時瑞碟 高鑫 王寶堃 高代麗 靳夢 張秀軍

摘要：基于六水合氯化鋁誘導的斑馬魚阿爾茨海默病模型，探究木蝴蝶苷A的抗阿爾茨海默病活性及作用機制。將受精后3 d的野生型AB品系斑馬魚隨機分為陰性對照組，80 μmol/L六水合氯化鋁模型對照組，80 μmol/L六水合氯化鋁與6 μmol/L多奈哌齊陽性對照組，80 μmol/L六水合氯化鋁與不同濃度（5、10、20 μmol/L）木蝴蝶苷A受試物組。斑馬魚受精后6 d，利用明暗交替行為學實驗觀察不同處理組斑馬魚行為差異并分析其變化；通過硫黃素S染色測定各組斑馬魚頭部Aβ斑塊沉積數(shù)；采用酶活測定試劑盒檢測各組斑馬魚乙酰膽堿酯酶活性；以實時熒光定量PCR檢測自噬相關基因（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）的表達變化；借助分子對接技術驗證木蝴蝶苷A與自噬相關蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）結合的可靠性。結果表明，木蝴蝶苷A緩解了六水合氯化鋁造成的斑馬魚運動障礙，降低了Aβ斑塊沉積數(shù)和乙酰膽堿酯酶活性水平，使自噬相關基因的異常表達趨于正常。該研究初步揭示了木蝴蝶苷A能夠緩解六水合氯化鋁誘導的斑馬魚運動障礙，其機制可能與激活細胞自噬有關，這為木蝴蝶苷A的臨床應用及其治療阿爾茨海默病的相關研究提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：阿爾茨海默病；六水合氯化鋁；自噬；斑馬魚；木蝴蝶苷A

中圖分類號：R965?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2023）06-0028-10

Anti-Alzheimer′s disease activity of oroxin A and its

mechanism of action based on zebrafish model

SHI Ruidie1，2， GAO Xin2， WANG Baokun2， GAO Daili2， JIN Meng2*， ZHANG Xiujun1*

（1. College of Psychology and Mental Health， North China University of Science and Technology， Tangshan 063200， China;

2. Key Laboratory of Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences， Biology Institute，

Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250103， China）

Abstract∶To investigate the ameliorative effects of oroxin A on Alzheimer′s disease （AD） and the underlying mechanism of action， a zebrafish AD model induced by aluminum chloride hexahydrate （AlCl3） was used. Wild-type zebrafish AB larvae at 3? dpf（days post fertilization） were divided into different groups， including negative control group， AlCl3 （80 μmol/L） model control group， AlCl3 （80 μmol/L） combined with donepezil （6 μmol/L） positive control group， and AlCl3 （80 μmol/L） combined with different concentrations （5， 10， and 20 μmol/L） of oroxin A test group. At 6 dpf， zebrafish behavior was monitored and analyzed using zebrafish light-dark locomotion test. Aβ deposition in zebrafish heads was assayed by thioflavin S staining. Acetylcholine assay kit tested acetylcholinesterase （AchE） activity. In addition， the expression of autophagy-related genes（beclin1、ulk1b、ulk2 and atg7） was tested by real-time quantitative polymerase chain reaction. Molecular docking was performed to validate the interaction between oroxin A and autophagy-related protein（beclin1、ulk1b、ulk2 and atg7）. The results indicated that oroxin A significantly relieved the dyskinesia and inhibited Aβ deposition and AchE activity of zebrafish induced by AlCl3. The expression of autophagy-related genes tended to be normal after oroxin A treatment. This study preliminarily revealed that oroxin A alleviated AlCl3-induced AD symptoms in zebrafish， where the underlying mechanism of action is possibly associated with activated autophagy， providing a theoretical basis for the clinical application of oroxin A and its related research in treating AD.

