彭清晨 楊光 李英 李澤倫 豐華

1.四川省成都市公安局溫江區(qū)分局 2.公安部第一研究所

引言

在日常法醫(yī)DNA檢驗(yàn)分析中，檢測(cè)平臺(tái)一般由遺傳分析儀和配套試劑耗材兩大部分組成[1]。我國(guó)自2010年研制成功首臺(tái)GA118-16A遺傳分析儀以后[2]，又相繼推出了GA118-16B、GA118-24B系列遺傳分析儀，并在全國(guó)130多家法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室得到大規(guī)模推廣應(yīng)用，徹底解決了“卡脖子”的難題。

配套試劑耗材作為DNA檢驗(yàn)過(guò)程中的重要組成部分，30多年來(lái)我國(guó)法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室一直依賴(lài)進(jìn)口，價(jià)格連年上漲且時(shí)而發(fā)生斷供現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)DNA技術(shù)的發(fā)展[3]。因此國(guó)內(nèi)廠商一直致力于國(guó)產(chǎn)配套試劑耗材的研制，楊敏等采用LIZ500標(biāo)準(zhǔn)品、3130xL遺傳分析儀對(duì)國(guó)產(chǎn)NuHi-POP4凝膠與ABPOP-4凝膠進(jìn)行了平行比對(duì)測(cè)試，從電泳時(shí)間、電流、分辨率等方面進(jìn)行了電泳分離效果的比較[4]；孫敬等利用案件樣本和3130xL遺傳分析儀對(duì)國(guó)產(chǎn)凝膠、甲酰胺、電泳緩沖液等進(jìn)行了分型一致性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[1]。上述研究表明國(guó)產(chǎn)凝膠、甲酰胺、緩沖液等耗材均達(dá)到國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品的技術(shù)水平，可以實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化替代，但由于當(dāng)時(shí)國(guó)產(chǎn)遺傳分析儀并未得到大范圍推廣應(yīng)用，凝膠等試劑耗材的驗(yàn)證均在進(jìn)口3130xL遺傳分析儀上進(jìn)行，采用的是進(jìn)口毛細(xì)管陣列，研究中用到的凝膠、甲酰胺、緩沖液等也并未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用。

成都市公安局溫江區(qū)分局DNA實(shí)驗(yàn)室自2022年引入公安部第一研究所研發(fā)的GA118-24B遺傳分析儀之后，對(duì)儀器進(jìn)行了全面的比對(duì)測(cè)試，產(chǎn)品性能完全滿(mǎn)足實(shí)際檢案需求[5]。24B遺傳分析儀配套國(guó)產(chǎn)電泳耗材，包括24通道毛細(xì)管陣列、SG系列分離膠、高濃度緩沖液、高純度甲酰胺等，成功解決了我國(guó)數(shù)十年來(lái)電泳耗材受制于人的技術(shù)難題，同時(shí)有效降低了使用成本，為我國(guó)今后DNA技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。GA系列耗材可完全適配GA118系列遺傳分析儀，同時(shí)兼容進(jìn)口儀器，本文運(yùn)用控制變量法設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)案件和建庫(kù)樣本驗(yàn)證全套國(guó)產(chǎn)耗材與進(jìn)口耗材的數(shù)據(jù)分型結(jié)果基本一致，通過(guò)各項(xiàng)性能驗(yàn)證，GA系列耗材可以滿(mǎn)足公安機(jī)關(guān)DNA日常檢案的工作需求[6]。

一、主要儀器與耗材

（1）GA118-24B遺傳分析儀、VeriFilerTMPlusPCR擴(kuò)增試劑盒；

（2）進(jìn)口耗材：ABPOP4凝膠、Buffer(10×)、甲酰胺、24通道毛細(xì)管陣列；

（3）國(guó)產(chǎn)耗材：SG2快速分離膠、高濃度緩沖液、高純度甲酰胺、24通道毛細(xì)管陣列（CA118-24L36）；

（4）案件樣本擴(kuò)增產(chǎn)物及其它輔助實(shí)驗(yàn)耗材。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣本準(zhǔn)備：擴(kuò)增案件檢材、口腔拭子各1板（92個(gè)），擴(kuò)增產(chǎn)物均加1μl；

（2）平行測(cè)試：以GA118-24B為平臺(tái)，使用全套進(jìn)口耗材電泳上述兩板樣本；完成后換成全套國(guó)產(chǎn)耗材，進(jìn)行空間校正和光譜校正后電泳，電泳模型采用相同參數(shù)。上樣電壓：1.2kv，進(jìn)樣時(shí)間：10s，采集延遲時(shí)間：1s，運(yùn)行電壓：15kv，運(yùn)行時(shí)間：1200s；

