沈忱悠，聶曉偉，衛(wèi)棟，楊旭生，江成，王偉，盛雅婷，李桂榮*，陳靜瑜*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院移植實驗室，江蘇無錫 214023；2深圳市人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，廣東深圳518020；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院移植中心，江蘇無錫 214023

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種威脅生命的肺部疾病[1]，其病死率超過多種腫瘤，發(fā)病群體主要為老年人[2]。IPF的危險因素主要包括年齡、吸煙及環(huán)境污染等[3]。在早期研究中，炎癥被認(rèn)為是IPF 的主要發(fā)病機(jī)制，因此，類固醇療法曾長期被用于IPF的治療。近期研究顯示，肺泡細(xì)胞的反復(fù)損傷與異常修復(fù)導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化沉積的理論，可更為合理地闡釋IPF 的發(fā)病機(jī)制[4]。抗纖維化藥物尼達(dá)尼布與吡非尼酮由于可延緩疾病進(jìn)程[5]，已獲批應(yīng)用于IPF的臨床治療。然而，除肺移植外，目前仍然缺乏治愈IPF 的有效措施[6-7]。鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控性細(xì)胞死亡[8-9]，與凋亡、壞死、自噬等形式的細(xì)胞死亡不同，其主要特征為鐵依賴的危害性脂質(zhì)活性氧積聚[10-11]。越來越多的證據(jù)顯示，鐵死亡與包括肺纖維化在內(nèi)的多種肺部疾病密切相關(guān)。例如，鐵代謝通路中的重要分子谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)表達(dá)缺陷型小鼠對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化更為易感；而在采用GPx4 過表達(dá)小鼠構(gòu)建的IPF 模型中，肺纖維化程度明顯減輕[12]。關(guān)于鐵死亡與IPF 的多數(shù)文獻(xiàn)報道，僅明確肺纖維化中存在鐵死亡這一現(xiàn)象，其相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。本研究采用博來霉素誘導(dǎo)建立肺纖維化小鼠模型，運用PCR Array技術(shù)篩選該模型中與鐵代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，探討鐵死亡在IPF發(fā)生中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 博來霉素購自日本化藥株式會社；4%多聚甲醛固定液、瓊脂糖、HE 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson 染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；普魯士藍(lán)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑購自美國Sigma 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 試劑盒和小鼠鐵死亡相關(guān)基因PCR Array plate試劑盒購自上海沃吉基因科技有限公司。PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。石蠟包埋機(jī)購自常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司；病理切片機(jī)(型號RM2235)購自德國Leica 公司；核酸凝膠電泳系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；超微量紫外分光光度計(型號NanoDrop 2000C)購自美國Thermo 公司；光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；實時熒光定量PCR儀(型號ABI7500)購自美國ABI公司。

1.2 實驗動物及分組 6～7 周齡的SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠12 只，體重20～25 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蘇)2016-0010]。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境下、通風(fēng)良好的南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院動物實驗中心小鼠房內(nèi)，可自由飲水、進(jìn)食；飼養(yǎng)環(huán)境溫度與濕度適宜，照明12 h、黑暗12 h 交替進(jìn)行。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，每組6 只。所有動物護(hù)理與實驗均符合南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理管理委員會規(guī)范，全部操作及處理均遵循美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護(hù)理和使用指南》。

1.3 肺纖維化小鼠模型的制備 參照文獻(xiàn)[13]的方法構(gòu)建博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉滿意后，左手揪住其頸部皮膚，使其仰臥于手心，小指夾住尾巴固定小鼠，使用微量移液器通過鼻腔給藥方式對模型組小鼠給予5 mg/kg的博來霉素，對照組給予等量生理鹽水。給藥3 周后，使用1%戊巴比妥(100 mg/kg)過量麻醉對兩組小鼠實施安樂死，收集其肺組織。根據(jù)解剖學(xué)特征將小鼠肺組織分為五葉，取其中一葉用于組織病理學(xué)染色，以評估肺纖維化模型構(gòu)建是否成功，剩余肺組織存放于-80℃超低溫冰箱，用于后續(xù)差異基因篩選分析等操作。