Key words∶Alzheimer′s disease; aluminum chloride hexahydrate; autophagy; zebrafish; oroxin A

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征是細胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊的沉積和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結的形成［1］。AD的發(fā)病機制復雜多樣，目前廣為認可的發(fā)病機制假說包括淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、tau蛋白異常磷酸化假說、膽堿能假說等［2］。目前針對AD的治療，主要是膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、加蘭他敏和卡巴拉汀）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（美金剛）［2］。這些藥物雖然能在一定程度上改善AD患者的行為和認知障礙，但并不能治愈或者預防該疾病。

自噬是細胞自我降解的過程，在去除錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)、清除受損細胞器等方面起著重要作用［3］。研究表明自噬的增強能夠降低人神經(jīng)元細胞中tau蛋白的過度磷酸化，緩解AD小鼠模型的記憶障礙［4］。杜仲雄花通過調(diào)節(jié)自噬基因異常表達來改善AD樣癥狀［5］。自噬與AD病理之間存在復雜的聯(lián)系，這表明自噬相關蛋白（beclin1、ulk2、ulk1b和atg7）可能是AD治療的重要靶點。

中藥木蝴蝶來源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟種子，具有清肺利咽、疏肝和胃等作用［6］。木蝴蝶苷A是木蝴蝶提取而得到的一種黃酮類物質(zhì)。研究表明，木蝴蝶苷A具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等特性，但目前還缺乏關于木蝴蝶苷A對神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用的研究［7-8］。斑馬魚是人類疾病和藥物開發(fā)的理想模型系統(tǒng)，常用于研究AD、帕金森病、精神分裂癥等神經(jīng)退行性疾病。六水合氯化鋁誘導的斑馬魚AD模型，是一種比較成熟的能夠反映AD主要特征性病理變化的體內(nèi)動物模型［9］。

本研究中，我們使用六水合氯化鋁誘導的斑馬魚AD模型，通過觀察并記錄斑馬魚的行為表現(xiàn)，檢測乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）的活性和Aβ斑塊沉積以及測定自噬相關基因的表達變化，從而分析木蝴蝶苷A對六水合氯化鋁誘導的斑馬魚AD癥狀是否具有緩解作用，并對其機制進行探究。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Z-A-S5斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣公司）；ZebraLab 3.3 Zebrabox 斑馬魚行為分析儀（法國Viewpoint 公司）；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱（東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）；13720實時熒光定量 PCR 儀器（瑞士Roche 診斷產(chǎn)品有限公司）；C1000 Touch梯度 PCR 儀（美國Bio-Rad公司）；FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；NanoDrop One超微量分光光度計（上?；蛏锛夹g國際貿(mào)易有限公司 ）；Spectra MR全波長酶標儀（美國Dynex 公司）。

1.2 實驗材料

木蝴蝶苷A（批號DM0028，純度≥96％，成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司）；六水合氯化鋁（批號A112511，純度99.99％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸多奈哌齊（批號D129948，純度≥98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； RNA 快速提取試劑盒（批號312423AX，北京艾德萊生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號E047-01B，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號052319190910， 上海碧云天生物技術有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（批號E096-01B，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；硫磺素S（批號MKCH4108，美國Sigma公司）；AchE活性檢測試劑盒（批號20200829，南京建成生物工程研究所）；N-苯基硫脲（批號P7629，美國Sigma公司）；0.3% Triton X-100（批號3466850，上海生工生物工程有限公司）；檸檬酸鈉抗原修復液（1×）（批號20190322，北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛（批號71041800，北京蘭杰柯科技有限公司）。

1.3 斑馬魚品系

野生型AB品系斑馬魚由山東省科學院生物研究所提供。將成年斑馬魚飼養(yǎng)在恒溫 28 ℃的養(yǎng)殖系統(tǒng)中，每天同一時間段給與14 h/10 h的光照循環(huán)，定點喂食兩次豐年蝦。將成年斑馬魚按照2：2的雌雄比例于前一天分別放置于魚缸中，用擋板將雌雄魚分開，并于第二天早上8：30抽取擋板，大概2 h后，將魚缸中的魚卵轉(zhuǎn)移到玻璃缸中，并加入5 g/L的亞甲基藍，之后放置在恒溫28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 實驗分組及處理

