吳艷清,白菁華,劉沺沺

(保定學(xué)院 生物化工與環(huán)境工程學(xué)院,河北 保定 071002)

深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes,DSE)是一類廣泛定殖于植物根部并與植物共生的小型絲狀真菌,能夠促進(jìn)植物生長,提高抗逆能力[1],在與藥用植物共生過程中能夠加強植物合成與積累藥用成分[2],或活化藥用成分進(jìn)而提升功效[3],甚至其自身部分次生代謝產(chǎn)物就是藥用活性物質(zhì)[4],在提高藥用價值方面發(fā)揮重要作用.朝天委陵菜(Potentillasupina)是薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)1～2年生草本植物,分布廣泛,用途多樣,除食用外被廣泛用作民族藥,臨床上用于治療糖尿病和細(xì)菌性痢疾等癥[5],藥用價值很高.但迄今為止,僅見有委陵菜與叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AM)的少量相關(guān)報道,如根內(nèi)球囊霉(Rhizophagusintraradices)對鈍裂委陵菜(P.chinensis)具有促生作用[6],黑球囊霉(Glomusmelanosporum)能夠減輕鹽堿對鵝絨委陵菜(P.anserina)的脅迫傷害[7],摩西球囊霉(Funneliformismosseae)能夠增強絹毛委陵菜(P.sericea)的耐鎘能力[8],但鮮見委陵菜與DSE之間相互關(guān)系的研究,其根內(nèi)有無DSE定殖也不清楚.此外,有研究指出AM與DSE在植物體內(nèi)的定殖存在生態(tài)位競爭關(guān)系[9].本文對朝天委陵菜根內(nèi)DSE的定殖狀況進(jìn)行觀察,對其中的DSE進(jìn)行了分離純化和鑒定,并明確其中1株DSE真菌的動態(tài)生長特性,為研究微生物-植物互作提供研究思路,同時也為DSE菌種的開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

朝天委陵菜采自河北省保定市郊區(qū)自然生境(38°52′ N,115°34′ E),隨機選取10個樣方(2 m×2 m),每個樣方采集3株正常健康生長的植株,取根部用流水洗去泥沙雜質(zhì),切成1.0 cm×0.2 cm根段,4 ℃保存用于DSE鏡檢和菌種分離.

1.2 DSE菌株定殖鏡檢

每個樣方隨機選取25個根段,共計250個根段,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒處理和無菌水清洗后,于100 ℃下水浴30 min以去除根皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì),接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的酸性品紅染色固定,再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫色和無菌水清洗后,置于光學(xué)顯微鏡下鏡檢,觀察DSE在朝天委陵菜根部的定殖情況,并統(tǒng)計DSE定殖率.定殖率計算公式為

1.3 DSE菌株分離和純化

另隨機選取54個根段,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaClO和體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒處理,并用無菌水清洗后,接種于PDA(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)上,每平皿6個根段,共接種9皿,置于28 ℃下暗培養(yǎng)5～7 d.待根段周圍長出菌落后,挑取菌落邊緣菌絲體接種在新鮮PDA上,重復(fù)轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)3次以純化菌株.

1.4 DSE菌株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

對分離純化出的DSE真菌中生長狀態(tài)最好的菌株,根據(jù)DSE菌株在PDA上的培養(yǎng)特性、菌落、菌絲體和分生孢子等特征,參考《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.同時,采用Ezup柱式真菌基因組DNA試劑盒提取基因組DNA,利用rDNA-ITS序列(rDNA internal transcribed spacer)進(jìn)行鑒定.擴(kuò)增引物序列為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序.序列經(jīng)BioEdit軟件分析后,用NCBI-Blast進(jìn)行序列同源性比對,以小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)為外群,采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 DSE菌株動態(tài)生長特性觀察

將分離純化并鑒定的DSE菌株接種在PDA上28 ℃暗培養(yǎng),記錄其在固體培養(yǎng)基上的表觀動態(tài)生長特性;同時將DSE菌株接種在PDB(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液)中28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng),記錄其在液體培養(yǎng)基中的表觀動態(tài)生長特性,并取適量菌液在顯微鏡下定時鏡檢,記錄微觀動態(tài)生長特性.

