詹傳紅，魏翠雯，關(guān) 東，李國(guó)威

（深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東深圳 518122）

13C-尿素呼氣試驗(yàn)（13C-UBT）是診斷幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、衛(wèi)生的非侵入性試驗(yàn)，受到臨床醫(yī)生和病人的普遍歡迎[1]。13C-UBT 的優(yōu)點(diǎn)是它沒(méi)有放射性[2]。目前13C-UBT 在臨床上用于檢測(cè)胃幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter Pylori，HP）感染，在國(guó)際上已被公認(rèn)為胃部HP 感染診斷的最重要手段之一，并被譽(yù)為胃部HP 感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。13C-尿素是重要的13C 標(biāo)記基礎(chǔ)試劑之一，其最為廣泛的應(yīng)用是臨床診斷用13C-尿素呼氣試驗(yàn)（13C-UBT）[4-5]。因此需要建立一個(gè)準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定13C-尿素含量的方法。

經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道現(xiàn)有13C-尿素含量測(cè)定方法主要包括凱氏定氮法、顯色-紫外分光光度法和液相色譜法。凱氏定氮法專(zhuān)屬性不強(qiáng)[6]，顯色-紫外分光光度法存在重現(xiàn)性差、操作繁瑣及不適合批量分析等問(wèn)題[7]。隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展和先進(jìn)儀器設(shè)備的引入，目前應(yīng)用較多，較為靈敏、快速、準(zhǔn)確的方法為高效液相色譜法。美國(guó)藥典收載有13C-尿素原料藥含量測(cè)定的高效液相色譜法，但是該方法以及已有的分析方法不適用于本研究中13C-尿素呼氣試驗(yàn)用藥品的含量測(cè)定，因該藥品中添加了大量的輔料甘露醇、檸檬酸等物質(zhì)，已有檢測(cè)方法無(wú)法將13C-尿素與輔料分開(kāi)，且主成分13C-尿素保留時(shí)間短、基線噪聲大，難以對(duì)13C-尿素進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

賽默飛Vanquish core 高效液相色譜儀，DAD 二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Thermo）、XPR225DR 型電子分析天平（梅特勒）；PURELAB flex2純水儀（ELGA）。

1.2 試劑

13C-尿素標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)藥檢所，批號(hào)1 706701；純度99.8%）；縮二脲（阿拉丁，批號(hào)C2 011021；純度99.0%）；甘露醇（湖南九典制藥股份有限公司，批號(hào)TF84210301）；檸檬酸（成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司，批號(hào)20210101）；一種呼氣試驗(yàn)用藥品（國(guó)內(nèi)已上市藥品，批號(hào)180822）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK SCX UG80S5（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：超純水；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

（1）空白溶液（稀釋劑）：流動(dòng)相；

（2）對(duì)照品溶液：取13C-尿素對(duì)照品約50 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升約含13C-尿素0.5 mg）。

（3）供試品溶液：取供試品約2.0 g，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升約含13C-尿素0.5 mg）。

（4）縮二脲對(duì)照品貯備液：取縮二脲對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升約含縮二脲100 μg）。

（5）系統(tǒng)適用性溶液：取13C-尿素對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL 量瓶中，再精密量取縮二脲對(duì)照品貯備液0.1 mL 至同一量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

（6）空白輔料溶液：取根據(jù)樣品配方制備的不含13C-尿素的空白輔料，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性

精密吸取“2.2”項(xiàng)下各溶液按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，空白溶劑、空白輔料及樣品中的其他成分不干擾13C-尿素的測(cè)定，13C-尿素與已知雜質(zhì)縮二脲的分離度大于1.5，理論板數(shù)按13C-尿素峰計(jì)算大于5 000，該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)高效離子交換色譜圖

2.3.2 線性及范圍

取13C-尿素對(duì)照品約125 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL 量瓶中，加稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，制得13C-尿素對(duì)照品貯備液（5 mg/mL）。精密量取對(duì)照品貯備液置10 mL 量瓶中，加稀釋劑分別制成0.25 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45 mg/mL、0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL 的線性溶液。精密吸取上述各濃度的線性溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以各個(gè)線性溶液中13C-尿素的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得出線性回歸方程，報(bào)告線性曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果表明，13C-尿素的回歸方程為y=37.451x+0.9305，相關(guān)系數(shù)r為0.9996（≥0.999），即13C-尿素在濃度為0.25~0.60 mg/mL（相當(dāng)于測(cè)試濃度50%~120%），濃度與響應(yīng)值呈顯著線性關(guān)系。

