朱夢月，侍慧慧

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000)

天然產(chǎn)物是一類由動(dòng)植物和微生物等生物體代謝所產(chǎn)生的具有多種生物活性的小分子化合物[1]，結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性使它們廣泛成為藥物和藥物先導(dǎo)化合物[2]。隨著科技發(fā)展和人們對(duì)天然產(chǎn)物的深入研究，越來越多的微生物天然產(chǎn)物被分離鑒定，并作為源頭分子應(yīng)用于新藥研發(fā)[3-6]，數(shù)據(jù)表明過去的四五十年間，約 46% 具有治療效果的小分子藥物來源于未經(jīng)修飾的天然產(chǎn)物或其衍生物[7]。

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物種類豐富，生物活性強(qiáng)。在已知結(jié)構(gòu)的 160 000 種天然產(chǎn)物中，約 50% 來自微生物，其中約 25% 是具有生物活性的小分子，包括抗生素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、酶抑制劑和生物除草劑等，涉及人類生活的方方面面[8]。放線菌是自然界中分布廣泛的一類重要微生物資源，而鏈霉菌是其中數(shù)量最為龐大的屬。鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富多樣、結(jié)構(gòu)新穎、且具有較好的生物活性，是新型抗生素的重要來源。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家意識(shí)到鏈霉菌中大量基因簇處于沉默狀態(tài)這也就意味著鏈霉菌中仍有大量新型活性天然產(chǎn)物亟待發(fā)掘[9]。其中芳香族聚酮類化合物是一類具有抗病毒、抗真菌、細(xì)菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、酶抑制劑以及免疫抑制劑作用等多種生物活性，結(jié)構(gòu)多樣化的細(xì)菌次生代謝物，是寶貴的藥源分子資源庫[10-14]。在數(shù)代人不懈努力下，許多聚酮類化合物及其半合成衍生物已作為高效藥物應(yīng)用于臨床，如四環(huán)素類抗生素及抗腫瘤藥物光神霉素和阿霉素等[15-16]。

但是隨著抗生素廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥性逐年增加，耐藥性細(xì)菌感染不僅嚴(yán)重危害人類健康，而且已成為世界范圍的棘手問題，所以深入挖掘微生物來源新型天然產(chǎn)物仍是當(dāng)今藥學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[17]。

基于鏈霉菌的巨大資源優(yōu)勢，本文重點(diǎn)研究從連云港花果山上采集的土壤樣品中分離出一株鏈霉菌編號(hào)NA07292，通過基因組測序鑒定為鏈霉菌屬Streptomyces peucetius。根據(jù)NA07292次級(jí)代謝產(chǎn)物紫外圖譜，推測出次級(jí)代謝結(jié)構(gòu)上屬于聚酮類[18-19]，這一類化合物具有多種生物活性、結(jié)構(gòu)多樣，有望從中分離出活性較好的藥物先導(dǎo)分子。對(duì)這一株菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用Sephadex LH-20 柱色譜、正相硅膠柱、反相硅膠柱、高效液相制備色譜、等手段對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終分離出1個(gè)化合物，根據(jù)質(zhì)譜、一維和二維波譜數(shù)據(jù)、理化性質(zhì)等鑒定結(jié)構(gòu)為4-O-(β′-D-glucopyranuronosyl)-ε-rho-domycinone(1)(圖1)，諸多同類吸收的化合物待分離，結(jié)構(gòu)上都屬于芳香聚酮類化合物。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、儀器、試劑、培養(yǎng)基等

1.1.1 材料與工具

主要材料：TLC 硅膠板(5×20 cm)煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司；反相柱色譜(ODS 填料)，日本YMC有限公司；凝膠填料(Sephadex LH-20)，Pharmacia Biotech公司；柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工；樹脂等。