2 結(jié)果與分析

2.1 DSE定殖狀況

鏡檢發(fā)現(xiàn),DSE菌絲通過侵染點從根尖部位侵入皮層細(xì)胞間隙生長 (圖1a),或延伸至皮層細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)菌絲 (圖1b).在根段表皮細(xì)胞中可見由膨大的菌絲緊密堆積形成的微菌核結(jié)構(gòu),顏色較深 (圖1c).在朝天委陵菜的250個供檢根樣中,有148個根樣出現(xiàn)DSE菌絲定殖現(xiàn)象,定殖率為59.2%;其中26個根樣含有DSE微菌核,定殖率為10.4%.

a.DSE菌絲侵染植物根系;b.DSE形成胞內(nèi)菌絲結(jié)構(gòu);c.DSE形成微菌核結(jié)構(gòu)圖中E為侵染點,h為菌絲,m為微菌核圖1 朝天委陵菜根部DSE菌株定殖結(jié)構(gòu)Fig.1 Dark septate endophyte structures formed in the root of Potentilla supina

2.2 DSE菌株分離純化

應(yīng)用組織分離法和菌絲尖端挑取法,從54個根樣中經(jīng)3次分離純化得到朝天委陵菜內(nèi)生真菌菌株共19株,編號分別為CTW-1至CTW-19,通過形態(tài)學(xué)觀察可將上述內(nèi)生真菌分為7個種類.依據(jù)菌落及菌體形態(tài)特征初步判斷CTW-3、CTW-6、CTW-7、CTW-9、CTW-10、CTW-12、CTW-14、CTW-15和CTW-17等9株內(nèi)生真菌為DSE真菌,其余10株內(nèi)生真菌菌落表面具有其他屬種的特征紋飾(梯田紋、同心輪紋、粉末狀、斑狀等),菌絲顏色較淺且無隔,均為非DSE真菌.與其他幾類內(nèi)生真菌相比,DSE真菌檢出頻率最高,表明DSE真菌是朝天委陵菜內(nèi)生真菌優(yōu)勢種.

2.3 CTW-9菌株形態(tài)學(xué)鑒定

從上述分離純化得到的DSE菌株中,選取生長狀況最為良好的CTW-9菌株進(jìn)行純培養(yǎng).該菌株在PDA上菌落初期為白色,成熟后呈褐色至黑色,菌絲暗色或褐色,較為粗壯,具橫隔,多分枝;分生孢子單生或鏈生,倒棍棒狀或紡錘狀,具有縱/斜隔和橫隔膜 (圖2).參考《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》等,發(fā)現(xiàn)CTW-9菌株的菌落及菌體特征與子囊菌門(Ascomycota)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、格孢腔菌目(Pleosporales)、格孢菌科(Pleosporaceae)、鏈格孢屬(Alternaria)真菌比較接近,初步將其歸為鏈格孢屬.

a.CTW-9菌株菌落形態(tài);b.CTW-9菌株菌絲形態(tài);c.CTW-9菌株分生孢子形態(tài)圖中h為菌絲,c為分生孢子圖2 CTW-9菌株形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of CTW-9

進(jìn)一步將CTW-9菌株的部分特征與鏈格孢屬真菌模式種細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)、鏈格孢(A.alternata)和危害較為廣泛的茄鏈格孢(A.solani)[10]等近似種進(jìn)行比較 (表1),發(fā)現(xiàn)其與A.alternata的形態(tài)特征最為相近,因此初步判斷CTW-9菌株為A.alternata.

