陳丹丹， 武曉敏， 鄧紫薇， 李佩玲， 李光華，， 耿 瑤

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學系，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院心血管外科，寧夏醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學護理學院，銀川 750004）

溶質(zhì)載體家庭成員7A11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）基因位于人類第4 號染色體[1]，其編碼的蛋白SLC7A11 為胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運體的輕鏈亞基與重鏈亞基SLC3A2 組成System Xc-系統(tǒng)，負責維持System Xc-系統(tǒng)的基本轉(zhuǎn)運活性[2-3]，合成谷胱甘肽（glutathione，GSH），保護細胞免受氧化應激損傷，對細胞的正常生長尤為關(guān)鍵[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 表達減少，可導致GSH 合成減少、GSH 過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的活性下降，從而生成大量脂質(zhì)活性氧，引起細胞發(fā)生鐵死亡。SLC7A11/GPX4 信號通路是介導鐵死亡的核心通路。

熱射?。╤eat stroke，HS）的發(fā)生率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，嚴重危害公眾健康[7]。HS 可導致心血管系統(tǒng)發(fā)生多種毒性作用，如炎癥反應、氧化應激及凋亡[8-9]等，但其完整的發(fā)病機制尚不清楚?，F(xiàn)階段，HS 治療更多的分子機制仍有待深入挖掘。SLC7A11 誘導HS 大鼠心肌鐵死亡是否發(fā)揮關(guān)鍵作用，是否存在研究潛能有待考究。因此，本研究通過利用各種生物信息學網(wǎng)絡平臺深入研究SLC7A11 磷酸化、N-糖基化、抗原性和免疫原性等性質(zhì)，以期預測SLC7A11 受調(diào)控的可能潛在性能，并初步通過體內(nèi)和體外實驗探究SLC7A11 在HS 大鼠心肌組織及高溫干預的H9C2 大鼠心肌細胞中的表達水平，為后續(xù)深入研究并揭示HS 所致心肌鐵死亡的潛在分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SLC7A11 氨基酸序列

從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫檢索人SLC7A11 基因的相關(guān)信息，其蛋白登錄號為XP_054205473.1。

1.2 主要試劑與儀器

SLC7A11 抗體（DF12509，美國Affinity Biosciences 公司）、GPX4 抗體（67763-1-Ig，北京博蕾德生物科技有限公司）、GAPDH 抗體（E-AB-20059，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；BCA 蛋白含量檢測試劑盒（KGPBCA，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、總RNA 提取試劑盒［DP419，天根生化科技（北京）有限公司］、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒［RR820A，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］、TaKaRa PCR 試劑盒［RR047A，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］、Liproxstatin-1（HY-12726，上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司）；ZRS-1JSW 智能人工氣候培養(yǎng)室（杭州錢江儀器設備有限公司）、高速組織冷凍研磨器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 生物信息學分析

采用表1 所列基因分析工具[10-11]對人SLC7A11基因的氨基酸序列進行生物信息學分析。

表1 人SLC7A11 基因生物信息學預測分析網(wǎng)絡平臺

1.4 實驗分組及模型的構(gòu)建

1.4.1 體內(nèi)實驗 SPF 級雄性SD 大鼠由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格證號：2020-0001）。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批（2017-030）。將12 只SD 大鼠隨機分為對照組與HS 組，每組6 只，對照組SD大鼠置于室溫（25±1）℃的環(huán)境中，HS 組大鼠先置于溫度（36±0.5）℃、濕度（65±5）%的人工仿真氣候動物艙內(nèi)使大鼠維持一定的體溫，再將氣候艙溫度設置為（40±0.5）℃、濕度（65±5）%開始熱暴露誘發(fā)HS，直至直腸溫度達到42 ℃，立刻將其轉(zhuǎn)移至溫度為（25±1）℃的環(huán)境中恢復12 h，即模型建立成功，熱暴露期間，兩組大鼠均禁食、禁水。

1.4.2 體外實驗 H9C2 心肌細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司，實驗分為對照組、鐵死亡抑制劑（Liproxstatin-1）組、HS 組和HS+Liproxstatin-1 組，對照組細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，HS 組細胞在43 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，置于37 ℃環(huán)境恢復3 h，即模型建立成功，Liproxstatin-1 組和HS+Liproxstatin-1 組在置于43 ℃培養(yǎng)箱前2 h 加入Liproxstatin-1（25 μmol·L-1），2 h后，Liproxstatin-1 組在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，HS+Liproxstatin-1 組細胞在43 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，置于37 ℃環(huán)境恢復3 h，最后收取各組細胞。

1.5 Western blot 檢測SLC7A11 與GPX4 的蛋白表達水平

將SD 大鼠麻醉后，取其心臟，切取100 mg心肌組織剪碎后加入1 mL 裂解液，收集干預細胞后加入適量的裂解液，置于高速組織冷凍研磨器進行充分破碎，4 ℃條件下20 000 r·min-1離心5 min，靜置10 min，將提取的總蛋白在99.5 ℃加熱變性。配制10%的凝膠，上樣80 V 電泳，80 V轉(zhuǎn)膜，用快速封閉液封閉30 min，PBST 洗3 次/10 min；加入一抗SLC7A11（1 ∶500）、GPX4（1 ∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，PBST洗3 次/10 min；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，PBST 洗3次/10 min，最后使用ECL 超敏發(fā)光液顯色曝光條帶，用Image J 軟件分析結(jié)果。