將受精后3 d的斑馬魚隨機轉(zhuǎn)移到6孔細胞培養(yǎng)板中，之后將斑馬魚隨機分為6個組：陰性對照組，六水合氯化鋁（80 μmol/L）模型對照組，六水合氯化鋁和不同濃度 （5、10和20 μmol/L） 木蝴蝶苷A受試物共處理組，六水合氯化鋁和多奈哌齊（6 μmol/L）陽性對照組。每天給藥一次，之后放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在斑馬魚受精后6 d進行明暗交替行為學觀察，AchE活性檢測，斑馬魚頭部Aβ斑塊數(shù)檢測和實時熒光定量 PCR分析自噬相關基因的表達。

2.2 明暗交替行為學觀察

將受精后6 d的斑馬魚（n=32）分別吸入到48孔板中，每孔加入1 mL的養(yǎng)魚水。將斑馬魚置于行為學觀測箱中在100%光照環(huán)境中適應10 min，之后進行60 min包括3組明暗交替循環(huán)（10 min黑暗，10 min光照）的行為學測試。實驗結束后利用Zebrabox 斑馬魚行為分析儀對斑馬魚的游動軌跡、游動速度和游動距離進行分析。

2.3 AchE活性檢測

將藥物處理結束的受精后6 d的斑馬魚（n=100）收集在1.5 mL的離心管中，每管加入200 μL的生理鹽水，之后用破碎機進行破碎勻漿。以11 000 r/min的轉(zhuǎn)速在4 ℃離心10 min后取上清液，之后按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作，用全波長酶標儀測定562 nm處的光密度值（optical density，OD）并計算樣品的蛋白濃度。之后根據(jù)AchE活性檢測試劑盒的說明書，稍作修改后進行實驗。具體操作為分別吸取雙蒸水、底物緩沖液和顯色應用液各5、50、50 μL配置空白管所需溶液；分別吸取標準液、底物緩沖液和顯色應用液各5、50、50 μL配置標準管所需溶液；分別吸取各組斑馬魚樣品蛋白上清液、底物緩沖液和顯色應用液各5、50、50 μL配置不同處理組的測定溶液。之后將各組配置好的溶液振蕩混勻后加入到96孔板中，每個處理組5次重復。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min后，每孔加入10 μL的透明劑和3 μL的抑制劑。在室溫下放置15 min后，使用酶標儀在412 nm波長和0.5 cm光徑處測定OD值，之后根據(jù)各樣品組的OD值和濃度，計算得出各處理組的AchE活力。

2.4 斑馬魚頭部Aβ斑塊數(shù)檢測

將受精后的斑馬魚卵收到養(yǎng)魚缸之后，加入1 mg/mL的N-苯基硫脲以抑制黑色素的形成。每天同一時間換一次液，其他藥物處理方法同2.1節(jié)所述。將4%多聚甲醛處理后的受精后6 d的斑馬魚放入4 ℃冰箱中過夜。第二天使用磷酸緩沖鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將斑馬魚清洗3次，每次10 min。將清洗完的斑馬魚使用1％的瓊脂凝膠固定后，進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤。之后將處理完的蠟塊，以7 μm間距進行橫切切片。脫蠟之后在室溫下用PBS洗滌切片5 min，重復3次。吸干水分，用免疫組化筆將載玻片上的組織框起來。然后按照3 μL：1 mL比例配制0.3 %TritonX-100和檸檬酸鈉抗原修復液（1×），混勻后加到框起來的組織上，在4 ℃冰箱孵育20 min后，用PBS清洗2次，每次5 min。用濾紙將載玻片上的PBS完全吸干后，在免疫組化筆圈住的部分加入0.3%硫黃素S，并放入4 ℃冰箱避光過夜。第二天用PBS在避光環(huán)境下洗滌切片10 min，重復3次，之后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察斑馬魚頭部Aβ斑塊沉積狀況并進行拍照。使用Image-Pro Plus 5.1分析圖像，并計數(shù)斑馬魚頭部Aβ斑塊沉積數(shù)。