1.4 小鼠肺組織切片染色 將新鮮取下的小鼠肺組織浸沒于4%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。包好的蠟塊以5 μm厚度切片，后續(xù)用于HE 染色、Masson 染色及普魯士藍(lán)染色，具體操作步驟按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，HE染色切片胞質(zhì)被染成粉紅色或紅色，胞核呈藍(lán)色；Masson 染色切片胞質(zhì)與肌纖維被染成紅色，膠原纖維呈藍(lán)色；普魯士藍(lán)染色切片胞質(zhì)含鐵血黃素或三價鐵時被染成藍(lán)色，細(xì)胞核被染成紅色，其余呈淺紅色或不著色。

1.5 PCR Array 檢測小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)基因的mRNA 表達(dá) 每組隨機(jī)選取3 只小鼠，Trizol 法提取肺組織總RNA。使用RNA凝膠電泳評估其質(zhì)量，超微量紫外分光光度儀檢測其純度與濃度。對質(zhì)檢合格的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA 模板，將獲得的cDNA與qPCR預(yù)混液按說明書比例混合，以9 μl/孔的用量精準(zhǔn)加入Ferroptosis PCR Array Plate (mouse)反應(yīng)板各孔內(nèi)，根據(jù)反應(yīng)推薦程序?qū)悠愤M(jìn)行實時熒光定量PCR測定。

1.6 篩選和分析小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)的差異表達(dá)基因 對于PCR Array檢測獲得的數(shù)據(jù)，采用2-ΔCt法計算倍數(shù)變化值(fold change，F(xiàn)C)，以上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)變化值∣FC∣≥2且P<0.05作為差異基因的篩選閾值。應(yīng)用R 語言程序包clusterProfiler(4.2.2)對篩選獲得的差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路預(yù)測，其中GO分析涵蓋了生物學(xué)中的生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三個方面。

1.7 實時熒光定量PCR驗證小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因的表達(dá) 使用Trizol試劑提取對照組與模型組小鼠肺組織總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用定量PCR試劑盒對合成的cDNA模板進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.8 小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因在臨床樣本中的表達(dá)驗證 通過美國國立生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，在“GEO Profiles”檢索模式下分別以各差異基因名稱與“idiopathic pulmonary fibrosis”作為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)數(shù)據(jù)集，選取以正常對照與IPF 患者肺組織樣品為基礎(chǔ)的高通量芯片數(shù)據(jù)集，分析各差異基因在相應(yīng)數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布時以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肺纖維化模型的建立 HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰、肺泡間隔正常，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤或纖維化形成；模型組小鼠肺部出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)大面積破壞，肺泡腔萎縮消失，出現(xiàn)明顯的肺間質(zhì)纖維化及大量炎性細(xì)胞浸潤。Masson 染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常、藍(lán)染區(qū)域較少且著色淺，未見明顯的膠原沉積；與對照組比較，模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完全丟失，膠原纖維所對應(yīng)的藍(lán)染區(qū)域明顯增加、著色加深，且部分肺泡被膠原覆蓋(圖1)。

圖1 兩組小鼠肺組織HE和Masson染色結(jié)果(×100)Fig.1 HE and Masson staining of lung tissue in two groups of mice (×100)

2.2 兩組小鼠肺組織鐵沉積情況 普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔與間隔內(nèi)未見明顯的藍(lán)色顆粒，鐵染色結(jié)果為陰性；與對照組比較，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一定數(shù)量的藍(lán)染顆粒，鐵染色結(jié)果呈陽性(圖2)。

圖2 兩組小鼠肺組織鐵沉積情況(普魯士藍(lán)染色，×400)Fig.2 Iron-deposit in lung tissue of two groups of mice (Prussian blue staining, ×400)

2.3 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)譜 分別提取兩組小鼠肺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄后行PCR Array檢測，將上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)變化值∣FC∣≥2 且P<0.05 作為篩選條件對結(jié)果進(jìn)行分析。熱圖可體現(xiàn)樣本與差異表達(dá)基因的聚類分布情況。本次Array所檢測的90個鐵死亡相關(guān)基因中，紅框標(biāo)注的5 個基因在對照組與模型組中各自積聚到一個集中區(qū)域(圖3)。利用火山圖觀察兩組樣本鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)水平的差異分布，結(jié)果也同樣顯示，與對照組比較，模型組中有5 個基因存在差異表達(dá)，即碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)、半胱氨酰-tRNA 合成酶1(cysteinyltRNA synthetase 1，CARS1)、熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor 1，HSF1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3(NADPH oxidase 3，NOX3)和線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin，F(xiàn)TMT)基因，其表達(dá)變化方向均為下調(diào)(P<0.05，圖4)。

