李榮田，李雙語燕,，孟麗君，劉長華,3，詹俊輝

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心/黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120；3黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

鋅是植物、動物和人體所必須的微量元素之一，主要參與生物大分子的合成、能量和其他物質(zhì)代謝以及氧化還原等過程[1-2]。缺鋅會影響水稻中酶和激素的合成，還會影響光合作用，甚至?xí)档退镜漠a(chǎn)量和品質(zhì)。過量的鋅也會對水稻造成毒害，干擾光合作用，影響植物生長，最終導(dǎo)致植株死亡。另一方面，在人體中缺鋅會導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、免疫功能受損和智力發(fā)育受阻等癥狀[2]。而鋅在人體內(nèi)無法自行合成，須通過日常飲食中獲取，如主要糧食作物之一的水稻。因此，提高水稻籽粒中鋅的含量對于以稻米為主食的人口的鋅營養(yǎng)至關(guān)重要[3]。然而，近年來少有研究對水稻體內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)的調(diào)控基因和分子調(diào)控機制進行闡述、歸納和總結(jié)。因此，本研究基于水稻體內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)的調(diào)控研究，對參與鋅吸收、轉(zhuǎn)運、分配和累積的轉(zhuǎn)運蛋白以及分子調(diào)控途徑進行分類和總結(jié)，以期為水稻鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因的挖掘、分子機制的研究和富鋅水稻種質(zhì)的創(chuàng)制提供理論參考。

1 鋅對植物的重要性

1.1 缺鋅對植物的影響

鋅是植物必不可少的微量元素，缺鋅和鋅過量都會影響植物的生長[4]。鋅與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，作為RNA 聚合酶的組分之一參與蛋白質(zhì)的合成。缺鋅會導(dǎo)致植物RNA 聚合酶活性的下降，影響蛋白質(zhì)的合成。同時，鋅還是維持核糖體蛋白結(jié)構(gòu)完整必不可少的微量元素，缺鋅也會導(dǎo)致蛋白合成受阻和蛋白質(zhì)的含量下降[5]。核糖核酸酶(RNase)活性也受水稻鋅供應(yīng)狀況影響，缺鋅會導(dǎo)致RNase 活性提高，使RNA 含量降低[6]。鋅和光合作用密切相關(guān)。鋅可提高植物中光合過程的強度，鋅既影響光合作用催化過程中碳酸酐酶CA 活性，還能提高植物體內(nèi)葉綠素的含量[7-8]。鋅指蛋白對基因調(diào)控起著重要作用，而鋅是鋅指蛋白的主要成分，與植物相關(guān)的鋅指蛋白可以調(diào)控種子、幼苗、雄蕊和花的發(fā)育[9]。鋅直接參與色氨酸合成，色氨酸又是生長素的主要原料，因此鋅間接影響生長素的合成[10]。鋅參與作物對病害的抗性。缺鋅時，根系生物膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞導(dǎo)致滲出的碳水化合物和游離氨基酸量增多，使病原菌的生長繁殖加快，導(dǎo)致水稻病害加重[11-12]。此外，鋅還可以通過影響植物生理代謝過程來間接影響植物的抗病性[13]。

鋅也影響著作物的營養(yǎng)品質(zhì)。Anandan等[14]研究發(fā)現(xiàn)在水稻籽粒營養(yǎng)品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)水稻籽粒品質(zhì)與鋅濃度有關(guān)，具體表現(xiàn)為鋅含量較高的品種蒸煮后籽粒伸長率、籽粒中其他微量營養(yǎng)素含量較高。籽粒微量含量與顏色相關(guān)，紫黑米中鋅、鈣、鐵、錳、硒等多種微量元素含量都高于白米，這可能是由于紫黑米中含有較多的花青素，而花青素可以與這些金屬元素絡(luò)合[15]。

