陳 杰,李 琨,,張少杰,,李筱賀,高 尚,王海燕,李志軍,,馬 淵,趙丹陽(yáng),史 君,王 星,

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院數(shù)字醫(yī)學(xué)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

頸椎退行性變主要指頸椎的骨質(zhì)發(fā)生退行性改變，退行性改變常常伴隨年齡增長(zhǎng)，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的脫鈣及脊柱老化，發(fā)生神經(jīng)、血管損害等[1-3]。鉤椎關(guān)節(jié)，又稱Luschka 關(guān)節(jié)，結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是在C3～C7之間，后外側(cè)邊緣下位椎體向上方凸起形成的鉤突與上位椎體斜下方形成的坡狀吻合以及與周圍軟組織共同包裹形成的具有外翻形狀的類關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)[4-5]。頸椎特有的鉤椎關(guān)節(jié)是維持頸椎正常形態(tài)及脊柱正常生理功能的基礎(chǔ)，在頸椎病發(fā)生發(fā)展及頸椎手術(shù)方式的選擇中具有重要臨床意義。伴隨科學(xué)研究的深入，針對(duì)骨與關(guān)節(jié)的研究已逐漸由以形態(tài)學(xué)為主轉(zhuǎn)為形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)并重的模式，為此本研究從細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)骨、關(guān)節(jié)微環(huán)境的變化及生理功能穩(wěn)定[6-7]的角度出發(fā)，通過對(duì)比血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2）在頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變發(fā)生前后的表達(dá)變化情況，以分析其與頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變的相關(guān)性，以及頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變對(duì)其周圍血管環(huán)境變化的影響，為頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變的治療提供實(shí)驗(yàn)室研究證據(jù)及新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

選取1例正常成人尸體標(biāo)本，取雙側(cè)頸椎C3～C7節(jié)段共10 個(gè)鉤椎關(guān)節(jié)設(shè)為對(duì)照組，固定、包埋及提取RNA；選取1例有頸椎退行性變病史的成人尸體標(biāo)本，取雙側(cè)頸椎C3～C7節(jié)段共10 個(gè)鉤椎關(guān)節(jié)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，固定、包埋及提取RNA。

1.2 主要儀器試劑

硬組織切片機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司）、膜片機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司）、光固化機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司）、4%多聚甲醛（北京索萊寶有限公司）、梯度乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、7200樹脂（德國(guó)Technovit 公司）、砂紙（320 目、800 目、1 200 目、4 000 目；德國(guó)EXAKT 公司）。一抗VEGF（英國(guó)Abcam 公司）及VEGFR-2（英國(guó)Abcam 公司）為兔抗小鼠多克隆抗體，熒光二抗（美國(guó)Thermo 公司），DAPI( 北京索萊寶有限公司)。TransStart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)觀察

將2 組標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)梯度乙醇脫水后，浸入無(wú)水乙醇∶Technovit 7200樹脂（3：7）浸潤(rùn)2 d，再浸入無(wú)水乙醇∶Technovit 7200 樹脂（1：1）浸潤(rùn)2 d，之后入Technovit 7200 樹脂浸潤(rùn)7 d，最后換新的Technovit 7200 樹脂浸潤(rùn)3 d，經(jīng)光固化機(jī)包埋聚合，制作完成的組織塊經(jīng)硬組織切片機(jī)不脫鈣聯(lián)合切片，經(jīng)磨片機(jī)以320 目、800 目、1 200 目順序打磨成厚度為25 μm 的硬組織切片，最后使用4 000目砂紙完成切片拋光。硬組織切片經(jīng)下行梯度乙醇水化，PBS 沖洗3 次，每次5 min，之后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 沖洗3 次，每次5 min，滴加牛血清白蛋白室溫封閉30 min，甩去多余液體。加一抗VEGF（1：200）、VEGFR-2（1：200），4 ℃過夜。第2 天，恢復(fù)室溫1 h，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，DAB 顯色，適時(shí)PBS終止顯色，封片，拍照。

陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色即為陽(yáng)性反應(yīng)。每組取6張切片，于低倍鏡下選擇蛋白陽(yáng)性表達(dá)的“熱區(qū)”，用累積光密度（integrated optical density,IOD）值表示，取均值，即可全面反映蛋白表達(dá)量。

1.4 免疫熒光染色技術(shù)

