馬智勇，李美成，馬巍，王春強(qiáng)

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

0 引言

RNA-seq技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展為生物信息學(xué)領(lǐng)域的研究帶來了新的契機(jī)，其可分別檢測(cè)有、無參考序列的轉(zhuǎn)錄組，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和尋找新的信息[1]，其產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)為可變剪接的研究帶來了新的思路和方法，被廣泛應(yīng)用于功能基因的挖掘[2]。Gilbert[3]于1978 年首次發(fā)現(xiàn)基因的AS現(xiàn)象，是指真核生物轉(zhuǎn)錄過程中，基因的一個(gè)mRNA前體通過不同的剪接方式切除內(nèi)含子，重新拼接外顯子產(chǎn)生成熟的mRNA 的過程。近年來的試驗(yàn)研究結(jié)果陸續(xù)表明，可變剪接在許多物種的多個(gè)生物學(xué)過程中起著重要作用，如遺傳信息的穩(wěn)定性及翻譯效率[4]，動(dòng)植物生長、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物和非生物脅迫的反應(yīng)等方面[5-8]。

下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸控制家禽的生殖活動(dòng)，是調(diào)控家禽生殖發(fā)育的主要樞紐[9]。雛雞性成熟后進(jìn)入產(chǎn)蛋期，而其性成熟的主要特征是生殖系統(tǒng)的發(fā)育成熟，即卵泡發(fā)育成熟，正常排卵，形成雞蛋排出體外。生殖激素在這個(gè)過程中發(fā)揮著重要作用，而調(diào)控生殖激素分泌的中心是HPG軸[10-11]。來自機(jī)體內(nèi)外的影響因素會(huì)通過刺激HPO軸或者卵巢、卵泡等靶器官來調(diào)控雞的內(nèi)分泌激素，從而調(diào)控雞的產(chǎn)蛋性能。

莊河大骨雞以體大、蛋優(yōu)、肉美而聞名，是中國遼寧省的地方蛋雞品種，是中國優(yōu)良的肉蛋兼用型地方品種雞[12]。然而，近年來，由于系統(tǒng)選育的缺乏導(dǎo)致其產(chǎn)蛋性能遺傳進(jìn)展緩慢[13-14]，因此，提高產(chǎn)蛋率是繁育工作的重點(diǎn)之一。目前調(diào)節(jié)母雞產(chǎn)蛋機(jī)制的研究集中在卵巢中不同卵泡發(fā)育階段基因調(diào)控的變化[15]，對(duì)蛋雞的垂體和下丘腦的研究相對(duì)較少。因此，本研究基于RNA-seq 技術(shù)對(duì)高產(chǎn)和低產(chǎn)蛋雞下丘腦和垂體中的AS事件和新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)進(jìn)行分析。旨在尋找參與調(diào)控母雞產(chǎn)蛋過程的新基因，為加快莊河大骨雞產(chǎn)蛋性能的遺傳進(jìn)展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

試驗(yàn)用6只母雞均采自于錦州醫(yī)科大學(xué)大骨雞試驗(yàn)場(chǎng)，屠宰后取垂體和下丘腦組織迅速置于液氮中，并在-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。根?jù)母雞在產(chǎn)蛋高峰期39～42周內(nèi)產(chǎn)蛋的數(shù)量，將母雞分為高產(chǎn)組和低產(chǎn)組（L組3只和N組3只），L組和N組在此期間分別產(chǎn)蛋25個(gè)和14個(gè)，組內(nèi)各只母雞產(chǎn)蛋數(shù)量相同。

1.2 RNA分離，文庫構(gòu)建及測(cè)序

利用Trizol試劑從垂體和下丘腦組織樣品中提取總RNA。Nanodrop 2000 分光光度計(jì)（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）檢測(cè)RNA純度。通過Qubit 2.0精確定量RNA濃度，并通過Agilent2100生物分析儀（安捷倫科技中國有限公司生產(chǎn)2100 生物分析儀）評(píng)估RNA 完整性。 樣品經(jīng)過測(cè)試后，利用NEBNext?UltraTMRNA 文庫制備試劑盒，試劑盒由安捷倫科技有限公司提供制備文庫。于Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)上評(píng)估文庫質(zhì)量。文庫制備物在Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)上測(cè)序，使用PE 150 配對(duì)末端測(cè)序策略。