圖3 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)熱圖Fig.3 Heat map of genes related to ferroptosis in two groups of mice

圖4 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因火山圖Fig.4 Volcano plot of differentially expressed genes related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice

2.4 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因的功能富集分析 GO富集結(jié)果顯示，差異基因在生物過程方面主要參與體溫內(nèi)穩(wěn)態(tài)、鹽反應(yīng)、微管結(jié)合調(diào)控、鐵離子的細(xì)胞內(nèi)固等進(jìn)程，細(xì)胞組分方面主要涉及NADPH氧化酶復(fù)合體、前核、分子伴侶復(fù)合體、著絲粒等組分，分子功能方面主要與STAT 家族蛋白結(jié)合、碳酸脫氫酶活性、三價鐵結(jié)合、二價鐵結(jié)合、氨酰連接酶活性等功能相關(guān)(圖5)。KEGG信號通路預(yù)測結(jié)果顯示，除鐵死亡外，差異基因還參與氮素代謝、氨酰的生物合成、軍團(tuán)菌病通路等過程(圖6)。

圖5 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of DEGs related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice

2.5 小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因在肺纖維化模型中的表達(dá)驗證 采用RT-qPCR 檢測5 個差異基因在對照組與模型組小鼠肺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組CA9、CARS1、FTMT及HSF1的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，而兩組NOX3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖7)。

圖7 兩組小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因表達(dá)驗證Fig.7 Validation of differentially expressed genes related to pulmonary ferroptosis in two groups of mice by RT-qPCR

2.6 小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因在IPF 臨床樣本中的表達(dá)驗證 檢索GEO數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示目標(biāo)差異基因在兩個滿足篩選條件的數(shù)據(jù)集中有表達(dá)，其中CA9和HSF1表達(dá)于GDS1252數(shù)據(jù)集，CARS1和NOX3表達(dá)于GDS4279數(shù)據(jù)集，F(xiàn)TMT則未檢索到符合樣本條件的數(shù)據(jù)集。對上述差異基因在其相應(yīng)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CA9、HSF1、CARS1及NOX3在IPF臨床肺組織樣本中的表達(dá)模式與本研究兩組小鼠肺組織PCR Array檢測結(jié)果中的表達(dá)模式一致，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 小鼠肺組織鐵死亡相關(guān)差異基因在臨床樣本中的表達(dá)情況Tab.2 Expression of differentially expressed genes related to mouse pulmonary ferroptosis in clinical samples

3 討 論

IPF作為一種慢性、進(jìn)展性、年齡相關(guān)的間質(zhì)性肺部疾病，因其發(fā)病率較高、發(fā)病機(jī)制尚未明確、病程不可逆且預(yù)后不良而成為當(dāng)前社會經(jīng)濟(jì)的潛在負(fù)擔(dān)之一[14]。近年研究顯示，IPF患者感染新冠肺炎病毒后，發(fā)展為重癥新冠肺炎的風(fēng)險較非IPF 感染者增高[15]。鑒于上述特征，深入研究IPF 發(fā)病機(jī)制、尋找有效的早期診斷與治療靶點迫在眉睫。

有多種動物模型先后被用于IPF 發(fā)病機(jī)制的研究[16]，但由于疾病本身的獨特性及其復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制，科學(xué)家們尚未發(fā)現(xiàn)能夠完全復(fù)制IPF 發(fā)生的體內(nèi)模型。目前用于IPF 研究的動物模型須具備肺部損傷、無休止的修復(fù)以及過量瘢痕形成等三要素[17]。常見的肺纖維化動物模型構(gòu)建方式包括博來霉素、二氧化硅、石棉等藥物誘導(dǎo)，輻射誘導(dǎo)，基因工程誘導(dǎo)等，其中氣管滴注法給予博來霉素因其模型動物肺部發(fā)生強(qiáng)烈的纖維化反應(yīng)、與IPF 患者相似的組織學(xué)特征以及相對低廉的造模成本而被廣泛應(yīng)用于IPF發(fā)病機(jī)制研究[16,18]。