1.6 RT-qPCR 檢測SLC7A11 與GPX4 的mRNA水平

使用天根試劑從心肌組織和心肌細胞中提取總RNA，根據(jù)說明書使用PrimeScriptTMRT Master Mix 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBRR Premi Ex TaqTM試劑盒進行qPCR 擴增目標cDNA，選擇GAPDH 為內(nèi)參。PCR 引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設計和合成。引物序列如下：SLC7A11-F（5’-TATGCTGAATTGGGTACG AGC-3’），SLC7A11-R（3’-TATTACCAGCAGTTCC ACCCA-5’）；GPX4 -F（5’-AGGCAGGAGCCAGG AAGTAATC-3’），GPX4-R（3’-ACCACGCAGCCG TTCTTATC-5’）；GAPDH -F（5’-CTGGAGAAAC CTGCCAAGTATG-3’），GAPDH-R（3’-GGTGGAA GAATGGGAGTTGCT-5’）。PCR 循環(huán)如表2 所示。取各組Ct 值2-ΔΔCt作為統(tǒng)計結(jié)果。

表2 RT-qPCR 程序

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad 8.0 軟件繪圖。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，進一步兩兩比較采用Tukey 檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC7A11 基因編碼蛋白產(chǎn)物的疏水性、親水性

預測SLC7A11 基因編碼蛋白質(zhì)的親水性與疏水性結(jié)果顯示（圖1），超過50%的氨基酸疏水峰大于0，推測該蛋白可能是疏水性蛋白。其中，該蛋白質(zhì)上異亮氨酸（Ile）疏水性最強（+4.500 0），精氨酸（Arg）親水性最強（-4.500）。

圖1 SLC7A11 基因編碼蛋白產(chǎn)物的親、疏水性預測分析

2.2 SLC7A11 蛋白信號肽跨膜區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域

預測分析SLC7A11 蛋白信號肽跨膜區(qū)，結(jié)果顯示（圖2A），SLC7A11 存在信號肽的可能性為0.864 5，其切割位點位于第29～30 位氨基酸。對SLC7A11 蛋白跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果顯示（圖2B），該基因編碼產(chǎn)物可能存在12 個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋中氨基酸的預期數(shù)量為256.980 47（跨膜螺旋中氨基酸數(shù)量>18 可能為跨膜蛋白），膜細胞質(zhì)側(cè)為N 端的概率為0.996 36，預示SLC7A11 可能為跨膜蛋白。

圖2 SLC7A11 基因編碼蛋白的信號肽跨膜區(qū)域和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域預測分析

2.3 SLC7A11 蛋白的磷酸化位點及N-糖基化位點預測

預測結(jié)果顯示，SLC7A11 基因編碼的蛋白可能含有40 個磷酸化位點（圖3A），其中含有磷酸化絲氨酸位點20 個，磷酸化蘇氨酸位點17 個，磷酸化酪氨酸位點3 個，并且可能存在12 個N-糖基化位點（圖3B）。

圖3 SLC7A11 基因編碼蛋白磷酸化位點和N-糖基化位點預測分析

2.4 SLC7A11 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測

通過預測SLC7A11 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖4A），其中含有α 螺旋（Hh）216 個，占43.11%；β-折疊（Ee）117 個，占23.35%；β-轉(zhuǎn)角（Tt）24 個，占4.79%；無規(guī)卷曲（Cc）144 個，占28.74%。同源建模預測SLC711 三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖4B），SLC7A11 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測與模板覆蓋率為100%，模型GMQE 評分為0.80，預測模型可靠。

圖4 SLC7A11 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測分析

2.5 SLC7A11 蛋白的抗原決定簇預測分析

對SLC7A11 蛋白抗原決定簇進行預測，結(jié)果顯示（圖5），SLC7A11 表達蛋白的平均抗原傾向指數(shù)為1.064 1，共含有15 個抗原決定簇區(qū)域。

圖5 SLC7A11 蛋白抗原決定簇預測分析

2.6 篩選與SLC7A11 蛋白有相互作用的蛋白

通過STRING 數(shù)據(jù)庫檢索與SLC7A11 蛋白相互作用的蛋白，篩選出與SLC7A11 作用關(guān)系最為密切的蛋白，結(jié)果顯示（圖6），SLC7A11與GPX4、CD44、SLC3A2、SLC1A7、SLC3A1、SLC1A2等蛋白存在相互作用關(guān)系，且比其他蛋白作用關(guān)系更為緊密。