1.3 數(shù)據(jù)分析

Fastq 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和評(píng)估。該研究中雞參考基因組序列（90 版）由基因組網(wǎng)站下載(ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/gallus_gallus/dna/Gallus_gallus.Gallus_gallus-5.0.dna.toplevel.fa.gz)。Hisat2v2.0.5構(gòu)建參考基因組索引，將配對(duì)末端過濾后讀數(shù)與參考基因組比對(duì)?；谒袛?shù)據(jù)的基因組定位結(jié)果，利用Cufflinks軟件組裝轉(zhuǎn)錄物。

1.4 可變剪接事件分析

使用 rMATS(http://rnaseq- mats.sourceforge.net/index.html)軟件比較結(jié)果中每個(gè)樣本的AS 事件進(jìn)行分類、數(shù)量統(tǒng)計(jì)以及對(duì)差異可變剪接事件進(jìn)行分析。根據(jù)P值和錯(cuò)誤發(fā)生率(False discovery rate，F(xiàn)DR)鑒定差異AS 事件。以FDR＜0.05 作為差異AS 事件的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 差異剪接基因(DSG)的功能富集分析

應(yīng)用DAVID 在線功能注釋軟件(http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)進(jìn)行差異可變剪接基因的GO注釋和KEGG途徑的富集分析。

1.6 新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)和基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化

使用rMATs 軟件分析樣品基因剪接與原有剪接模型之間的差異，對(duì)映射數(shù)據(jù)中的讀數(shù)進(jìn)行新可變剪接事件預(yù)測(cè)。使用cufflinks 拼接得到的基因注釋文件，與原有基因注釋文件進(jìn)行比較，找出原有注釋中未包含的基因并對(duì)基因的位置進(jìn)行優(yōu)化，補(bǔ)充并修改原有注釋文件。

1.7 RT-PCR驗(yàn)證雌激素受體1(ESR1)的AS事件

使用逆轉(zhuǎn)錄酶HIScript III RT 試劑盒(Vazyme Biotech Co.，Ltd)、oligo-dT 引物對(duì)總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄分析。使用DNAman 根據(jù)不同轉(zhuǎn)錄物的保守區(qū)域在單個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增出4 個(gè)剪接變體。用于RT-PCR 的ESR1的引物序列如下：正向 5'-TTGATGGTGCTTTGAG- 3' 和反向5'-GAATGCCAGGTTCTGT-3'，由北京華大基因生物公司完成引物合成。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建文庫的測(cè)序

為研究高產(chǎn)和低產(chǎn)蛋雞垂體和下丘腦中的AS 事件，本試驗(yàn)對(duì)莊河大骨雞的垂體和下丘腦組織進(jìn)行了RNA-seq 分析。構(gòu)建了12 個(gè)cDNA 文庫，共產(chǎn)生約8.25 億原始讀數(shù)，經(jīng)質(zhì)量控制后共有約7.99 億干凈讀數(shù)，用于后續(xù)分析檢測(cè)。85.57%～87.92%的序列被定位到參考基因組上。構(gòu)建的12個(gè)文庫中，讀數(shù)映射到“+”鏈(41.09%～42.23%)和“-”鏈上(41.15%～42.32%)比例幾乎相等（表1），AT和GC曲線均基本重合，表明堿基組成平衡，測(cè)序正常。

表1 測(cè)序分析

2.2 AS及DSGs的檢測(cè)

6 個(gè)垂體組織文庫中，從8720 個(gè)基因中檢測(cè)到16458 AS 事件（平均每個(gè)基因可檢測(cè)到1.89 個(gè)AS 事件），差異AS事件總數(shù)為769，其中，上調(diào)差異AS事件為384，下調(diào)差異AS事件為385，可識(shí)別5種不同類型的AS事件，按發(fā)生頻率由高到低分別為：SE(83.87%)、MXE(8.90% )、RI(3.11% )、A3SS(2.41% )、A5SS(1.71%)?；騍LMAP（39AS 事件）、CIB1（28AS 事件）、NRCAM（24AS事件）產(chǎn)生AS事件頻率較高，且主要為SE和MXE類型。