2.5 實時熒光定量 PCR分析自噬相關基因的表達

將藥物處理結束的受精后6 d的斑馬魚（n=30）收集在1.5 mL的離心管中，每管加入500 μL的裂解液，之后用破碎機進行破碎勻漿。按照RNA快速提取試劑盒的說明書進行RNA提取后，利用超微量分光光度計檢測不同組別斑馬魚的RNA濃度。之后立即使用C1000 Touch梯度PCR儀將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行稀釋，之后根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書，加入相應的引物。用實時熒光定量PCR儀對基因進行擴增，擴增結束后，用Cq值計算各組樣品基因的差異表達，選用rpl13a為內(nèi)參，目的基因與內(nèi)參基因的Cq差值用ΔCq表示，ΔΔCq值為各樣品的ΔCq值與Ctl組ΔCq值平均數(shù)的差值，mRNA的相對表達量根據(jù)2-ΔΔCq相對定量法計算，每組設置3個重復組。引物序列見表1。

2.6 分子對接的準備過程

木蝴蝶苷A的3D結構從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載，自噬相關蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）的3D結構從Protein Data Bank（https： //www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載。使用薛定諤分子對接軟件對自噬相關蛋白進行加氫、去水等處理，之后將自噬相關蛋白和木蝴蝶苷A進行對接，以對接分數(shù)作為分子對接的結果，最后借助Pymol進行可視化分析。

2.7 統(tǒng)計分析

使用Graph Pad Prism 7.0通過單向方差分析和雙向方差分析進行統(tǒng)計分析，結果用x±s表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 木蝴蝶苷A具有緩解六水合氯化鋁誘導的斑馬魚運動障礙作用

如圖1（a）和1（b）所示，與空白對照組的斑馬魚相比，六水合氯化鋁模型對照組中斑馬魚的游動總距離明顯變短（P＜0.001），游動速度減緩。與六水合氯化鋁模型對照組相比，不同濃度的木蝴蝶苷A受試物（5、10、20 μmol/L）與六水合氯化鋁共同處理時，斑馬魚的游動總距離（P=0.009，P=0.002，P＜0.001）和速度均顯著增加。與六水合氯化鋁模型對照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽性對照組的速度和總距離有所增加，其結果（P=0.23）不具有統(tǒng)計學意義。如圖1（a）所示，在黑暗環(huán)境下，不同藥物處理組斑馬魚的游動距離變化與總游動距離變化具有一致性。以上結果表明，木蝴蝶苷A對六水合氯化鋁誘導的斑馬魚運動障礙具有一定的緩解作用。

3.2 木蝴蝶苷A對斑馬魚頭部Aβ斑塊沉積的抑制作用

如圖2（a）和2（b）所示，與空白對照組相比，六水合氯化鋁模型對照組的斑馬魚大腦中Aβ斑塊的數(shù)明顯增多（P＜0.001）。與六水合氯化鋁模型對照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽性對照組中Aβ斑塊沉積數(shù)減少（P=0.06），六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組的Aβ斑塊沉積數(shù)顯著降低（P=0.03，P=0.002）。

3.3 木蝴蝶苷A對AchE活性的抑制作用

抑制AchE活性，可以提高腦中的乙酰膽堿水平，從而改善AD患者的學習記憶障礙［10］。在本實驗中，研究探討了木蝴蝶苷A對六水合氯化鋁處理的斑馬魚AchE活性的影響。如圖3所示，與空白對照組相比，六水合氯化鋁模型對照組斑馬魚的AchE活性顯著增加（P＜0.001）。與六水合氯化鋁模型對照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽性對照組中斑馬魚的AchE活性顯著降低（P=0.008），在六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組中斑馬魚的AchE活性也顯著降低（P＜0.001），且劑量與效應呈正相關。

