楊慧娟,楊淑君,王艷,顏?zhàn)忧?/p>

臨床研究表明,即使采用各項(xiàng)輔助治療與根治性手術(shù)治療肌層浸潤型膀胱癌(T2～T4期),患者5年生存率仍低于50%[1-2]。研究表明,角蛋白7(KRT7)主要存在于上皮細(xì)胞,能夠參與細(xì)胞間連接的形成,在維持上皮細(xì)胞完整性中扮演著重要角色[3]。KRT7主要表達(dá)于已分化的尿路上皮細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞,可用于評估膀胱癌預(yù)后[4]。p53蛋白能夠參與基因組形成、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞程序化死亡、DNA修復(fù)合成等多種病理過程,其可用于評估胃癌等多種惡性腫瘤預(yù)后[5]。免疫組化法是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原,可精確定位所需要的細(xì)胞類型或組織區(qū)域,有助于研究腫瘤微環(huán)境中的病理特征[6]。已有報(bào)道指出,免疫組化法可用于檢測癌組織中基因蛋白表達(dá)情況,有助于分析蛋白表達(dá)情況與腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[7]。目前,國內(nèi)尚缺乏有關(guān)免疫組化法用于研究KRT7、p53蛋白與膀胱癌臨床病理及預(yù)后相關(guān)性的研究報(bào)道,基于此,現(xiàn)分析KRT7、p53蛋白與膀胱癌臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 分析2016年2月—2019年3月江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院病理科收治的膀胱癌患者105例的臨床資料,男78例,女27例,年齡36～79(56.72±8.25)歲。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(KY-20190815008-09),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn),且均為膀胱尿路上皮癌;②均接受膀胱癌根治術(shù)治療;③術(shù)前沒有采用任何輔助性治療;④臨床資料完整者;⑤免疫組化中KRT7蛋白與p53蛋白均強(qiáng)表達(dá)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他泌尿系統(tǒng)疾病;②合并其他類型惡性腫瘤者;③術(shù)前發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者;④伴有免疫缺陷性疾病;⑤重要臟器嚴(yán)重功能障礙。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 組織取材:患者均接受膀胱癌根治術(shù),確保術(shù)中所切取的組織包括癌旁組織(距離腫瘤組織>3 cm)與癌組織準(zhǔn)確并于病理科檢測。術(shù)后根據(jù)患者個(gè)人情況實(shí)施放療、化療等。

1.3.2 KRT7蛋白與p53蛋白檢測:癌旁組織與癌組織均經(jīng)包埋處理后,連續(xù)切取5片,蘇木精淺染,自來水沖洗,二甲苯脫蠟。分別用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇實(shí)施梯度洗脫,加入鼠抗人KRT7單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體(均購自上海圻明生物科技有限公司)。4℃條件下孵育過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗2～3次,加入羊抗鼠二抗(購自上海圻明生物科技有限公司),25℃條件下孵育24 h,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封固。顯微鏡觀察組織切片,評估KRT7蛋白和p53蛋白在組織中的表達(dá)情況。

結(jié)果判讀:KRT7蛋白、p53蛋白陽性染色為細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色。細(xì)胞染色強(qiáng)度按照無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分;按陽性細(xì)胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分、4分,染色指數(shù)(陽性細(xì)胞百分比評分×細(xì)胞染色強(qiáng)度)0分為KRT7蛋白、p53蛋白陰性,否則記為陽性。

1.3.3 隨訪及預(yù)后:隨訪3年,每3個(gè)月隨訪1次,以電話、微信等形式進(jìn)行隨訪,以患者死亡或隨訪時(shí)間截止(2022年3月)記為隨訪終點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 p53蛋白、KRT7蛋白表達(dá)比較 癌組織KRT7蛋白陽性率低于癌旁組織(P<0.01),癌組織p53蛋白陽性率高于癌旁組織(P<0.01),見表1、圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織KRT7、p53蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

表1 癌組織與癌旁組織KRT7蛋白、p53蛋白表達(dá)比較 [例(%)]

2.2 癌組織中KRT7蛋白、p53蛋白表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異 T2～T4期、低分化、腫瘤直徑≥3 cm患者癌組織中KRT7蛋白陽性率低于、Ta～T1期、中高分化、腫瘤直徑<3 cm患者(P<0.05)。T2～T4期、低分化、腫瘤直徑≥3 cm患者癌組織中p53蛋白陽性率高于Ta～T1期、中高分化、腫瘤直徑<3 cm患者(P<0.01),見表2。

表2 癌組織中KRT7蛋白、p53蛋白表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異 [例(%)]