6 個(gè)下丘腦組織文庫中，從9448 個(gè)基因中檢測(cè)到19021 AS 事件（平均每個(gè)基因可檢測(cè)到2.01 個(gè)AS 事件），差異AS事件總數(shù)為813，其中，上調(diào)差異AS事件為418，下調(diào)差異AS 事件為395，可識(shí)別5 種不同類型的AS事件，按發(fā)生頻率由高到低分別為：SE(83.77%)、MXE(10.06% )、RI(2.64% )、A3SS(2.07% )、A5SS(1.46%)?；騈RCAM（38AS 事件）、SLMAP（33AS 事件）、CIB1（28AS事件）產(chǎn)生AS事件頻率較高，主要類型同垂體文庫檢測(cè)結(jié)果（表2）。綜上，12 個(gè)組織文庫中，SE類型發(fā)生的比例均為最高，A5SS發(fā)生的比例均為最低；基因NRCAM、SLMAP、CIB1在兩類組織文庫中均發(fā)生較高頻率的AS事件。

表2 AS分類、數(shù)量及DSGs

以FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)rMATS軟件分析結(jié)果進(jìn)行差異篩選，垂體組織文庫中共篩選到644 個(gè)顯著的差異剪接基因，在SE、MXE、RI、A3SS、A5SS事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為548、159、32、18、11；下丘腦組織文庫中共篩選到680 個(gè)顯著的差異剪接基因，在SE、MXE、RI、A3SS、A5SS 事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為613、142、31、24、9；兩類文庫差異剪接基因中，SE 占比例均為最高，A5SS 占比例均為最低，趨勢(shì)同AS事件相似（表2、表3）。

表3 參與AS事件的基因（5例）

2.3 基因的功能注釋和富集分析

為進(jìn)一步闡明DSGs的功能，本試驗(yàn)進(jìn)行了GO和KEGG 途徑富集分析，以注釋DSGs 并研究其分布。垂體組織文庫中，644 個(gè)DSGs 中的329 個(gè)基因得到功能注釋，基因富集在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的占比分別為27%、33%、40%（圖1A）。68%的DSG 同時(shí)富集于3 個(gè)功能分類。下丘腦組織文庫中，680 個(gè)DSGs中的337個(gè)基因得到功能注釋，基因富集在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的占比分別為26%、52%、22%（圖1B）。64%的DSG同時(shí)富集于3個(gè)功能分類。

圖1 GO分類

垂體組織文庫中，24 個(gè)DSGs 富集于3 個(gè)KEGG途徑，其中MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑顯著富集(P＜0.05)，12個(gè)DSGs 參與MAPK 途徑。下丘腦組織文庫中，22 個(gè)DSGs富集于3個(gè)KEGG途徑，粘附連接途徑顯著富集(P＜0.05)，7個(gè)DSGs參與該途徑（表4）。

表4 KEGG途徑富集分析以注釋DSGs

2.4 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

構(gòu)建的12個(gè)文庫中共獲得6758個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，長度分布于170～35112 bp之間。根據(jù)外顯子的預(yù)測(cè)結(jié)果，新轉(zhuǎn)錄本包含1～68個(gè)外顯子。部分新轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)見表5。構(gòu)建的文庫中共12486個(gè)基因結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，6230個(gè)基因的5’端發(fā)生延伸，6256個(gè)基因的3’端發(fā)生延伸，部分已注釋基因的優(yōu)化結(jié)果見表6。

表5 新轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果（7例）

表6 已知基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化（10例）

2.5 ESR1基因的RT-PCR檢測(cè)

分析中發(fā)現(xiàn)雌激素受體基因ESR1具有較多的AS事件，產(chǎn)生4種類型AS（圖2）。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)不同長度的片段（分別為845、624、509 bp）（圖3），表明垂體中的ESR1確實(shí)存在于不同的AS事件中。