鐵死亡作為一種鐵依賴型細(xì)胞死亡調(diào)控方式，由Dixon 等[10]于2012 年首次報道。研究顯示，鐵死亡可參與有機(jī)體的多種生理與病理進(jìn)程，在卒中、腦損傷和腫瘤等多種疾病中起重要作用[19-20]。盡管鐵元素為機(jī)體細(xì)胞正常生理過程所必需，但過量的鐵累積會導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量增加，進(jìn)而觸發(fā)鐵死亡[21]。一些被認(rèn)定為鐵死亡標(biāo)志或調(diào)控因子的基因可參與慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、哮喘、肺癌等多種良性與惡性肺部疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。值得注意的是，IPF患者肺組織中鐵含量升高，且鐵元素的積聚與氣道纖維化程度及肺功能密切相關(guān)[23]。本研究博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺組織鐵染色呈陽性，提示模型組小鼠肺部有鐵元素沉積，與IPF的上述特征相符。在轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的肺纖維化細(xì)胞模型中，鐵死亡誘導(dǎo)劑可通過促進(jìn)脂質(zhì)過氧化以及降低GPX4表達(dá)而加速成纖維細(xì)胞向效應(yīng)方向分化，而鐵死亡抑制劑則可通過降低脂質(zhì)過氧化和增強(qiáng)GPX4 表達(dá)而抑制肺纖維化與鐵死亡的發(fā)生[24]。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，抑制長鏈非編碼RNA 鋅指反義鏈1 的表達(dá)可顯著減弱博來霉素引起的脂質(zhì)過氧化作用，從而抑制鐵死亡，緩解肺纖維化[25]。亦有研究顯示，IPF患者的支氣管肺泡灌洗液中，某些與鐵代謝或纖維化相關(guān)的標(biāo)志分子表達(dá)紊亂[26]。上述研究成果均提示鐵死亡可能在IPF發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

PCR Array 作為一種以功能分類的PCR陣列芯片技術(shù)，結(jié)合了實時定量PCR 準(zhǔn)確靈敏的特性與微陣列芯片檢測通量大的優(yōu)勢，可一次性檢測多種基因的表達(dá)，是分析信號通路或某些生理功能、病理進(jìn)程相關(guān)基因表達(dá)變化的首選工具之一[27]。本研究選用的小鼠鐵死亡相關(guān)基因PCR Array包含了鐵死亡通路中90個關(guān)鍵基因，涉及鐵代謝、氨基酸與谷胱甘肽代謝、脂質(zhì)代謝等參與調(diào)控鐵死亡的生物過程。本研究PCR Array檢測顯示，與對照組比較，模型組共有5 個差異基因，分別為CA9、CARS1、HSF1、NOX3和FTMT，其表達(dá)變化方向均為下調(diào)。本研究通過實時定量PCR實驗與GEO數(shù)據(jù)庫挖掘分別驗證了5個差異基因在IPF模型小鼠與臨床患者肺組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示差異基因在動物實驗中的表達(dá)情況與PCR Array結(jié)果基本一致，在肺纖維化臨床樣本中的表達(dá)模式與PCR Array 測得的模式也基本相符，但后者表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與各類基因芯片及高通量測序數(shù)據(jù)中檢測鐵死亡相關(guān)特異性基因的數(shù)據(jù)集較少，以及目前檢索到的兩個數(shù)據(jù)集中樣本量有限等因素有關(guān)。