圖6 SLC7A11 蛋白PPI 圖預測分析

2.7 各組大鼠心肌組織中SLC7A11 與GPX4 的表達水平

與對照組相比，HS 組大鼠心肌組織中SLC7A11（P<0.05）與GPX4（P<0.01）mRNA 和蛋白水平均降低（圖7）。

圖7 大鼠心肌組織中SLC7A11 與GPX4 mRNA 和蛋白表達水平

2.8 各組H9C2 大鼠心肌細胞中SLC7A11 與GPX4的表達水平

與對照組相比，Liproxstatin-1 組SLC7A11 和GPX4 mRNA 和蛋白水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05），HS 組SLC7A11 與GPX4 mRNA 和蛋白水平均降低（P 均<0.05）；與HS 組相比，HS+Liproxstatin-1 組SLC7A11（P<0.05）和GPX4（P<0.01）mRNA 和蛋白水平均升高（圖8）。

圖8 H9C2 細胞中SLC7A11 與GPX4 mRNA 和蛋白表達水平

3 討論

SLC7A11 為一種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，對維持細胞生長和氧化還原具有重要意義[4-5]。2012 年Dixon等[12]首次提出鐵死亡，即鐵依賴性脂質(zhì)活性氧堆積導致的細胞死亡。SLC7A11 作為重要的鐵死亡相關(guān)蛋白，其下調(diào)可通過抑制半胱氨酸代謝通路，導致細胞內(nèi)胱氨酸水平降低和GSH 生物合成耗竭，間接抑制GPX4 的活性，進而導致脂質(zhì)過氧化物堆積，最終誘導細胞發(fā)生鐵死亡[6]。在心肌缺血再灌注、心肌梗死、心力衰竭、心臟移植等心血管疾病多種實驗模型中，SLC7A11 所介導的鐵死亡對分子和代謝調(diào)控機制均發(fā)揮關(guān)鍵作用，且通過抑制鐵死亡可以得到改善[13-15]。HS 是一種最嚴重、最致命的中暑，病死率高于50%[16]。心臟被認為是HS 致機體損傷中最先、最易受損的對象之一[9]。心血管系統(tǒng)在HS 的發(fā)病過程中，在調(diào)節(jié)機體散熱和熱適應等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究[17]發(fā)現(xiàn)，HS 導致心血管功能發(fā)生異常的比例高達43.4%～65.2%。臨床數(shù)據(jù)[18]顯示，HS 所導致的心肌損傷療效欠佳，預后較差，需要進一步深入挖掘HS 的發(fā)病機制，尋找新的分子標志物、新的治療靶點為HS 的預后及靶向治療提供新方案。現(xiàn)階段，對SLC7A11 具體的調(diào)控機制尚不完全清晰，因此利用生物信息學深入研究SLC7A11 的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)，預測其磷酸化位點、N-糖基化位點及其抗原決定簇，以期為臨床中治療熱射病導致的心肌損傷提供新的研究靶點與理論依據(jù)。

SLC7A11 是含有信號肽的疏水性跨膜蛋白，參與多種心血管疾病[19-20]，若將其作為干預靶點，不失為治療HS 所致心肌損傷的潛在治療思路。目前，對于SLC7A11 的研究主要聚焦于其沉默及過表達，關(guān)于其具體調(diào)控機制尚不完全清楚。本研究預測發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 蛋白存在40 個磷酸化位點、12 個N-糖基化位點，這或許是其參與多種疾病的原因，深入探究其不同的磷酸化位點或N-糖基化位點，或許可為HS 所致心肌損傷的研究與治療提供新的研究線索。深入探究二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)和致病機制間的相關(guān)性尤為重要。SLC7A11 的二級結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋、β-折疊及無規(guī)卷曲構(gòu)成，具有抗原潛力。蛋白相互作用網(wǎng)絡圖預測顯示，SLC7A11 與GPX4、CD44、SLC3A2、SLC1A7、SLC3A1、SLC1A2 等蛋白相互作用最為密切，這些蛋白主要與鐵死亡相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程相關(guān)。本研究在大鼠心肌組織及H9C2心肌細胞中檢測了SLC7A11 與GPX4 的表達水平，HS 大鼠心肌組織和高溫干預的H9C2 心肌細胞中SLC7A11 與GPX4 表達減少?；诖耍诩毎缴霞尤肓髓F死亡抑制劑Liproxstatin-1進行探究發(fā)現(xiàn)，Liproxstatin-1 可改善高溫干預導致的H9C2 心肌細胞SLC7A11 與GPX4 mRNA和蛋白水平的降低。因此，以SLC7A11 為靶點，以與其相互作用的蛋白為初步的研究方向進行深入研究，或許有助于對HS 所致的心肌損傷提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究利用多種生物信息學網(wǎng)絡平臺對SLC7A11 進行預測分析，發(fā)現(xiàn)其是疏水性跨膜蛋白，存在磷酸化位點和N-糖基化位點且具有抗原性。HS 大鼠心肌組織和高溫干預的H9C2 心肌細胞中SLC7A11 及與其相關(guān)蛋白GPX4 的表達水平減少，通過在細胞水平加入鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1 可改善SLC7A11 與GPX4 的降低，為后續(xù)研究SLC7A11 所介導的鐵死亡在HS 心肌損傷中的調(diào)控機制提供新的研究思路及理論依據(jù)。