1.2 過量鋅對植物的影響

盡管鋅在植物生長發(fā)育過程中必不可少，但是鋅過量也會對植物造成損傷，一般植物鋅中毒的臨界值是含鋅量＞50 mg/kg[16]。鋅濃度升高可能會通過影響植物生理代謝來抑制植物生長[17]。ROUT 和Zhu 等研究表明，高濃度鋅抑制了根細胞分裂和細胞伸長，減少了光合作用，干擾線粒體結(jié)構(gòu)以及營養(yǎng)素的吸收和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)ROS 的過度生產(chǎn)[18-20]。植物中ROS 的過度生產(chǎn)會破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)[21-22]。鋅濃度過高導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生致死性損傷，最終導(dǎo)致細胞死亡[23]。高濃度鋅會抑制淀粉酶的活性，抑制種子萌發(fā)，隨著鋅處理濃度升高，處理時間延長，對種子萌發(fā)的抑制性越強[24]。植物體內(nèi)游離脯氨酸可以防止植物細胞或組織結(jié)構(gòu)受損，隨著鋅濃度的增加和處理時間的延長，黑麥草幼苗地上部游離脯氨酸含量升高[25]。過量鋅會影響細胞分裂。鋅濃度的增加和處理時間的延長，細胞分裂會受到抑制，細胞有絲分裂的指數(shù)下降并且分裂細胞的異常率升高[26]。過量鋅也會影響對植物體內(nèi)水分代謝。過量鋅脅迫時，番茄幼苗含水量比對照有所下降[27]。

1.3 水稻鋅的生物強化

鋅在人體的生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不僅可以參與人體內(nèi)必需的酶的合成，還可以參與體內(nèi)的代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程。因此解決缺鋅問題對人體健康至關(guān)重要[2]。鋅在人體內(nèi)無法自行合成，須通過日常飲食中獲取，水稻作為重要糧食作物，近年來越來越多的人關(guān)注水稻的鋅強化。生物強化包括通過農(nóng)藝措施如施肥、育種改良或者轉(zhuǎn)基因生物強化等方式提高作物微量元素含量的方法[28]。而水稻由于其種植和食用地區(qū)的廣泛性，水稻的鋅生物強化是向缺鋅人群提供鋅的方式之一[29]。

農(nóng)藝生物強化是一種以肥料為基礎(chǔ)的方法，施用鋅肥包括直接在土壤施用鋅肥和葉面噴施鋅肥等方式，適量的施用鋅肥可以提高籽粒鋅含量，還可以略微提升產(chǎn)量[30-32]。土壤肥料的使用效率不高，因為土壤中的許多元素會和鋅發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生不溶形態(tài)，降低它們的有效性[33-34]。葉面噴施鋅肥的效果更好，用量更少、吸收較快、且污染小、肥效率高等優(yōu)點，能有效改善籽粒的鋅含量，還能解決由于土壤對鋅的固定所帶來的不易吸收問題[35-37]。

與農(nóng)藝措施不同，通過常規(guī)育種進行生物強化對環(huán)境更友好，但常規(guī)育種非常耗時，可能需要幾年時間才能培育出高鋅籽粒的優(yōu)良品種。常規(guī)育種主要依賴于自然變異，包括主要數(shù)量性狀基因座(QTL)和優(yōu)勢等位基因。在國際水稻研究所分析的939份水稻種質(zhì)資源中，稻米籽粒鋅含量在20～68 μg/g之間[38]。還有研究測定698份水稻精米中鋅含量為5.8～29.6 μg/g[39]。這些研究表明，由于一些種質(zhì)的鋅含量高于水稻鋅含量目標水平，通過常規(guī)育種可以實現(xiàn)高鋅水稻的培育。目前已經(jīng)定位到高鋅籽粒的多個QTL 和優(yōu)勢等位基因，可以通過常規(guī)育種和分子標記輔助育種來培育籽粒鋅含量較高的水稻品種[40-42]。

與傳統(tǒng)育種相比，通過轉(zhuǎn)基因手段進行生物強化是一種更有力、更快的方式。鋅生物強化的基因改造目標包括增加根系對土壤中鋅的吸收，促進鋅向籽粒、特別是向胚乳的轉(zhuǎn)移，以及增加鋅的生物利用率，目前已經(jīng)有研究表明有許多轉(zhuǎn)運蛋白可以極大地提高籽粒鋅含量。