圖2 4種AS類型

圖3 ESR1基因的RT-PCR檢測(cè)

3 討論

本研究基于RNA-seq 技術(shù)，以雞基因組序列（版本90）作為參考基因組，構(gòu)建了雞垂體和下丘腦文庫。檢測(cè)到5 種類型的AS 事件(SE、RI、A5SS、A3SS、MXE)，均為普遍認(rèn)同的AS的5種基本形式。AS事件的類型在不同生物中發(fā)生情況各不相同：據(jù)報(bào)道，在哺乳動(dòng)物特別是小鼠中，SE 是AS 事件的最常見類型[8,16]；但在植物研究中發(fā)現(xiàn)，RI 是水稻和竹子的主要AS 事件類型，分別占總數(shù)的47%和27.43%[13,17]；在對(duì)低等生物的研究中，已發(fā)現(xiàn)RI 是根瘤菌的主要AS 事件類型，占總數(shù)的84.3%[14]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋雞的垂體和下丘腦的研究表明，SE占AS事件的比例最高，分別為83.87%和83.77%，A5SS 的比例最低，分別占AS 事件的1.71%和1.46%，與大多數(shù)哺乳動(dòng)物相同。

家禽可以通過HPG 軸合成和釋放激素以調(diào)節(jié)繁殖活動(dòng)。家禽中的HPG 軸與哺乳動(dòng)物中的HPG 軸差異較大，表現(xiàn)出可塑性[18]。本研究中，低產(chǎn)蛋雞下丘腦中的22 個(gè)DSGs 被定位到粘連、緊密連接和鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑，26 個(gè)DSGs 參與了Ca2+結(jié)合或釋放通道活性的生物學(xué)過程。目前，普遍認(rèn)為鈣信號(hào)傳導(dǎo)是促性腺激素釋放激素(GnRH)調(diào)節(jié)促性腺激素合成和釋放的主要機(jī)制。研究表明，下丘腦鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑異常會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，調(diào)節(jié)下丘腦進(jìn)食神經(jīng)元的興奮性，從而影響動(dòng)物的進(jìn)食以減少能量的攝入，進(jìn)而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸[15]。同時(shí)，大量研究證實(shí)，鈣離子在調(diào)節(jié)GnRH 快速分泌促性腺激素中起重要作用[19-20]。因此，我們推測(cè)下丘腦Ca2+相關(guān)通路異常可能降低底物合成效率，影響促性腺激素的合成和分泌。

本研究中，低產(chǎn)蛋雞垂體中的24 個(gè)DSGs 定位于心肌細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路、心肌收縮或腎上腺素能信號(hào)通路。研究表明，GnRH與GnRHR的結(jié)合可激活MAPK途徑，但機(jī)制尚不完全清楚，GnRHRs可能參與了許多蛋白質(zhì)信號(hào)復(fù)合物的組裝[14]。在小鼠垂體細(xì)胞中，GnRHRs與ERK2共定位于脂筏[21]，ERK 的GnRH 活化也參與鈣離子募集過程，這可能部分解釋了GnRH在垂體中的作用機(jī)理。

下丘腦中合成的GnRH通過作用于垂體前葉以將其天然的高親和力跨膜受體GnRHR結(jié)合在細(xì)胞表面上，從而刺激促性腺激素的信號(hào)級(jí)聯(lián)[22]。迄今為止，已經(jīng)使用常規(guī)的生化和生物信息學(xué)工具鑒定了許多GnRH 和GnRHR基因[23-24]。已在哺乳動(dòng)物中鑒定出GnRHR家族的3個(gè)成員[25]，但尚未對(duì)家禽中的GnRHR基因進(jìn)行系統(tǒng)的研究。本研究中確定了垂體中5 個(gè)GnRHR的AS事件，其中4個(gè)為SE、1個(gè)為MXE。