工具：200 μL和1 mL移液槍配備200 μL和1 mL 槍頭；培養(yǎng)皿；EP管；鑷子；剪刀；研缽；酒精燈；接種環(huán)；涂布環(huán)；分液漏斗；旋蒸瓶；1 L錐形瓶；青霉素小瓶等。

1.1.2 儀器

電子天平；生物安全柜；超凈工作臺(tái)；高壓蒸汽滅菌鍋；-80 ℃超低溫冰箱；恒溫培養(yǎng)箱；高速離心機(jī)；恒溫?fù)u床；超純水儀；冷凝循環(huán)裝置CA-1111；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELAN-1000；半制備色譜柱MPLC(Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，250 mm×9.4 mm)；高效液相色譜儀HPLC(Agilient 1260 Infinity XDB-C18column，5 μm，250 mm×9.4 mm)；核磁共振儀(Bruker Avance III 400/600，TMS 為內(nèi)標(biāo))；紫外測定儀(Nanodrop2000)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus 870 FT-IR)；紫外分光光度計(jì)(detector L-7400 UV)。

1.1.3 試劑

乙腈等(分析純)，廣州金華大化學(xué)試劑公司；甲醇；乙腈等色譜級(jí)別溶劑(海市百靈威)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氘代DMSO，上海市恩拿馬生物科技有限公司；二氯甲烷；纈氨酸；亮氨酸；D-FDAA，西格瑪奧德里奇有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)：土豆210 g去皮，切成小塊，加入適量水，煮沸30 min后，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，加水定容至1 L，再稱取 2 g 蔗糖和 10%也就是20 g瓊脂，混勻溶解后分裝于5個(gè)錐形瓶中，115 ℃條件下滅菌 30 min，冷卻至 60 ℃以下，加氨芐青霉素和卡那霉素各150 mg，搖勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后備用。

Malt(麥芽培養(yǎng)基)：麥芽20 g左右加600 mL水煮沸30 min，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，加1 g蛋白胨，20 g蔗糖，加水定容至1 L后搖勻。

GS(高氏培養(yǎng)基)：1 g硝酸鉀、0.5 g 氯化鈉、0.5 g 三水合磷酸氫二鉀、0.01 g七水合硫酸亞鐵、0.5 g 七水合硫酸鎂、20 g可溶性淀粉、10 g瓊脂粉、加入1 L水定容，調(diào)節(jié)PH至7.4～7.6。

ISP4培養(yǎng)基：2 g氯化銨，2 g七水合硫酸鎂，1.365 g磷酸氫二鉀，2 g碳酸鈣，1 g氯化鈉，0.1 mL微量元素，10 g可溶性淀粉，20 g瓊脂粉，加1 L水定容后，溶解搖勻。

CPA(纖維素脯氨酸瓊脂培養(yǎng)基)：0.5 g氯化鈣，0.25 g硝酸鉀，0.2 g磷酸氫二鉀，1.0 g脯氨酸，2.0 g丙酮酸鈉，2.5 g羧甲基纖維素鈉，0.2 g七水合硫酸鎂，10 mg七水合硫酸亞鐵，20 g瓊脂粉，加1 L水溶解定容(CMC-Na提前用熱水不斷攪拌溶解，再加入重鉻酸鉀，保證終濃度為50 μg/mL)。

38#培養(yǎng)基：4.0 g葡萄糖，5.0 g麥芽浸出物，4.0 g酵母浸出物，1 mL復(fù)合維生素，20 g瓊脂粉，用1 L水定容溶解。

TSB培養(yǎng)基：30 mg TSB用1 L水溶解。

F培養(yǎng)基：0.1 g酪蛋白水解物，10.0 g葡萄糖，20.0 g蔗糖，1.0 g六水合氯化鎂，0.25 g硫酸鉀，5.0 g酵母浸出物，5 g MOPs，0.1 mL微量元素，用1 L水溶解定容。