3.4 木蝴蝶苷A對自噬相關基因表達的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，六水合氯化鋁模型對照組中beclin1、ulk1b、ulk2、和atg7的表達明顯下調(diào)（P=0.02，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。如圖4（a）所示，與六水合氯化鋁模型對照組相比，六水合氯化鋁與5、20 μmol/L木蝴蝶苷A受試物組beclin1表達明顯上調(diào)（P=0.001，P＜0.001）；如圖4（b）所示，六水合氯化鋁與不同濃度木蝴蝶苷A（5、10、20 μmol/L）受試物組中ulk1b的表達明顯上調(diào)（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）；如圖4（c）所示，六水合氯化鋁與5、20 μmol/L木蝴蝶苷A受試物組ulk2表達明顯上調(diào)（P＜0.001，P＜0.001）；如圖4（d）所示，六水合氯化鋁與不同濃度木蝴蝶苷A（5、10、20 μmol/L）受試物atg7的表達也明顯上調(diào)（P=0.01，P＜0.001，P＜0.001）。

3.5 分子對接結果

通過2.6方法對木蝴蝶苷A與自噬相關蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7） 進行分子對接，得出圖5，即belclin1（PDB ID：4ZW1）與木蝴蝶苷A的對接、ulk1b（PDB ID：6YID）與木蝴蝶苷A的對接、ulk2（PDB ID：6QAT）與木蝴蝶苷A的對接、atg7（PDB ID：4PH4）與木蝴蝶苷A的對接。木蝴蝶苷A與belclin1、ulk1b、ulk2和atg7的對接分數(shù)分別為-6.707、-7.708、-7.888、-7.249，這說明木蝴蝶苷A對自噬相關蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。

4 討論與結論

AD是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，可導致神經(jīng)元喪失、腦萎縮和死亡。研究表明，木蝴蝶能夠改善AD小鼠的學習記憶能力，但具體哪些化學成分起作用還未見報道，所以我們利用六水合氯化鋁誘導的斑馬魚AD模型去探討木蝴蝶苷A的抗AD活性。正常斑馬魚在面對突然的刺激時，會表現(xiàn)出快速的保護反應。研究表明斑馬魚幼魚在受精后4 d后暴露于明暗交替的刺激時，在光亮中運動活動會突然增加［11］。斑馬魚明暗交替行為學測試常被用來識別測定藥物的神經(jīng)保護活性，通過評估斑馬魚的游動軌跡、游動距離和速度，可以了解其神經(jīng)行為效應［10］。在本研究中，明暗交替行為學測試表明，與空白對照組相比六水合氯化鋁模型組的斑馬魚游動速度減慢，游動距離變短，表明斑馬魚的認知能力受損，反應遲緩，不能對外界刺激做出及時的反應。而經(jīng)過木蝴蝶苷A的處理，這種表現(xiàn)有所改變，這提示木蝴蝶苷A對六水合氯化鋁誘導的斑馬魚運動障礙具有緩解作用。AD的特征在于海馬和新皮層中AchE活性升高，使AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平降低，影響神經(jīng)信號的傳遞，從而損傷學習記憶能力［12］。抑制AchE活性，可以提高腦中的乙酰膽堿水平，改善AD患者的學習記憶障礙［13］。有研究表明暴露于六水合氯化鋁的斑馬魚在50～250 μmol/L的濃度范圍內(nèi)顯示出AchE活性增加，運動活性缺乏［14］。我們的研究結果表明，六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組的斑馬魚AchE的活性水平降低，這說明木蝴蝶苷A能夠抑制AchE活性，減少乙酰膽堿的水解。Aβ的細胞毒性已在眾多體內(nèi)和體外研究中得到證實，腦實質(zhì)中Aβ斑塊的沉積在AD發(fā)病機制中起著核心作用［15］。Aβ沉積會引發(fā)一系列相關反應，導致tau蛋白的錯誤折疊和組裝，進而將病變擴散到整個神經(jīng)回路和皮層，最終損害神經(jīng)系統(tǒng)，導致認知能力下降［16］。我們的研究表明，木蝴蝶苷A明顯降低了AD模型中斑馬魚頭部的Aβ斑塊計數(shù)。以上表明木蝴蝶苷A能夠緩解六水合氯化鋁誘導的AD樣癥狀。為了進一步探究木蝴蝶苷A是如何發(fā)揮抗AD活性的，我們進行了機制探究。