2 影響水稻鋅離子穩(wěn)態(tài)的重要基因

適當增加植物鋅含量有助于提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，但缺鋅會嚴重影響植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致植株矮小，籽粒鋅含量不足，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，研究鋅在植物體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)運、分配和累積的機理具有重要意義。而這些過程需要多種轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)同完成，主要包括：鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白ZIP(zinc-regulated transporters,ironregulated transporter-like protein)、重金屬ATP 酶HMA(heavy metal ATPases of the P1B-type ATPase)、煙酰胺合成酶NAS(Nicotianamine synthase)和植物金屬耐受蛋白MTP(Metal tolerance protein)等[43]（見表1）。

表1 水稻轉(zhuǎn)運體家族部分成員的功能和表達特征

2.1 ZIP轉(zhuǎn)運體

ZIP家族是非常重要的陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，ZIP轉(zhuǎn)運蛋白不僅能轉(zhuǎn)運鋅鐵等必需的微量元素，還能轉(zhuǎn)運有害重金屬元素[44]。目前在水稻中已知有16個ZIP家族成員，包括14個鋅轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白基因和兩個鐵轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白基因。鋅從土壤進入植物的第一步就是通過根系吸收，這一過程需要部分ZIP家族轉(zhuǎn)運蛋白的參與，主要包括OsZIP1、OsZIP5、OsZIP9和OsIRT1。OsZIP1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜，主要在根中表達，是水稻體內(nèi)過量鋅、銅、鎘所必需的金屬外排轉(zhuǎn)運蛋白，敲除OsZIP1根部鋅含量顯著下降，過表達該基因根部鋅含量升高，說明OsZIP1參與水稻根系從土壤吸收鋅的過程[45]。Ramegowda 等[46]實驗表明，在小米和煙草中過表達OsZIP1 增加了種子中鋅的含量。位于5 號染色體上的OsZIP5和OsZIP9，均定位在質(zhì)膜，且在根中的表達受鋅缺乏的誘導(dǎo)[47]。Meng 等[48]研究結(jié)果表明OsZIP9是一個重要的內(nèi)流轉(zhuǎn)運體，負責(zé)從外界介質(zhì)中吸收鋅進入根細胞。在低鋅條件下，敲除OsZIP9顯著降低了植株對鋅的吸收，根和地上部鋅濃度降低，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻[49]。然而，敲除OsZIP9并不能完全抑制水稻對鋅的吸收，說明可能還有其他轉(zhuǎn)運蛋白參與了鋅吸收的過程。作為高度同源的轉(zhuǎn)運蛋白OsZIP5，也參與了植株對鋅的吸收。OsZIP5 敲除突變體降低鋅的吸收，但作用比OsZIP9 敲除系弱，而oszip5/oszip9雙突變體對鋅的吸收能力表現(xiàn)得更弱，說明OsZIP5與OsZIP9 存在功能冗余，協(xié)同調(diào)控植物對鋅的吸收[50]。Lee等[51]研究表明，OsIRT1定位在質(zhì)膜，主要在根中表達。過表達OsIRT1增加了植株根、地上部和籽粒中鋅和鐵含量，也導(dǎo)致了水稻株高變矮、分蘗數(shù)減少。這些結(jié)果表明OsIRT1 通過參與水稻對鋅的吸收影響株高和分蘗數(shù)的改變[52]。

在將鋅從土壤吸收到根部后，一部分鋅儲存到液泡中，另一部分鋅則被轉(zhuǎn)運到地上部。OsZIP4 和OsZIP7參與鋅的轉(zhuǎn)運過程。OsZIP4在維管束和葉片、莖和根的韌皮部表達，另外在根尖和莖的分生組織中表達較為明顯。因此，OsZIP4的功能可能和鋅的轉(zhuǎn)運過程有關(guān)[53]。在田間正常條件下，OsZIP4過表達植株根中鋅含量比野生型高10倍，但地上部鋅含量低5倍，種子中鋅含量降低了4倍，說明OsZIP4過表達減少了鋅從根向地上部的轉(zhuǎn)運[54]。OsZIP7 在根和節(jié)的維管束薄壁細胞中表達，敲除該基因會導(dǎo)致根部鋅濃度上升，地上部鋅濃度下降，說明功能缺失導(dǎo)致鋅從根部向地上部轉(zhuǎn)運減少[55]。