表1 CTW-9菌株與其近似種的形態(tài)特征比較

2.4 CTW-9菌株的分子生物學(xué)鑒定

CTW-9菌株經(jīng)rDNA-ITS序列通用真菌引物PCR擴(kuò)增后,獲得的序列長度為541 bp (圖3a).將此序列與GeneBank中的已知序列進(jìn)行比對,以小孢根霉(R.microsporus,MT620751)為外群,選取相似度較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.經(jīng)NCBI-Blast比對和系統(tǒng)進(jìn)化特征分析表明 (圖3b),CTW-9菌株的rDNA-ITS序列與A.alternata聚合在同一支,且相似度均大于99%.結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,進(jìn)一步確定CTW-9菌株為鏈格孢(AlternariaalternataKeissler),GeneBank登錄號為MT451845.

a.CTW-9菌株rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物;b.CTW-9菌株rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖中Alternaria sp.為鏈格孢菌未定種,Pleosporales sp.為格孢腔菌未定種,Dothideomycetes sp.為子囊菌未定種,外群(outgroup)為小孢根霉(Rhizopus microsporus,MT620751)圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的CTW-9菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of CTW-9 based on rDNA-ITS sequences

2.5 CTW-9菌株動態(tài)生長特性

將CTW-9菌株分別在PDA上和PDB中培養(yǎng)并定時觀察,發(fā)現(xiàn)其均可正常生長并完成生活史,菌絲初期為白色,成熟后為深色.對PDB中培養(yǎng)的菌體定時鏡檢,發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)第3天,白色無隔菌絲卷曲纏繞形成空心菌絲球,漸變?yōu)槿辄S色至黃色,并形成哈氏網(wǎng)結(jié)構(gòu);第4天菌絲大量生長,第5天菌絲變?yōu)樯詈稚⒊霈F(xiàn)橫隔,其頂生或側(cè)生類似泡囊的卵圓形透明結(jié)構(gòu),分生孢子附近出現(xiàn)類似土生輔助細(xì)胞的結(jié)構(gòu);第6天分生孢子大量形成,具壁磚狀隔膜特征,分生孢子梗斷裂產(chǎn)生鏈?zhǔn)椒稚咦?類泡囊成熟破裂產(chǎn)生單生分生孢子 (圖4).

3 討論與結(jié)論

DSE是一類發(fā)現(xiàn)較早且分布廣泛的內(nèi)生真菌,與植物建立的“植物-DSE”共生體系從分子水平到個體水平都參與發(fā)揮生物學(xué)功能.在藥用植物中,DSE具有豐富的物種多樣性,劉燕等[11]從紅豆樹根圍分離得到5株DSE,其中AcrocalymmavagumD02菌株和Leptosphaeriasp.D04菌株均對紅豆樹幼苗具有促生作用;陳思杰[12]從枸杞根圍分離得到41株DSE,經(jīng)鑒定歸屬于6屬8種,其中CladosporiumcladosporioidesS12菌株等8株DSE對枸杞根腐病具有防治功效.本研究從朝天委陵菜根部分離純化出9株DSE,通過菌株的培養(yǎng)特性和菌體形態(tài)特征初步判斷,朝天委陵菜根部的DSE也具有物種多樣性跡象.

研究DSE在常規(guī)培養(yǎng)條件下的動態(tài)生長特性,有助于明確DSE對宿主植物的定殖過程,為優(yōu)化菌株培養(yǎng)方式提供實際參考.截至目前,有關(guān)DSE在常規(guī)培養(yǎng)條件下的動態(tài)生長特性鮮見報道.本研究較為系統(tǒng)地研究了CTW-9菌株的動態(tài)生長特性,在接種后的前3 d,菌種處于適應(yīng)階段(遲緩期),CTW-9菌株主要進(jìn)行營養(yǎng)攝取;4～6 d為菌種的生長階段(對數(shù)期),CTW-9菌株生長并積累黑色素;第6天后為菌種的生產(chǎn)階段(穩(wěn)定期),CTW-9菌株成熟和繁殖,產(chǎn)生大量分生孢子.這些結(jié)果將為后續(xù)優(yōu)化CTW-9菌株的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件,在確定時間段內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)菌絲體、分生孢子和次生代謝產(chǎn)物,以及為明確CTW-9菌株在朝天委陵菜根部的定殖過程和形成特殊結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確時間等方面提供實際參考.