自噬在Aβ的生成和代謝中起重要作用，與AD發(fā)病進展密切相關［17］。beclin1是酵母自噬蛋白atg6和apg6的同系物，被認為是自噬體形成的標記蛋白。研究表明抑制beclin1的表達會增加AD中Aβ的聚集，從而加速神經(jīng)病變［18］。還有研究表明AD患者神經(jīng)元beclin1表達明顯下降［19］。在本研究中，六水合氯化鋁模型組，beclin1的基因表達量明顯下調(diào)，六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組beclin1的表達量上調(diào)，說明木蝴蝶苷A能夠促進Aβ在細胞內(nèi)部降解。ulk1b具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，ulk2和ulk1b在自噬的起始階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［20］。六水合氯化鋁模型組ulk2和ulk1b的表達明顯下調(diào)，而六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組ulk2和ulk1b的表達明顯上調(diào)，說明木蝴蝶苷A能夠激活自噬的表達。atg7是與自噬相關的細胞降解和再循環(huán)的必需蛋白質(zhì)，主要參與自噬小體的形成，是調(diào)節(jié)自噬偶聯(lián)系統(tǒng)的關鍵基因［21］。研究發(fā)現(xiàn)AD小鼠模型大腦皮層和海馬體中atg7蛋白水平降低［22］。六水合氯化鋁模型組，atg7的表達明顯降低，抑制了自噬的過程，而六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組atg7的表達明顯上調(diào)，說明atg7激活了自噬，可能促進自噬性溶酶體的形成，恢復細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)?；诜肿訉映醪侥M木蝴蝶苷A與自噬相關蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）之間的分子作用機制，對接分數(shù)的大小直接反應預測結果的可靠性，對接分數(shù)越小表示結合活性越高。其對接分數(shù)均為負數(shù)，表明木蝴蝶苷A與自噬相關蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）具有良好的結合能力。這進一步驗證了木蝴蝶苷A能對自噬相關蛋白發(fā)揮調(diào)控作用，但后續(xù)仍需進一步的生物實驗驗證。

本研究通過對六水合氯化鋁誘導的斑馬魚行為的觀察、AchE活性的檢測以及Aβ斑塊的沉積情況，預測了木蝴蝶苷A對AD的潛在治療作用。實時熒光定量PCR以及分子對接的結果提示木蝴蝶苷A可能通過激活自噬， 從而發(fā)揮抗AD活性。本研究為治療AD藥物研發(fā)拓展了新思路，但還需要采取哺乳動物實驗及臨床試驗等方法做進一步的驗證。

參考文獻：

［1］TATULIAN S A. Challenges and hopes for Alzheimer′s disease［J］. Drug Discovery Today， 2022， 27（4）： 1027-1043. DOI： 10.1016/j.drudis.2022.01.016.

［2］TAM K， JU Y J. Pathological mechanisms and therapeutic strategies for Alzheimer′s disease［J］. Neural Regeneration Research， 2022， 17（3）： 543. DOI： 10.4103/1673-5374.320970.

［3］SRIRAM N， SAH M K. Regulatory insights into progression of cancer and Alzheimer′s disorder from autophagy perspective［J］. Molecular Biology Reports， 2021， 48（12）： 8227-8232. DOI： 10.1007/s11033-021-06838-4.

［4］FANG E F， HOU Y J， PALIKARAS K， et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer′s disease［J］. Nature Neuroscience， 2019， 22（3）： 401-412. DOI： 10.1038/s41593-018-0332-9.

［5］SUN C， ZHANG SS， BA S K， et al. Eucommia ulmoides olive male flower extracts Ameliorate alzheimer′s disease-like pathology in zebrafish via regulating autophagy， acetylcholinesterase， and the dopamine transporter［J］. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2022， 15： 901953. DOI： 10.3389/fnmol.2022.901953.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020年版二部 ［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020.

［7］CHENG X D， HUANG T T， WANG C H， et al.Natural compound library screening identifies oroxin A for the treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury［J］. Frontiers in Pharmacology， 2022， 13： 894899. DOI： 10.3389/fphar.2022.894899.

［8］魯冰冰. 木蝴蝶苷A對食管鱗癌增殖的抑制作用及其機制的研究［D］. 鄭州： 鄭州大學， 2020.