（3）重復(fù)性測(cè)試：采用國(guó)產(chǎn)耗材重復(fù)電泳上述兩板樣本3次；

（4）可靠性測(cè)試：國(guó)產(chǎn)耗材在儀器上放置3天后再次電泳上述兩板樣本（樣本在-20℃冷凍保存）；

（5）采用GeneMapperTMID-X分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

（一）電流波動(dòng)范圍

在毛細(xì)管電泳過(guò)程中，電泳電流的大小和波動(dòng)范圍是重要參數(shù)，電流過(guò)大會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)管內(nèi)部產(chǎn)生的熱量增加，電流波動(dòng)范圍過(guò)大表明電泳回路存在氣泡或緩沖液體系不夠穩(wěn)定，二者均會(huì)影響凝膠的篩分效果和電泳遷移率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明進(jìn)口耗材的電泳電流為175～200μA，波動(dòng)范圍為25μA，國(guó)產(chǎn)耗材的電泳電流為140～170μA，波動(dòng)范圍30μA，二者波動(dòng)范圍差別不大，國(guó)產(chǎn)耗材的電泳電流更低一些，二者均可達(dá)到較好的篩分效果和穩(wěn)定的遷移率，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量（SQ值）均可達(dá)0.9以上。

（二）國(guó)產(chǎn)耗材分辨力

使用全套國(guó)產(chǎn)GA系列耗材測(cè)試，Ladder（等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物）的峰型、峰高與進(jìn)口耗材相比無(wú)明顯差別，如圖1、圖2所示。

D1S1656基因座中的4個(gè)等位基因15.3、16、16.3、17兩組相差1bp的DNA片段均能夠被正確分辨識(shí)別，證明全套國(guó)產(chǎn)GA118系列耗材電泳時(shí)可有效篩分相差1bp的等位基因片段，分辨力≤1bp，如圖3所示。

（三）平行測(cè)試

92個(gè)案件檢材和92個(gè)口腔拭子檢材在相同的參數(shù)下電泳，對(duì)比果顯示，國(guó)產(chǎn)耗材與進(jìn)口耗材的電泳分型結(jié)果一致，國(guó)產(chǎn)耗材的峰高約為進(jìn)口耗材的95%左右，如圖4所示。

（四）重復(fù)性測(cè)試

采用國(guó)產(chǎn)耗材對(duì)上述兩板樣本重復(fù)電泳3次，得到的分型結(jié)果和峰高均一致。

（五）可靠性測(cè)試

將國(guó)產(chǎn)耗材放置3日（72小時(shí)）后，重新電泳上述兩板樣本，得到的數(shù)據(jù)從分型上與第一次電泳一致，峰高約為第一次峰高的80%左右，考慮到樣本降解等因素，此差別在可接受范圍內(nèi)，結(jié)果如圖4所示。

（六）電泳時(shí)間

經(jīng)測(cè)試，GA系列耗材每組實(shí)驗(yàn)的電泳時(shí)長(zhǎng)均短于進(jìn)口耗材（同樣環(huán)境同一運(yùn)行參數(shù)條件下），內(nèi)標(biāo)LIZ 600中最長(zhǎng)的600bp片段在進(jìn)口耗材中出峰時(shí)間為7300幀，在國(guó)產(chǎn)耗材中出峰時(shí)間為4800幀，如圖5、圖6所示。因此在使用國(guó)產(chǎn)GA系列耗材、VeriFilerTMPlusPCR試劑盒時(shí)，在保證所有小于600bp的DNA片段熒光信息全部采集到情況下，可將運(yùn)行時(shí)間縮短至800s，比采用進(jìn)口耗材縮短電泳時(shí)間6分鐘左右[7]。

四、實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用

2023年6月，任某報(bào)稱(chēng)其酒后昏迷疑似被三人輪奸，三名嫌疑人拒不承認(rèn)，辦案民警隨即將受害人所穿內(nèi)褲送檢。

檢驗(yàn)人員采用二步法提取內(nèi)褲上人精子，VeriFilerTMPlusPCR試劑盒擴(kuò)增，GA118-24B遺傳分析器及全套國(guó)產(chǎn)GA系列耗材進(jìn)行電泳檢測(cè)，最終獲得一混合斑，包含兩名嫌疑人的DNA分型，分型準(zhǔn)確無(wú)誤，結(jié)果如圖7所示，該案順利告破。

本實(shí)驗(yàn)室自2022年1月運(yùn)行，分別采用進(jìn)口耗材和國(guó)產(chǎn)耗材在GA118-24B平臺(tái)上進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，截止目前累計(jì)檢驗(yàn)樣本3000余份，其中采用國(guó)產(chǎn)GA系列耗材檢驗(yàn)700余份，與進(jìn)口耗材相比，檢出率無(wú)明顯差距，檢驗(yàn)分型準(zhǔn)確，結(jié)果可靠[5]。

五、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，國(guó)產(chǎn)GA系列耗材與進(jìn)口耗材在GA118-24B測(cè)序儀上的主要性能指標(biāo)基本一致，通過(guò)多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)、峰型等基本無(wú)差異，在電泳精度、靈敏度等方面滿(mǎn)足檢案需求，同時(shí)縮短了電泳時(shí)間，提高了檢驗(yàn)效率，符合當(dāng)下公安工作“快檢”“快比”的實(shí)戰(zhàn)要求。