2.3 膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)多因素Cox分析 以膀胱癌患者預(yù)后為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行Cox分析,結(jié)果顯示:臨床T2～T4期、分化程度低、腫瘤直徑≥3 cm、KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性為膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.01),見表3。

表3 膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)多因素Cox分析

2.4 KRT7蛋白、p53蛋白表達(dá)與膀胱癌患者存活率的關(guān)系分析 隨訪3年,105例膀胱癌患者失訪4例,剩余101例患者中死亡34例(33.66%);KRT7蛋白陽性失訪2例,死亡15例,存活率為77.27%(51/66);KRT7蛋白陰性失訪2例,死亡19例,存活率為45.71%(16/35),KRT7蛋白陽性患者存活率高于KRT7蛋白陰性患者(χ2=5.238,P=0.022),見圖2。p53蛋白陽性失訪2例,死亡22例,存活率為62.71%(37/59),p53蛋白陰性失訪2例,死亡12例,存活率為71.43%(30/42),p53蛋白陰性存活率高于p53蛋白陽性患者(χ2=5.115,P=0.024),見圖3。

圖2 膀胱癌組織KRT7蛋白表達(dá)與患者3年內(nèi)生存的關(guān)系

圖3 膀胱癌組織p53蛋白表達(dá)與患者3年內(nèi)生存的關(guān)系

3 討 論

近年來,膀胱癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢,且逐漸趨于年輕化[8]。目前,大部分膀胱癌患者初診為非肌層浸潤性膀胱癌(Ta～T1期),治療期間,癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與癌癥復(fù)發(fā)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。相關(guān)研究指出,膀胱癌初期病情隱匿,部分患者就診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,治療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者3年生存率低、預(yù)后較差的重要原因[10-11]。故尋找合適的預(yù)測因子預(yù)測膀胱癌患者預(yù)后,有助于臨床診治與改善預(yù)后。

本研究中,癌組織KRT7蛋白陽性率低于癌旁組織,癌組織p53蛋白陽性率高于癌旁組織,提示KRT7蛋白與p53蛋白在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮著一定作用,與既往研究報(bào)道類似[12]。本研究結(jié)果顯示膀胱癌患者癌組織中KRT7、p53蛋白表達(dá)與分化程度、腫瘤直徑、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。本研究中,T2～T4期、低分化、KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性為膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步證實(shí)了KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性與膀胱癌患者預(yù)后密切相關(guān),可能原因?yàn)镵RT7、p53蛋白通過調(diào)節(jié)機(jī)體染色體活性,進(jìn)而影響膀胱癌患者病情的發(fā)生與發(fā)展,且臨床需重點(diǎn)關(guān)注低分化、T2～T4期的膀胱癌患者,及時(shí)進(jìn)行治療與干預(yù),從而降低預(yù)后不良的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)研究指出[13],p53蛋白可分為野生型與突變型2種,前者可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖,后者可誘導(dǎo)異?；虻谋磉_(dá),從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。相關(guān)研究表明[14],p53蛋白在膀胱癌中高表達(dá),與臨床分期、病理分級等臨床病理特征密切相關(guān),在評估膀胱癌預(yù)后中具有重要價(jià)值,分析原因:p53蛋白在細(xì)胞中起著重要的調(diào)控作用,包括對DNA損傷的應(yīng)答和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等,在膀胱癌發(fā)展過程中,高表達(dá)的p53蛋白可能反映了細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的積累,并試圖通過引發(fā)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長。KRT7可調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等多種病理過程。腫瘤發(fā)生是正常染色體受到多種損傷的結(jié)果,包括DNA轉(zhuǎn)錄異常、原癌基因的過度激活、抑癌基因的失活等,因此,筆者推測KRT7可能參與了膀胱癌發(fā)生的調(diào)節(jié)。既往研究指出[15],KRT7隨著病理分級、腫瘤分期的增加而降低,提示KRT7低表達(dá)的膀胱癌患者轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究中,KRT7蛋白陽性患者生存曲線優(yōu)于KRT7蛋白陰性患者,p53蛋白陰性患者生存曲線優(yōu)于p53蛋白陽性患者,進(jìn)一步證實(shí)了KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)更高。既往研究表明[16],突變型p53陽性表達(dá)率≥30%的肌層浸潤性膀胱癌患者總生存時(shí)間更短,與本研究結(jié)果相符。

綜上所述,膀胱癌患者癌組織中KRT7、p53蛋白表達(dá)與分化程度、腫瘤直徑、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān),且KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)更高,但鑒于本研究納入樣本量及隨訪時(shí)間有限,研究結(jié)果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加隨訪時(shí)間來進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊慧娟、楊淑君:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改;王艷、顏?zhàn)忧?病例收集,數(shù)據(jù)整理