OsZIP3、OsZIP4、OsZIP7和OsZIP8參與了水稻體內(nèi)鋅的分配。OsZIP3定位于水稻莖節(jié)，負責(zé)將鋅從膨大的維管束木質(zhì)部轉(zhuǎn)運到韌皮部[58]。敲除OsZIP3后，植株根部鋅含量和根向地上部轉(zhuǎn)運的鋅并沒有受到影響，而地上部伸長區(qū)和節(jié)點鋅含量降低，表明OsZIP3的功能缺失影響了鋅從節(jié)點分配到地上部快速生長組織的能力[56]。OsZIP4 基因敲除不影響植株對鋅的總吸收量，但會導(dǎo)致穗部發(fā)育遲緩，這與鋅在穗部的分配減少有關(guān)，表明OsZIP4也參與了生殖生長階段節(jié)間鋅的分配[57]。OsZIP7 敲除會導(dǎo)致鋅和鎘在根和基部節(jié)中滯留，阻礙其向節(jié)和籽粒中的運輸。以上結(jié)果表明，OsZIP7 具有向發(fā)育中的組織和籽粒中分配鋅的功能[58]。OsZIP8是定位于質(zhì)膜的鋅轉(zhuǎn)運蛋白，其表達受缺鋅的誘導(dǎo)。過表達OsZIP8 導(dǎo)致旗葉和籽粒中鋅含量降低，說明OsZIP8 在鋅的分配過程中起負調(diào)控作用[59]。

有研究表明，ZIP家族具有吸收、轉(zhuǎn)運和分配鋅的能力，同源基因的功能可能比較類似，但由于生存環(huán)境的差異或者其他因素的影響，不同物種同源基因的功能存在差異。在水稻中，OsZIP4與鋅的分配和轉(zhuǎn)運有關(guān)；但在蒺藜苜蓿中，MtZIP4與鋅、鐵和錳的分配和轉(zhuǎn)運有關(guān)[60]。過表達OsZIP8影響鋅在水稻體內(nèi)的分配，而酵母實驗表明AtZIP8 轉(zhuǎn)運蛋白對鋅沒有轉(zhuǎn)運活性[61]。因此ZIP轉(zhuǎn)運蛋白在不同植物中的功能可能存在差異。

2.2 HMA轉(zhuǎn)運體

重金屬離子跨膜蛋白HMA家族通過ATP水解提供的能量實現(xiàn)重金屬離子在細胞膜上的跨膜轉(zhuǎn)運[62]。水稻中共有9 個HMA 家族成員，根據(jù)其金屬-底物特異性劃分為兩類，一類是鋅、鎘、鈷和鉛轉(zhuǎn)運蛋白包括OsHMA1、OsHMA2 和OsHMA3[63]。OsHMA1 定位在質(zhì)膜上，在地上部表達，缺鋅條件下表達上調(diào)[64-65]。OsHMA2定位于根的中柱鞘和節(jié)內(nèi)維管束韌皮部，可能在鋅和鎘向木質(zhì)部和根的轉(zhuǎn)運中起作用，在低鋅脅迫和鋅毒害下表達沒有明顯變化，OsHMA2基因敲除導(dǎo)致根尖鋅含量減少[66-67]。OsHMA3 定位在液泡膜，在同位素示蹤實驗中，OsHMA3功能缺失材料根中鋅含量較低，而OsHMA3功能正常材料根系中更多的鋅被轉(zhuǎn)運到地上部，說明OsHMA3在鋅的轉(zhuǎn)運中起正調(diào)控作用[68]。另一類是銅、銀轉(zhuǎn)運蛋白包括OsHMA4、OsHMA5、 OsHMA6、 OsHMA7、 OsHMA8 和OsHMA9[63]，其中OsHMA9定位在質(zhì)膜，主要在維管束和花藥中表達，并受高濃度銅、鋅和鎘條件的誘導(dǎo)。TDNA插入的OsHMA9突變體表現(xiàn)出對高濃度銅、鋅和鉛極強的敏感性，表明OsHMA9 可能參與銅、鋅和鉛的外排[69]。