在GO分析中，垂體的4個(gè)DSGs，即神經(jīng)生長因子(NGF)，視黃酸8(STRA8)，EPH 受體A5(EPHA5)和mutS 同系物4(MSH4)注釋為卵泡發(fā)育的生物學(xué)過程。神經(jīng)生長因子(NGF)AS 事件在低產(chǎn)和高產(chǎn)母雞垂體中有所不同。雖然關(guān)于NGF對(duì)雞垂體生殖功能的影響少有報(bào)道。但近年來，NGF在哺乳動(dòng)物的非神經(jīng)系統(tǒng)中的作用已成為研究熱點(diǎn)。如，已經(jīng)在NGF敲除小鼠模型中系統(tǒng)地研究了NGF在卵泡形成和早期卵泡發(fā)育中的作用[26]。缺乏NGF基因的小鼠卵巢表現(xiàn)出嚴(yán)重的異型增生，卵母細(xì)胞不能被顆粒細(xì)胞包圍而形成卵泡結(jié)構(gòu)。初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的數(shù)量也顯著減少，表明NGF對(duì)于次級(jí)卵泡的形成至關(guān)重要[27]。NGF可以影響卵巢中某些基因的表達(dá)。NGF的丟失會(huì)導(dǎo)致FSHR基因在卵巢中的表達(dá)顯著降低。相反，當(dāng)使用外源性NGF治療新生野生型小鼠卵巢時(shí)，F(xiàn)SHR的表達(dá)顯著增加[28]。需要進(jìn)一步的研究來確定母雞垂體中NGF的不同AS事件是否以內(nèi)分泌方式影響母雞卵泡的發(fā)育，并進(jìn)一步影響產(chǎn)蛋過程。STRA8編碼視黃酸反應(yīng)蛋白。小鼠中STRA8的同源蛋白已被證明參與精子發(fā)生和卵子發(fā)生中減數(shù)分裂起始的調(diào)控[29]。但小鼠和母雞STRA8蛋白之間的特異性差異表明，這些同源物在功能上并不相同。編碼STRA8的基因被認(rèn)為在母雞產(chǎn)蛋過程中起作用。但有研究表明，EPHA5和MSH4參與卵巢卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞增殖和分化以及激素的合成和分泌[27-30]。EPHA5和MSH4在垂體中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報(bào)道。不同AS形式的具體功能需要進(jìn)一步研究。

在垂體中發(fā)現(xiàn)了許多AS 事件，如據(jù)報(bào)道雌激素受體1(ESR1)在垂體中發(fā)揮作用。雌激素對(duì)于動(dòng)物卵泡的發(fā)育至關(guān)重要，并且2 種雌激素受體具有獨(dú)立的功能[31]。雌激素受體(ERs)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，引起以ER為中心的信號(hào)傳導(dǎo)過程[32]。雌激素受體的2 種亞型ESR1和ESR2存在于垂體中，但受體敲除模型表明ESR1是雌激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)的主要受體[33]。此外，雌激素可負(fù)面調(diào)節(jié)女性的垂體功能并調(diào)節(jié)其生殖活動(dòng)[34]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ESR1基因多態(tài)性與中國大骨雞的產(chǎn)蛋特性密切相關(guān)[35]。解剖母雞后，發(fā)現(xiàn)蛋雞卵巢上的大卵泡數(shù)量明顯高于高產(chǎn)蛋雞組。由于ESR 表達(dá)是在雌激素刺激下發(fā)生的，因此我們推測(cè)排卵紊亂會(huì)導(dǎo)致大卵泡的持續(xù)存在，ESR1的不同亞型可能通過介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)垂體功能，進(jìn)而影響母雞的產(chǎn)蛋性能。

4 結(jié)論

AS 事件類型在莊河大骨雞下丘腦和垂體中分布與大多數(shù)哺乳動(dòng)物相同；低產(chǎn)蛋雞下丘腦和垂體中的DSGs 主要定位于鈣信號(hào)途徑和MAPK 途徑，參與促性腺激素的合成和分泌，但機(jī)制尚不清楚；垂體中的ESR1存在于不同的AS事件類型中。綜上，AS事件對(duì)母雞的產(chǎn)蛋數(shù)量起著至關(guān)重要的作用，為蛋雞產(chǎn)蛋性能的研究奠定一定的基礎(chǔ)。