制片、染色及一抗孵育步驟同免疫組織化學(xué)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)第2 天，恢復(fù)室溫1 h，滴加熒光二抗，室溫避光孵育60 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，DAPI 染色10 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，拍照。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。VEGF 上游引物為5'-GTAACGATGAAG CCCTGGAGT-3'，下游引物為5'-TGTTCTGTCTTTCTT TGGTCTGC-3'；VEGFR-2 上游引物為5'-ACTGTCAT CCTTACCA ATCCCA-3'，下游引物為5'-ATCTGGGGT GGGACATA CAC-3'。

利用TRIzol 法提取總RNA；根據(jù)RNA 濃度，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min, 85 ℃5 min，4 ℃ 1 h；實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃30 s；61 ℃ 30 min，72 ℃ 30 s（循環(huán)40 次）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，4 ℃ 1 h。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組VEGF 及VEGFR-2 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，且實(shí)驗(yàn)組VEGF、VEGFR-2 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色圖

2.2 免疫熒光染色結(jié)果

免疫熒光染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組VEGF 及VEGFR-2 的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組VEGF 及VEGFR-2 的mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

鉤椎關(guān)節(jié)作為重要的頸椎解剖學(xué)結(jié)構(gòu)[8]，是只存在于頸椎C3～C7節(jié)段的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)于頸部運(yùn)動(dòng)如旋轉(zhuǎn)、屈伸以及保持脊柱的4個(gè)生理性彎曲、多角度運(yùn)動(dòng)都發(fā)揮著非常重要的作用[9]。頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變一方面會(huì)因?yàn)閴浩燃股窠?jīng)、椎動(dòng)脈等結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致頸椎疾病，另一方面由于軟組織退變、滑膜炎癥等導(dǎo)致頸椎病理改變[10]。VEGF 作為血管生成的重要介質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，在軟骨細(xì)胞形成分化、成骨細(xì)胞增殖以及破骨細(xì)胞募集等過程中起重要作用[11]；同時(shí)也是炎癥、組織修復(fù)過程中血管形成的關(guān)鍵因子[12]。VEGFR-2 作為特殊的酪氨酸激酶受體家族成員，主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，與血管通透性增加和血管生成密切相關(guān)[13]。骨組織生長(zhǎng)代謝過程中以及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中均有VEGF及VEGFR-2的表達(dá)[14]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組VEGF、VEGFR-2 的蛋白和mRNA 表達(dá)均顯著較高，表明頸椎退行性變的發(fā)生啟動(dòng)了關(guān)節(jié)修復(fù)機(jī)制，觸發(fā)了關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)的物質(zhì)交換，促進(jìn)了新生血管形成，誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨分泌VEGF 及VEGFR-2，刺激破骨細(xì)胞形成以完成骨的重塑[15-16]。而正常頸椎鉤椎關(guān)節(jié)中無(wú)血管新生，關(guān)節(jié)軟骨中無(wú)血管存在[16]，只有在關(guān)節(jié)發(fā)生損害時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨及骨周圍組織才會(huì)加速骨的重塑，完成血管新生等一系列修復(fù)程序。據(jù)報(bào)道，健康成人關(guān)節(jié)內(nèi)無(wú)VEGF 及VEGFR-2 表達(dá)，但在輕度炎癥環(huán)境的刺激下，其表達(dá)量可顯著提升，有效逆轉(zhuǎn)退行性變的發(fā)展，成為關(guān)節(jié)自我調(diào)節(jié)、修復(fù)的重要表現(xiàn)[17]。

綜上所述，頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變的標(biāo)本中伴隨關(guān)節(jié)退行性變的發(fā)生發(fā)展，在類關(guān)節(jié)自我修復(fù)機(jī)制的觸發(fā)下，促進(jìn)了VEGF 及VEGFR-2 的表達(dá)。作為正反饋調(diào)節(jié)的特例，退行性變頸椎微環(huán)境的變化，啟動(dòng)了血管新生機(jī)制，進(jìn)而通過改善類關(guān)節(jié)周圍血供及血管重建，加速退行性變的自我修復(fù)，從而緩解與改善由生理或病理造成的頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變。因此，明確頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性改變與VEGF 及VEGFR-2 表達(dá)變化的規(guī)律，將為頸椎鉤椎關(guān)節(jié)退行性變的實(shí)驗(yàn)研究及臨床診治提供新思路。