微菌核是DSE的休眠繁殖結(jié)構(gòu),推測其與菌絲可以相互轉(zhuǎn)化,即在不利環(huán)境下,DSE菌絲緊密堆積形成微菌核;環(huán)境適宜時,微菌核重新萌發(fā)產(chǎn)生菌絲.O’Dell等[13]和Fernando等[14]分別在接種福廷瓶頭霉(Phialocephalafortinii)的扭葉松和垂柳根部發(fā)現(xiàn)哈氏網(wǎng)結(jié)構(gòu),并指出哈氏網(wǎng)是DSE與宿主植物進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)交換的場所.本研究在對CTW-9菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)菌絲通過形成透明無隔的哈氏網(wǎng)與PDB培養(yǎng)液建立營養(yǎng)關(guān)系,這與文獻(xiàn)[13]和文獻(xiàn)[14]的報道一致,因此認(rèn)為哈氏網(wǎng)是DSE與宿主植物形成共生體系的重要特征結(jié)構(gòu).本研究在純培養(yǎng)的CTW-9菌絲上首次觀察到大量類似泡囊的結(jié)構(gòu),能夠采取破裂的方式產(chǎn)生分生孢子,推測其可能是CTW-9菌株在一定時期內(nèi)的特化繁殖結(jié)構(gòu),而泡囊是由菌絲末端膨大形成的橢圓形結(jié)構(gòu),在AM真菌中較為常見,具有貯藏和繁殖功能[15].土生輔助細(xì)胞含有大量脂肪和內(nèi)容物,在真菌生活史中的作用尚不明確[15],本研究僅在純培養(yǎng)的CTW-9菌絲球內(nèi)部觀察到類似土生輔助細(xì)胞的結(jié)構(gòu),推測其能夠為分生孢子產(chǎn)生外延菌絲提供營養(yǎng).

A.alternata是一個普遍存在的真菌種,在印度西高止山脈的臭味假柴龍樹[16]、智利阿塔卡馬沙漠鹽湖的藜麥[17]、阿根廷潘帕斯草原的小麥[18]、中國西北地區(qū)的油蒿[19]等植物中也分離得到過.陳思杰[12]發(fā)現(xiàn)A.alternata是枸杞根系內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種,M1菌株能夠防治由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的枸杞根腐病;周兵等[20]通過研究A.alternataN菌株的次生代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)其對禾谷鐮孢菌(F.graminearum)引起的小麥赤霉病、稻瘟菌(Magnaporthegrisea)引起的水稻稻瘟病、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的油菜菌核病、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的煙草灰霉病和群生小穴殼(Dothiorellagregaria)引起的楊樹潰瘍病均產(chǎn)生不同程度的抑制效果;Devari等[21]從辣椒中分離出A.alternataFC-46菌株,其次生代謝產(chǎn)物alternariol-10-methyl ether對癌癥細(xì)胞具有抑制作用;盧丹丹等[22]從北桑寄生葉片中分離出A.alternataBS27菌株,其次生代謝產(chǎn)物alternariol-5-O-methyl ether和cis,cis-9,12- octadecadienoic acid對大腸桿菌(Escherichiacoli)等耐藥菌具有抑菌能力;Zhao等[23]從紫荊中分離出A.alternataZHJG5菌株,其次生代謝產(chǎn)物4-hydroxyalternariol-9-methyl ether、isotalaroflavone和verrulactone A對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)和稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)表現(xiàn)出明顯的抑菌活性,表明從不同宿主植物中分離得到的同一種DSE具有功能多樣性.有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌與藥用宿主植物協(xié)同進(jìn)化,能夠合成與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[24].朝天委陵菜在臨床上可用于治療糖尿病和細(xì)菌性痢疾,本研究中CTW-9菌株及其代謝產(chǎn)物與朝天委陵菜中藥用成分之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探討.