃腸道不適。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù),在系統(tǒng)層面上揭示了芪黃通秘軟膠囊治療便秘的復(fù)雜作用機(jī)制,為深入開展芪黃通秘軟膠囊臨床相關(guān)研究及應(yīng)用提供了參考和借鑒。