Y培養(yǎng)基：10.0 g麥芽浸出物，4.0 g葡萄糖，4.0 g酵母浸出物，用1 L水溶解。

A培養(yǎng)基：1 g碳酸鈣，4 g酵母浸出物，2.0 g蛋白胨，0.04 g硫酸鐵，0.1 g溴化鉀，10.0 g可溶性淀粉，用1 L水溶解。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離方法及菌種鑒定

菌種分離方法：菌種編號(hào)NA07292這一株鏈霉菌是從江蘇連云港花果山上的土壤樣品中分離得到，用多種微生物培養(yǎng)基純化，最后發(fā)現(xiàn)此菌只在ISP4培養(yǎng)基平板上生長。具體步驟：將土壤樣品風(fēng)干后各稱取5 g左右，加入250 mL無菌水恒溫懸浮2 h，再使用無菌水將其稀釋成三個(gè)濃度梯度10-1、10-2、10-3，將三個(gè)濃度梯度分別用涂布棒涂布于PDA、GS、CPA、純瓊脂平板上，隨后恒溫培養(yǎng)直至長出單菌落后，再用Malt、ISP4、38#培養(yǎng)基純化，最后發(fā)現(xiàn)只有ISP4培養(yǎng)基上菌落，其他培養(yǎng)基均無菌落，菌落特征是內(nèi)生菌絲深紫色，氣生菌絲白色。

菌種鑒定：將菌種孢子粉末沾取少量至EP管中，加入裂解液、Tris-HCl緩沖液(pH= 8.0)、 EDTA、NaCl和二烷基硫酸鈉，置于渦旋混合儀混合，放入60 ℃水浴鍋中孵育20 min，上下顛倒充分混勻。之后向混懸液中加入醋酸鉀溶液，混勻后，離心10 min，吸取500 μL 上清至新EP管中，再加入同體積異丙醇，EP管上下顛倒至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，離心5 min，撇去上清液，再在EP管中加70%乙醇，混勻后離心3 min，再撇去上清，循環(huán)操作兩次將帶有基因組的EP管打開于室溫下晾10 min后加65 ℃熱水，基因組溶解后用NanoDrop2000 測濃度，并將提取的基因組片段送至擎科生物公司測序鑒定菌種。通過形態(tài)學(xué)和18S rRNA 序列對(duì)比，菌株鑒定結(jié)果表明屬于該海洋放線菌NA07292是Streptomyces peucetius。

1.2.2 菌種的發(fā)酵及提取分離方法

將鏈霉菌NA07292(Streptomyces peucetius)純化到ISP4平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，長出菌落后，配制1.0 L TSB培養(yǎng)液平均分裝到5個(gè)1 L錐形瓶中，挑一塊長有孢子的ISP4培養(yǎng)基接種到錐形瓶中，恒溫28 ℃、140 rpm/min搖至瓶中長出密集菌粒，即可作為種子液。

配制Y培養(yǎng)基9 L，平均分裝于35個(gè)1 L的錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，接種培養(yǎng)液量的5%即12.5 mL種子液，30 ℃恒溫、220 rpm搖床發(fā)酵7天。

發(fā)酵完成后，用紗布過濾，紗布下方濾液即得菌液。往菌液中加入大孔樹脂，吸附4 h，再用紗布過濾得到吸附后的樹脂，樹脂風(fēng)干后用CH3OH浸泡3次，合并3次CH3OH浸泡液進(jìn)行旋蒸濃縮后得到粗膏，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1：1的比例各萃取3遍粗膏，旋蒸濃縮后可得3段粗浸膏，通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯段粗浸膏有目標(biāo)化合物。乙酸乙酯段粗浸膏共8.7 g。