2.3 NAS轉(zhuǎn)運體和MTP轉(zhuǎn)運體

煙草胺是植物體內(nèi)一種主要的金屬螯合劑，由煙酰胺合成酶NAS催化合成，NAS在鋅和鐵的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用[70]。在缺鋅條件下，OsNAS1 和OsNAS2 在根中表達無顯著差異，而OsNAS3 和OsNAAT1 在根和地上部的表達量上升[71]。Johnson等[72]研究表明，過表達OsNAS1、OsNAS2 和OsNAS3植株籽粒中煙酰胺、鋅和鐵的含量都顯著提高，其中在過表達OsNAS2和OsNAS3的植株中表現(xiàn)更為明顯。

離子擴散協(xié)助蛋白CDF(cation diffusion facilitator)家族也稱為植物金屬耐受蛋白MTP，與維持生物體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)及生物重金屬耐性密切相關(guān)[73]。水稻MTP家族中有10個成員，OsMTP1定位在液泡膜，在酵母異源互補實驗中發(fā)現(xiàn)OsMTP1提高了對鋅和鎘的耐性[74-75]。

2.4 其他基因

植物液泡是儲存多余營養(yǎng)元素的重要細胞器，VIT轉(zhuǎn)運蛋白在液泡存儲鋅的過程中發(fā)揮著重要的作用。OsVIT1 和OsVIT2 定位于液泡膜上，分別在葉片和葉鞘中高表達，在酵母突變體Δccc1和Δzrc1中異源表達OsVIT1 和OsVIT2 可以部分回復(fù)突變體鐵和鋅敏感的表型，并且增加了液泡中鐵、鋅和錳的積累，表明OsVIT1 和OsVIT2 有跨液泡膜運輸鐵、鋅和錳的功能[75]。Che 等[76]研究發(fā)現(xiàn)OsVIT2 在節(jié)點高表達，OsVIT2定位在節(jié)點的薄壁細胞和葉鞘中。OsVIT1和OsVIT2 的功能缺失均導(dǎo)致水稻籽粒中鋅和鐵的含量增加，劍葉中鋅和鐵的積累相應(yīng)減少，表明源器官和庫器官之間鋅和鐵的轉(zhuǎn)運增加[76-78]。

轉(zhuǎn)運蛋白超家族MFS(major facilitator super family)是第二大膜轉(zhuǎn)運蛋白之一，廣泛存在于生物體中，水稻鋅誘導(dǎo)促進家族基因ZIFL(ZINC-INDUCED FACILITATOR-LIKE)是MFS 中的一員[79]。在鋅過量處理條件下，根中OsZIFL2、OsZIFL4、OsZIFL5、OsZIFL7、OsZIFL10 和OsZIFL12 的表達上調(diào)[80]。OsVMT，即OsZIFL12，定位在液泡膜，在鐵和鋅含量較高的節(jié)間1 的薄壁細胞中高表達。OsVMT 突變體促進了水稻籽粒中鐵和鋅的積累[81]。

水稻有毒化合物外排轉(zhuǎn)運復(fù)合體(Multidrug and toxic compound extrusion, MATE) 基因OsFRDL1(Ferric reductase defective like1)，主要在根部表達，但表達水平既不受缺鐵也不受鋁毒害的影響。敲除OsFRDL1 會導(dǎo)致植株葉片失綠，鐵含量降低，鋅和錳的含量增加[82-83]。金屬硫蛋白(MTs)是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，參與了金屬的動態(tài)平衡和解毒作用[84-85]。Lei等[86]研究發(fā)現(xiàn)OsMT2b和OsMT2c在水稻節(jié)間高表達，分別敲除這兩個基因會導(dǎo)致節(jié)間鋅的積累，但籽粒中鋅含量降低，說明OsMT2b 和OsMT2c 在鋅的分配中有著重要作用。OsYSL6、OsYSL8、OsYSL14、OsNRAMP1、OsNRAMP7、OsNRAMP8、OsNAS1、OsFRO1和OsNAC5在水稻劍葉中的表達量和籽粒中鋅或鐵含量顯著相關(guān)[87]。