CA9 是一種跨膜蛋白，屬于功能龐大的碳酸酐酶家族，其主要成分為酸性氨基酸，在生理狀態(tài)下具有維持細(xì)胞外基質(zhì)酸堿平衡的重要作用[28]；病理狀態(tài)下，CA9 參與調(diào)控實體腫瘤的微環(huán)境，且其表達(dá)量與多種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，已成為當(dāng)下腫瘤研究領(lǐng)域的熱點基因，是評估抗腫瘤治療效果的潛在分子標(biāo)志物[29]。FTMT是重要的線粒體鐵儲存蛋白，具有鐵氧化酶活性，可通過催化二價鐵向三價鐵轉(zhuǎn)化實現(xiàn)鐵元素的存儲[30-31]?，F(xiàn)有研究提示，F(xiàn)TMT的主要功能為保護(hù)組織特異性細(xì)胞免受鐵元素依賴的氧化損傷，而非直接調(diào)控細(xì)胞鐵含量[32]；Wang等[33]在體外研究中發(fā)現(xiàn)FTMT 可通過降低細(xì)胞不穩(wěn)定鐵池儲量及胞質(zhì)活性氧生成而抑制鐵死亡。盡管CA9及FTMT在IPF中的作用鮮有報道，但兩者均被認(rèn)為是鐵死亡的抑制因子[33-34]；而鐵死亡通路在IPF中呈活化狀態(tài)，故CA9與FTMT基因在本研究IPF模型中的表達(dá)量降低與鐵死亡通路的改變相一致，提示這兩個基因可能通過鐵死亡通路參與了IPF 的疾病發(fā)生過程。HSF1作為一種在溫度上升等應(yīng)激狀態(tài)下可被迅速誘導(dǎo)并表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在生物體生命活動的各階段、各器官組織中廣泛表達(dá)，具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育、抗凋亡、保護(hù)心臟缺血性損傷等功能，并在對抗呼吸機(jī)導(dǎo)致的肺部機(jī)械損傷性炎癥、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，以及革蘭陰性菌感染導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥等炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[35-36]。Chen等[37]的研究顯示，HSF1可促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖和纖維化轉(zhuǎn)變，敲低HSF1則可抑制細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，這與本研究HSF1在肺纖維化模型中表達(dá)量降低的結(jié)果并不一致；考慮到HSF1強(qiáng)大的抗炎作用以及炎癥反應(yīng)在肺纖維化中的重要地位，HSF1在本研究中表達(dá)量下降或可理解為其在肺纖維化中的抗炎作用大于促纖維化作用。然而影響疾病潛伏與發(fā)生的因素通常錯綜復(fù)雜，基因的表達(dá)也存在著時空特異性，故HSF1在IPF中的作用仍值得進(jìn)一步探究。本研究篩選得到的另外兩個差異基因CARS1與NOX3均為鐵死亡通路中的驅(qū)動因子，分別行使著抑制腫瘤發(fā)生和參與內(nèi)耳石形成的重要功能[10,38]，但兩者與IPF 的關(guān)系鮮有報道，加之對本次PCR Array 的驗證實驗中NOX3表達(dá)量在模型組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CARS1與NOX3在IPF中的表達(dá)變化及其作用有待進(jìn)一步驗證與探索。

為進(jìn)一步探究鐵死亡在IPF 中的作用，本研究對篩選所得的差異基因開展了功能富集性分析，其結(jié)果或可為探究IPF 的發(fā)生機(jī)制提供一定參考。GO與KEGG 分析結(jié)果顯示，差異基因主要與體溫內(nèi)穩(wěn)態(tài)、NADPH氧化酶復(fù)合體、碳酸脫氫酶活性等功能有關(guān)，主要通過氮素代謝、氨酰的生物合成、軍團(tuán)菌病等信號通路參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。已有研究顯示氮素代謝參與調(diào)控IPF的發(fā)生[39-40]，早年報道中亦有急性軍團(tuán)菌肺炎患者并發(fā)肺纖維化的案例[41]。

綜上所述，本研究通過建立博來霉素誘導(dǎo)的小鼠IPF 模型，檢測其肺組織鐵死亡通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，針對篩選所獲的差異基因開展生物信息學(xué)分析及表達(dá)驗證，并結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報道初步討論了其在IPF 中的潛在作用。本研究以鐵死亡為切入點，為IPF的機(jī)制探索提供了新思路，也為IPF的早期診斷與治療提供了潛在的分子標(biāo)志物與用藥靶點。下一步，我們將結(jié)合體外與體內(nèi)實驗研究各差異基因通過鐵死亡通路調(diào)控IPF發(fā)生的具體機(jī)制。