郭曉丹,馬振禹,王晨靜,韓天云,張飛燕

（1. 保定市第二醫(yī)院病理科，河北 保定 071000；2. 保定市第二醫(yī)院藥劑科，河北保定 071000）

肺癌是當(dāng)前難以治愈的惡性腫瘤，且85%以上的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌[1]。近年來，雖然靶向治療能提升非小細(xì)胞肺癌患者的生存率，但多數(shù)患者仍易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳[2]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，在人類多種腫瘤中具有重要作用[3-5]。DCST1-AS1 是一種lncRNA，參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，如DCST1-AS1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，該過程通過上調(diào)miR-29b 表達(dá)實(shí)現(xiàn)[6]。miR-29b 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究表明，miR-29b 能抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，因此可作為非小細(xì)胞肺癌的抑制劑[7]。但DCST1-AS1 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能尚未可知。本研究首先觀察非小細(xì)胞肺癌組織中DCST1-AS1 的表達(dá)及其表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系，并探究DCST1-AS1 對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年4月至2018年11月本院收治的65例非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織和癌旁組織（距離病灶5 cm），其中男39 例，女26 例，平均年齡（58.26±5.47）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；術(shù)前未行放療或化療等；未患其他惡性腫瘤。組織分化程度低分化31例，中分化20例，高分化14例；TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期9 例；39 例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，26 例未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；腺癌42 例，鱗狀細(xì)胞癌18 例，大細(xì)胞癌5例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（2016008），患者及其家屬同意參與本研究。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H1650、HCC827（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；杭州四季青生物工程材料有限公司）；DCST1-AS1 小干擾RNA（si-DCST1-AS1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-29b inhibitor（anti-miR-29b）、miR-29b inhibitor 陰性對照（anti-NC）和PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、CCK-8 試劑盒和LipofectamineTM2000 試劑盒（北京索萊寶公司）；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H1650、HCC827 接種在RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%FBS）中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 檢測DCST1-AS1、miR-29b表達(dá)

提取組織和細(xì)胞中的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：DCST1-AS1 上游5'-CCAACCAGCCAGCATTCATT-3'，下游5'-CCACCTCATCCCCTACTCAC-3'；GAPDH 上游5'-GT CCAAGTCCTGAGAGGCC-3'，下游5'-CGCGTGTCCGA AACCTCGC-3'；miR-29b 上游5'-TAGCACCATTTGAA ATCAGTGTT-3'，下游5'-TGGTGTCGTGGAGAGTCG-3'；U6 上游5'-CGCAAGGATGACACGCAATTC-3'，下游5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。 使用2-ΔΔCt法計(jì)算DCST1-AS1、miR-29b 的表達(dá)水平。U6 作為miR-29b的內(nèi)參對照，GAPDH作為DCST1-AS1的內(nèi)參對照。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將A549 細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10% FBS）中培養(yǎng)，以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至6 孔板中，并分為si-NC 組、si-DCST1-AS1 組、si-DCST1-AS1+anti-NC 組和si-DCST1-AS1+anti-miR-29b 組。采用LipofectamineTM2000 分別將si-NC、si-DCST1-AS1、anti-NC、anti-miR-29b 轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。設(shè)置對照組（正常培養(yǎng)，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染）。RT-qPCR 法檢測各組細(xì)胞中DCST1-AS1、miR-29b的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.6 CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

CCK-8 法：取各組A549 細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入CCK-8 試劑（10 μL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：取各組A549 細(xì)胞接種至6 孔板中，培養(yǎng)14 d 后，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中，0.5%結(jié)晶紫染色后，對細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移和侵襲能力

在遷移實(shí)驗(yàn)中，將各組A549細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸（密度為5×104/mL），將100 μL 細(xì)胞懸液加到Transwell 上室中，500 μL 培養(yǎng)基（含10% FBS）添加到Transwell下室。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定遷移到膜下表面的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后，在光鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，使用預(yù)涂有Matrigel 膠的Transwell上室，其余操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 Western blot檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達(dá)

RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，10% SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)樣品并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，與E-cadherin（1∶500）、Vimentin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，在37 ℃下用山羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，GAPDH為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2 組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)用于分析DCST1-AS1 與患者臨床特征的相關(guān)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCST1-AS1、miR-29b的表達(dá)情況

與癌旁組織比較，肺癌組織中DCST1-AS1 的表達(dá)升高（t=33.030，P＜0.05），miR-29b 的表達(dá)水平降低（t=28.699，P＜0.05），見圖1。與16HBE 細(xì)胞相比，A549、H1299、H1650 和HCC827 中DCST1-AS1 的表達(dá)水平均升高（P＜0.05），miR-29b 的表達(dá)水平均降低（P＜0.05），見表1。其中A549 細(xì)胞中DCST1-AS1 的表達(dá)水平最高，miR-29b的表達(dá)水平最低，因此選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 DCST1-AS1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)（±s）

*：與16HBE細(xì)胞相比，P＜0.05；#：與A549細(xì)胞相比，P＜0.05

細(xì)胞16HBE A549 H1299 H1650 HCC827 F P DCST1-AS1 1.02±0.08 3.16±0.25*2.40±0.21*#1.58±0.17*#1.79±0.20*#166.121＜0.001 miR-29b 1.00±0.09 0.33±0.05*0.45±0.06*#0.82±0.09*#0.64±0.07*#121.550＜0.001

圖1 RT-qPCR檢測DCST1-AS1、miR-29b的表達(dá)

2.2 DCST1-AS1的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

非小細(xì)胞肺癌組織中DCST1-AS1 的表達(dá)與患者TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型存在相關(guān)性（P＜0.05），見表2。

表2 DCST1-AS1表達(dá)水平與患者臨床特征的相關(guān)性

2.3 下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)對細(xì)胞中miR-29b 表達(dá)的影響

與對照組或si-NC 組比較，si-DCST1-AS1 組A549細(xì)胞中DCST1-AS1 表達(dá)水平降低（P＜0.05），miR-29b表達(dá)水平升高（P＜0.05）；而對照組和si-NC 組各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 下調(diào)DCST1-AS1 對細(xì)胞中miR-29b 表達(dá)的影響（±s）

*：與對照組相比，P＜0.05；#：與si-NC組相比，P＜0.05

組別對照組si-NC組si-DCST1-AS1組F P DCST1-AS1 1.06±0.04 1.04±0.05 0.33±0.03*#933.660＜0.001 miR-29b 1.01±0.08 1.03±0.09 2.82±0.15*#788.181＜0.001

2.4 下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與對照組或si-NC 組比較，si-DCST1-AS1 組A549細(xì)胞OD 值、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低（P＜0.05）；而對照組和si-NC 組各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表4。

表4 下調(diào)DCST1-AS1對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）

表4 下調(diào)DCST1-AS1對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）

*：與對照組相比，P＜0.05；#：與si-NC組相比，P＜0.05

組別對照組si-NC組si-DCST1-AS1組F P OD/450 nm 0.69±0.08 0.67±0.09 0.33±0.04*#68.646＜0.001克隆形成數(shù)96.22±7.16 95.33±9.41 44.89±5.18*#139.871＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)117.56±10.75 118.33±10.52 63.33±6.00*#137.326＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)94.22±8.87 95.11±8.25 45.44±4.98*#143.990＜0.001

圖2 下調(diào)DCST1-AS1 對細(xì)胞克隆形成能力、遷移和侵襲的影響

2.5 下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)對細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表達(dá)的影響

與對照組或si-NC 組比較，si-DCST1-AS1 組A549細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平升高（P＜0.05），Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；而對照組與si-NC組A549 細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表5。

表5 各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)比較（±s）

*：與對照組相比，P＜0.05；#：與si-NC組相比，P＜0.05

組別對照組si-NC組si-DCST1-AS1組F P E-cadherin 0.22±0.03 0.24±0.05 0.75±0.06*#348.043＜0.001 N-cadherin 0.66±0.07 0.63±0.06 0.21±0.04*#169.218＜0.001 Vimentin 0.87±0.09 0.85±0.07 0.24±0.04*#237.144＜0.001