3 分子調(diào)控機制

3.1 bZIP-ZIP調(diào)控模塊

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)也稱反式作用因子，可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游相關(guān)基因來適應(yīng)環(huán)境的變化。目前在動植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中bZIP轉(zhuǎn)錄因子存在于所有真核生物當中[88]。水稻中bZIP轉(zhuǎn)錄因子有89個，其中F 亞家族包括3 個成員，OsbZIP48、OsbZIP49 和OsbZIP50[89]。OsbZIP48定位在細胞核，在細胞質(zhì)中也有部分表達，其功能缺失會使植株對缺鋅更敏感[89]。通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，OsbZIP48 突變使OsZIP4 和OsZIP8 表達下調(diào)，從而影響了水稻中鋅的轉(zhuǎn)運[88]。Lilay 等[90]研究發(fā)現(xiàn)，過表達OsbZIP48 和OsbZIP50 能恢復(fù)bzip19bzip23雙突變體的缺鋅敏感表型雙突變體表型。在擬南芥中，AtbZIP19 和AtbZIP23 通過結(jié)合ZIP 轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)中的缺鋅反應(yīng)元件ZDRE(Zinc deficiency response element)來參與植物對缺鋅的耐受性和鋅累積的調(diào)控過程[91]。在不同物種的ZIP轉(zhuǎn)運體中，ZDRE 基序有著高度的保守性[92]。Lilay 等通過酵母單雜交文庫的篩選和EMSA 實驗證明，OsbZIP48 和OsbZIP49 也可以結(jié)合ZDRE 基序。而酵母單雜交文庫篩選中并未發(fā)現(xiàn)OsbZIP50，可能的原因是OsbZIP50主要在根中表達，而酵母單雜交文庫篩選所用的cDNA文庫來源于水稻地上部，因此OsbZIP50是否能結(jié)合ZDRE基序需要進一步的實驗驗證[90]。此外，在對ZIP轉(zhuǎn)運體基因的啟動子區(qū)序列分析中發(fā)現(xiàn)，OsZIP4、OsZIP8和OsZIP10的啟動子區(qū)不僅存在完整的ZDRE 基序，也存在個別堿基替換的類型[90]。這一結(jié)果暗示著bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可能也與個別堿基替換的ZDRE基序結(jié)合調(diào)控。

3.2 NAC-ZIP調(diào)控模塊

NAC 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，在離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。在水稻中，NAC 轉(zhuǎn)錄因子影響根的發(fā)育、水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量，在應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫等方面起著重要作用[93]。OsNAC15定位在細胞核上，其表達受缺鋅和過量鋅的抑制[94]。敲除OsNAC15 降低水稻對缺鋅的耐受性，且根部和地上部鋅含量減少。進一步生化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsNAC15 能和OsZIP7 和OsZIP10 的啟動子直接結(jié)合并對其轉(zhuǎn)錄負調(diào)控。通過酵母單雜實驗發(fā)現(xiàn)，OsNAC15可以和ZDRE基序結(jié)合，說明ZIP基因啟動子中的ZDRE 基序不僅可以bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，也可以被NAC 類型的轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)OsNAC15 也可以與不含ZDRE 基序的ZIP 基因啟動子片段結(jié)合，表明啟動子區(qū)可能還存在著其他順式元件被OsNAC15結(jié)合[94]。

綜上所述，水稻F-bZIP 家族成員和OsNAC15 可以結(jié)合含有完整或個別堿基替換的ZDRE 基序，表明完整或個別堿基替換的ZDRE基序可能在缺鋅調(diào)控機制中具有一定的保守性。因此，本研究對與鋅相關(guān)轉(zhuǎn)運體基因的啟動區(qū)序列進行分析。如表2 所示，在OsZIP5、OsZIP7、OsZIP9 和OsZIP10 中含有完整的ZDRE基序，所有基因里面含有最多的4個ZDRE基序的基因是OsHMA1，OsZIP8、OsZIP10 和OsVIT1 含有3個ZDRE基序，這些啟動子區(qū)含有ZDRE基序較多的基因可以在后續(xù)bZIP-ZIP 和NAC-ZIP 調(diào)控模塊的驗證中作為重點候選靶基因。