［9］任擎宇， 靳夢， 商學良， 等. 基于網(wǎng)絡藥理學和斑馬魚模型的金盞菊緩解阿爾茨海默病癥狀及作用機制［J］. 中國藥理學通報， 2022， 38（3）： 429-436. DOI： 10.12360/CPB202108075.

［10］BASNET R M， ZIZIOLI D， TAWEEDET S， et al. Zebrafish larvae as a behavioral model in neuropharmacology［J］. Biomedicines， 2019， 7（1）： 23. DOI： 10.3390/biomedicines7010023.

［11］SHENOY A， BANERJEE M， UPADHYA A， et al. The brilliance of the zebrafish model： perception on behavior and alzheimer′s disease［J］. Frontiers in Behavioral Neuroscience， 2022， 16： 861155. DOI： 10.3389/fnbeh.2022.861155.

［12］PATIL D N， PATIL S A， SISTLA S， et al. Comparative biophysical characterization： A screening tool for acetylcholinesterase inhibitors［J］.PLoS One， 2019， 14（5）： e0215291. DOI： 10.1371/journal.pone.0215291.

［13］SAXENA M， DUBEY R. Target enzyme in Alzheimer′s disease： acetylcholinesterase inhibitors［J］. Current Topics in Medicinal Chemistry， 2019， 19（4）： 264-275. DOI： 10.2174/1568026619666190128125912.

［14］SENGER M R， SEIBT K J， GHISLENI G C， et al. Aluminum exposure alters behavioral parameters and increases acetylcholinesterase activity in zebrafish （Danio rerio） brain［J］. Cell Biology and Toxicology， 2011， 27（3）： 199-205. DOI： 10.1007/s10565-011-9181-y.

［15］WALSH D M， SELKOE D J. Amyloid β-protein and beyond： the path forward in Alzheimer′s disease［J］. Current Opinion in Neurobiology， 2020， 61： 116-124. DOI： 10.1016/j.conb.2020.02.003.

［16］BUSCHE M A， WEGMANN S， DUJARDIN S， et al. Tau impairs neural circuits， dominating amyloid-β effects， in Alzheimer models in vivo［J］. Nature Neuroscience， 2019， 22（1）： 57-64. DOI： 10.1038/s41593-018-0289-8.

［17］DENG Z Q， DONG Y， ZHOU X T， et al. Pharmacological modulation of autophagy for Alzheimer′s disease therapy： Opportunities and obstacles［J］. Acta Pharmaceutica Sinica B， 2022， 12（4）： 1688-1706. DOI： 10.1016/j.apsb.2021.12.009.

［18］PICKFORD F， MASLIAH E， BRITSCHGI M， et al. The autophagy-related protein beclin1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid beta accumulation in mice［J］. The Journal of Clinical Investigation， 2008， 118（6）： 2190-2199. DOI： 10.1172/JCI33585.

［19］JAEGER P A， PICKFORD F， SUN C H， et al. Regulation of amyloid precursor protein processing by the beclin1 complex［J］. PLoS One， 2010， 5（6）： e11102. DOI： 10.1371/journal.pone.0011102.

［20］MCALPINE F， WILLIAMSON L E， TOOZE S A， et al. Regulation of nutrient-sensitive autophagy by uncoordinated 51-like kinases 1 and 2［J］. Autophagy， 2013， 9（3）： 361-373. DOI： 10.4161/auto.23066.

［21］任李梅， 楊松， 盧姝言， 等. 人參總皂苷在巨噬細胞RAW264.7中降低脂多糖誘導的炎癥和氧化應激［J］. 中國醫(yī)院藥學雜志， 2022， 42（9）： 896-901. DOI： 10.13286/j.1001-5213.2022.09.04.

［22］CARVALHO C， SANTOS M S， OLIVEIRA C R， et al.Alzheimer′s disease and type 2 diabetes-related alterations in brain mitochondria， autophagy and synaptic markers［J］. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular Basis of Disease， 2015， 1852（8）： 1665-1675. DOI： 10.1016/j.bbadis.2015.05.001.