圖3 Western blot 檢測E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin表達(dá)

2.6 敲低miR-29b 可減弱下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)對細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

與si-DCST1-AS1+anti-NC 組比較，si-DCST1-AS1+anti-miR-29b 組miR-29b、E-cadherin 表達(dá)水平降低（P＜0.05），細(xì)胞OD 值、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平增加/升高（P＜0.05），見表6、圖4。

表6 敲低miR-29b減弱下調(diào)DCST1-AS1表達(dá)對細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響（±s）

表6 敲低miR-29b減弱下調(diào)DCST1-AS1表達(dá)對細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響（±s）

組別si-DCST1-AS1+anti-NC組si-DCST1-AS1+anti-miR-29b組t P DCST1-AS1 0.99±0.08 1.02±0.11 0.662 0.518 miR-29b 1.00±0.10 0.41±0.06 15.178＜0.001 OD/450 nm 0.35±0.04 0.62±0.07 10.047＜0.001克隆形成數(shù)40.52±3.68 86.16±5.29 21.247＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)68.49±5.17 105.30±8.25 11.342＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)47.65±5.04 96.21±7.38 16.301＜0.001 E-cadherin 0.74±0.07 0.20±0.04 20.094＜0.001 N-cadherin 0.23±0.04 0.78±0.09 16.753＜0.001 Vimentin 0.25±0.05 0.80±0.09 16.026＜0.001

圖4 敲低miR-29b減弱下調(diào)DCST1-AS1表達(dá)對細(xì)胞克隆形成、遷移和侵襲的影響

3 討論

lncRNA 在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，如MCM3AP-AS1[8]、LINC00680[9]、LINC02159[10]。研究顯示，在胃癌組織和細(xì)胞中DCST1-AS1 呈高表達(dá)，下調(diào)DCST1-AS1 可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[11]。DCST1-AS1 在三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織病理學(xué)分級呈正相關(guān)[12]。在肝癌組織中，DCST1-AS1 的高表達(dá)與腫瘤大小和生存時(shí)間密切相關(guān)，敲低DCST1-AS1 可降低體外肝癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。以上研究表明DCST1-AS1可作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在本研究中，DCST1-AS1 在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型相關(guān)，提示DCST1-AS1 在非小細(xì)胞肺癌中可能發(fā)揮促癌作用。已知癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵因素[14]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)DCST1-AS1后，A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均降低，提示DCST1-AS1 可能是非小細(xì)胞肺癌治療的潛在分子靶標(biāo)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性得到間質(zhì)特性的一個(gè)過程，在此過程中，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin表達(dá)升高[15]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞間黏附力會降低，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[16]。研究顯示，lncRNA 可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲[17-18]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)后，A549 細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)升高，Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)降低，提示下調(diào)DCST1-AS1 可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而降低A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

miRNA 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的功能，已成為包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的腫瘤診斷和治療的特異性靶點(diǎn)[19]。研究表明，miR-29b 與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7,20]，且miR-29b是DCST1-AS1 的靶基因[6]。本研究結(jié)果顯示，miR-29b在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中均呈低表達(dá)，與DCST1-AS1 的表達(dá)趨勢相反，且下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)后，A549 細(xì)胞中miR-29b 的表達(dá)水平升高。因此，推測miR-29b可能介導(dǎo)DCST1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中的作用。為了驗(yàn)證此推測，本研究在下調(diào)DCST1-AS1 表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用miR-29b inhibitor 轉(zhuǎn)染來抑制miR-29b 表達(dá)，結(jié)果顯示，敲低miR-29b 表達(dá)可減弱下調(diào)DCST1-AS1 對A549 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。提示下調(diào)DCST1-AS1可能通過上調(diào)miR-29b表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌組織中DCST1-AS1 呈高表達(dá)，且與患者臨床特征相關(guān)，敲低DCST1-AS1 可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，其作用機(jī)制與上調(diào)miR-29b 表達(dá)有關(guān)。DCST1-AS1 可能是非小細(xì)胞肺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)，但DCST1-AS1 的表達(dá)水平是否與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后有關(guān)將在后續(xù)的研究中進(jìn)行分析。