表2 轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)中ZDRE基序的分析

3.3 RR-ZIP調(diào)控模塊

細胞分裂素作為重要的生長調(diào)節(jié)劑影響著植物生長發(fā)育的各個階段，其活性受環(huán)境因素的影響[95]。植物反應(yīng)調(diào)控因子RR(response regulator)參與細胞分裂素信號調(diào)控，目前在水稻中發(fā)現(xiàn)了7個A型RR和5個B 型RR 基因[96-97]。Gao 等[98]研究發(fā)現(xiàn)，OsZIP1 和OsZIP5的表達受細胞分裂素的負調(diào)控，且它們的啟動子區(qū)中存在細胞分裂素響應(yīng)元件RR。酵母單雜交和雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，OsRR22 蛋白可以直接與OsZIP1 和OsZIP5 基因的啟動子結(jié)合，并促進其表達。這些結(jié)果表明，缺鋅條件下，細胞分裂素的合成減少，OsRR22 上調(diào)表達，影響ZIP 家族基因的表達，從而提高了籽粒鋅含量。此外，細胞分裂素也抑制了NAS和HMA家族基因的表達。

與bZIP 和NAC 轉(zhuǎn)錄因子不同的是，RR 類型的轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合RR 響應(yīng)元件來直接調(diào)控ZIP 轉(zhuǎn)運體基因的表達[98]。這一結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運體啟動子區(qū)中的RR響應(yīng)元件可被RR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與由細胞分裂素介導(dǎo)的缺鋅耐性和籽粒鋅含量累積的調(diào)控過程。因此，本研究對鋅相關(guān)轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)中的RR 響應(yīng)元件進行了分析。如表3 所示，其中OsZIP3、OsZIP9 和OsHMA2 最多含有8 個RR 元件，這些基因可以作為后續(xù)驗證的重點候選基因。

表3 轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)中RR響應(yīng)元件的分析

綜上所述，OsbZIP48、OsbZIP49和OsNAC15可以通過結(jié)合ZIP家族基因啟動子中的ZDRE序列來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)水稻對鋅缺乏的耐性。細胞分裂素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsRR22 可以通過結(jié)合RR 響應(yīng)元件激活OsZIP1和OsZIP5的轉(zhuǎn)錄，抑制NAS和HMA家族基因的表達，調(diào)節(jié)水稻內(nèi)鋅的吸收、轉(zhuǎn)運和分配，影響籽粒鋅含量的累積（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的鋅缺乏調(diào)控模式圖

4 展望

由于目前植物和人類缺鋅是全球面臨的十分嚴重的問題，提高作物缺鋅脅迫耐受性，提高籽粒中鋅含量至關(guān)重要。研究轉(zhuǎn)運體基因?qū)︿\的吸收、轉(zhuǎn)運和分配及其在籽粒中累積的規(guī)律，可為富鋅水稻的培育提供理論基礎(chǔ)。目前雖然已經(jīng)鑒定了諸多鋅的轉(zhuǎn)運體家族成員，并對其功能和分子機制有初步的解析，但土壤中鋅向不同器官、組織、細胞和細胞器轉(zhuǎn)運的分子機制尚不明確。例如，鋅外流轉(zhuǎn)運體的吸收、木質(zhì)部的負載和分配如何實現(xiàn)還尚未明確。在細胞內(nèi)，鋅被運輸?shù)讲煌钠鞴?，如葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以實現(xiàn)各種功能，但實現(xiàn)這一過程的轉(zhuǎn)運體仍然不清楚。此外，鋅轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)和鋅響應(yīng)的分子機制也需要在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上進行研究。目前對多個鋅轉(zhuǎn)運體協(xié)同調(diào)控的研究較少，現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運體家族中也有許多未被深入研究的成員。對于目前已經(jīng)驗證過的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的鋅缺乏調(diào)控機制，對其他含有相同元件的基因是具有相同的調(diào)控作用尚未被驗證。轉(zhuǎn)錄因子是直接接收缺鋅信號，還是通過接收上游其他蛋白（如蛋白激酶）傳遞的信號來參與鋅缺乏耐性和籽粒累積，還有待進一步的研究。因此，未來可以對轉(zhuǎn)運體家族基因中鋅元素吸收、轉(zhuǎn)運和分配的生理機制，土壤中鋅向不同器官、組織、細胞和細胞器轉(zhuǎn)運的分子機制，以及轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)含有鋅調(diào)控相關(guān)元件基因的調(diào)控機制進行深入研究，以期為富鋅水稻種質(zhì)的創(chuàng)制提供理論依據(jù)。