2.3.3 重復(fù)性

空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液同“2.2溶液制備”的方法配制，供試品溶液平行配制6份，精密吸取各溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果表明，6份溶液含量為98.1%~100.4%，RSD 為2%，該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 準(zhǔn)確度

取根據(jù)樣品配方制備的不含13C-尿素的空白輔料，置100 mL 量瓶中，再分別精密加入40 mg、50 mg、60 mg 的13C-尿素對(duì)照品，分別制備得到80%、100%、120%的加標(biāo)供試品溶液，每個(gè)濃度均平行配制3份，精密吸取各溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

從表1 看出，9 份準(zhǔn)確度溶液中，13C-尿素的回收率為98.1%~100.9%，RSD 值為1%，該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液室溫放置分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)，考察對(duì)照品溶液、供試品溶液在室溫條件下放置的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液在室溫放置39.0 h 內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果與0 h 比較，13C-尿素峰面積的比值為99.6%~100.0%；供試品溶液在室溫放置29.4 h 內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得13C-尿素的含量與0 h 比較含量的變化值為0.2%~0.6%。表明對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在室溫放置39.0 h 內(nèi)和29.4 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 耐用性試驗(yàn)

分別于不同流速、不同柱溫、不同檢測(cè)波長(zhǎng)下對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行分析，考察系統(tǒng)適用性和供試品溶液中13C-尿素的含量是否符合要求。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同色譜條件下的含量測(cè)定結(jié)果

從表2看出，該方法對(duì)柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)的微小變動(dòng)耐用性良好。

3 方法開(kāi)發(fā)過(guò)程

3.1 色譜柱的選擇

本研究考察了不同類(lèi)型色譜柱的分離效果，首先采用普通反相色譜柱ZORBAX SB-C8進(jìn)行分離，結(jié)果顯示13C-尿素峰較難保留；之后采用親水模式的HILIC 色譜柱進(jìn)行分離，該色譜柱下13C-尿素峰峰形差且基線波動(dòng)較大；而采用氨基柱Shodex Asahipak NH2P-50 4E 進(jìn)行分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，該色譜條件下空白輔料對(duì)供試品溶液中13C-尿素的測(cè)定有干擾，專(zhuān)屬性無(wú)法滿足測(cè)試要求，同時(shí)基線噪聲較大。最終選擇磺酸基陽(yáng)離子交換色譜柱CAPCELL PAK SCX UG80S5為本研究中的色譜柱，該條件下基線平穩(wěn)、峰形對(duì)稱(chēng)且主峰與其他峰能夠有效分離。

3.2 流動(dòng)相的選擇

以CAPCELL PAK SCX UG80S5（4.6 mm×250 mm）為色譜柱，分別考察了乙腈-水（5 ∶95，V/V）、超純水、0.2 mol/L 磷酸氫二銨作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果見(jiàn)表3

表3 3種流動(dòng)相體系下13C-尿素的分離情況

從表3看出，3種流動(dòng)相系統(tǒng)均能對(duì)供試品溶液中13C-尿素進(jìn)行有效分離，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L 磷酸氫二銨體系下，供試品溶液中13C-尿素與相鄰峰的分離度最好，但考慮到0.2 mol/L 磷酸氫二銨濃度較大，會(huì)對(duì)色譜柱和色譜儀造成一定程度的損傷，因此，在能滿足相應(yīng)檢測(cè)需求時(shí)，優(yōu)選超純水作為本研究的流動(dòng)相。

4 結(jié)論

該方法中主成分13C-尿素保留較好，基線平穩(wěn)、背景噪聲小，同時(shí)峰形對(duì)稱(chēng)，與溶劑峰、輔料峰和已知雜質(zhì)的分離度良好，且方法所用流動(dòng)相為超純水，不含緩沖鹽，不會(huì)對(duì)色譜柱和儀器造成損傷。通過(guò)該色譜方法能夠?qū)?3C-尿素的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，從而控制13C-尿素呼氣試驗(yàn)用藥品的質(zhì)量。