8.7 g乙酸乙酯段粗浸膏首先用中壓制備色譜MPLC分離，流動(dòng)相組成為水和甲醇，按80%～20%甲醇梯度洗脫后，將多段洗脫液進(jìn)行薄層色譜TLC分析，將有類似組分的洗脫液合并濃縮后，分為8組(Fr1-Fr8)。對(duì)Fr4和Fr6進(jìn)一步分析純化，F(xiàn)r4段首先用凝膠柱色譜Sephadex LH-20 初步分離后，再用高效液相色譜HPLC純化得到化合物1，剩余浸膏段待分離。具體分離流程如圖2所示。

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：紫紅色無定形粉末，高分辨質(zhì)譜HRESIMS顯示 m/z：627.378 5[M+Na]+，合理分子式C28H28O15，不飽和度為15，核磁數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物1的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)數(shù)據(jù)歸屬 (DMSO-d6)

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)譜中，低場區(qū)也就是芳香區(qū)出現(xiàn)一個(gè)苯環(huán)上3個(gè)相鄰氫的特征信號(hào) (δC/H120.95/7.97，δC/H136.4/7.90，δC/H122.91/7.73，)，中高場區(qū)出現(xiàn)糖環(huán)的5個(gè)氫的特征信號(hào) (δH3.38，3.49，3.52，4.03，5.32)，高場區(qū)還出現(xiàn)2個(gè)亞甲基 (δH1.98～2.09，1.41～1.61)、2個(gè)甲基 (δH1.03，3.49 )、2個(gè)次甲基 (δH4.15，5.12)特征信號(hào) ；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)譜中出現(xiàn)4個(gè)羰基碳特征信號(hào) (δC186.8，186.87，171.24，170.64)，12個(gè)苯環(huán)區(qū)碳特征信號(hào) (δC110～158)，糖環(huán)碳特征信號(hào) (δC100.32，71.52～76.35)；分析譜圖發(fā)現(xiàn)H-2 (δH7.90)與C-12 (δC186.87)存在HMBC相關(guān)、H-3 (δH7.73)與C-5 (δC186.8)存在遠(yuǎn)程HMBC相關(guān)，推測苯環(huán)連接對(duì)苯醌環(huán)，此時(shí)還剩6個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)未歸屬，推測此化合物的基本骨架是蒽醌，同時(shí)也發(fā)現(xiàn) H-10 (δH4.15)與C-13，C-6a，C-10a(δC171.24，135.12，139.22 )有HMBC相關(guān)，說明H-10與羰基和苯環(huán)有直接相連，H-7 (δH5.12)與C-10a，C-6a(δC139.22，135.12)存在HMBC相關(guān)，說明H-7與苯環(huán)也有直接相連；H-8 (δH1.98-2.09)與H-7存在COSY相關(guān)，H-8與C-9 (δC71.52)、 C-10(δC51.69)存在HMBC相關(guān)H-15 (δH1.41～1.67)與 C-10、C-9有HMBC相關(guān)，故H-9到H-7形成環(huán)系；根據(jù)COSY相關(guān)表明C-9連接一個(gè)CH3CH2，C-9有被羥基取代的碳位移特征信號(hào)；糖環(huán)中C-1′的δC100.832符合連氧的特征，又因?yàn)镠-1′與苯環(huán)C-4相關(guān)，所以糖環(huán)應(yīng)連在C-4，基于其它譜圖信息，這一結(jié)構(gòu)推測得到確認(rèn)，查閱文獻(xiàn)確認(rèn)化合物1是已知化合物 4-O- (β′-D-glucopyranuronosyl)-ε-rho-domycinone(圖3)[20]。

圖3 化合物1的結(jié)構(gòu)和二維核磁相關(guān)

3 結(jié) 論

本文研究鏈霉菌Streptomyces peucetius NA07292的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過發(fā)酵、分離和純化得到聚酮類化合物1，還有眾多聚酮類化合物待分離?；衔?是一類具有多環(huán)酚醛骨架的芳香族聚酮類化合物，這一類化合物被證明具有多種生物活性[21]，目前相關(guān)結(jié)構(gòu)尚未有報(bào)道研究過相關(guān)活性，因此值得深入研究。