馬夢(mèng)楠,張鈺,李欣珂,劉進(jìn)寶,劉丹,郭懷忠,2

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院,河北 保定 071002;2.河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002)

玉屏風(fēng)方最早以散劑的形式記載于《丹溪心法》,由黃芪、白術(shù)(炒)和防風(fēng)三味藥材制備而成,具有補(bǔ)益肺衛(wèi)、祛風(fēng)散寒的功效[1],現(xiàn)代研究表明其還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[2-3].玉屏風(fēng)方常見劑型有顆粒劑、膠囊、口服液和散劑等,其中玉屏風(fēng)口服液生產(chǎn)廠家眾多,主要工藝是首先提取出防風(fēng)揮發(fā)油,再將三味藥材煎煮,濾液經(jīng)醇沉、濃縮后,添加防風(fēng)揮發(fā)油和輔料蔗糖混勻制得,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定黃芪甲苷的含量[4].該口服液中黃芪甲苷[5]、升麻素苷[6]和5-O-甲基維斯阿米醇苷[7]等成分的測(cè)定多有報(bào)道,有關(guān)顆粒劑等其他玉屏風(fēng)制劑的質(zhì)量研究也多集中于上述成分的測(cè)定[8-9].

玉屏風(fēng)多糖是一種復(fù)合多糖,作為玉屏風(fēng)方的主要藥效物質(zhì),與黃芪多糖、白術(shù)多糖和防風(fēng)多糖一樣,具有保肝、抗衰老、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等[10-13]多種活性.近年來,以多糖特征圖譜對(duì)單味藥材或單方制劑進(jìn)行質(zhì)量分析的研究逐漸增多.曹宇欣等[14]基于部分酸水解-親水作用色譜建立了黃芪多糖特征圖譜,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃芪寡糖相對(duì)峰面積差異較大,可用于不同產(chǎn)地黃芪藥材的鑒定.張建等[15-16]基于多糖部分降解圖譜先后對(duì)單方制劑板藍(lán)根顆粒和發(fā)酵蟲草菌粉進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)不同廠家樣品譜圖差異明顯,表明不同廠家產(chǎn)品質(zhì)量差異顯著.

單味藥材或單方制劑樣品指紋圖譜的對(duì)照譜圖,一般通過中位數(shù)法采用所有樣品的指紋圖譜生成,但中藥復(fù)方制劑中所采用藥材的來源不同可能會(huì)使不同廠家產(chǎn)品差異較大.本文嘗試對(duì)不同來源的黃芪、白術(shù)(炒)和防風(fēng)藥材按照正交設(shè)計(jì)原理進(jìn)行組合后制備模擬玉屏風(fēng)口服液,并綜合得到玉屏風(fēng)口服液多糖(YPF-P)特征降解譜對(duì)照譜圖,用于實(shí)際樣品中多糖成分質(zhì)量控制的參考,為中藥復(fù)方制劑多糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)行一定的方法學(xué)探索.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器、SHB-3型多用真空泵(保定高新區(qū)陽光科教儀器廠);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);XMTB型恒溫水浴鍋(余姚金電儀表有限公司);CL1020型高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司);BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);PHS-3C型酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠);L420型臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);CT15RT型高速冷凍離心機(jī)(天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司).

1.2 試藥

D-葡萄糖(Glu,天津市福晨化學(xué)試劑廠);D-核糖(Rib,北京博奧拓達(dá)科技有限公司);L-鼠李糖(Rha,合肥博美生物科技有限公司);D-阿拉伯糖(Ara)、D-甘露糖(Man)、D-半乳糖(Gal)、D-半乳糖醛酸(GalA)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,上海阿拉丁生物科技有限公司);硫脲、氫氧化鈉等均為分析純;水為純化水;玉屏風(fēng)口服液為市售,具體信息見表1.

表1 玉屏風(fēng)口服液樣品信息

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根,白術(shù)(炒)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz的干燥根莖,防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根,3味藥材均經(jīng)河北大學(xué)藥學(xué)院生物藥學(xué)教研室周程艷副教授鑒定,具體信息見表2.

表2 藥材信息

2 方法

2.1 電泳條件

未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(50 cm×50 μm i.d.,有效長(zhǎng)度41 cm);運(yùn)行緩沖液:40 mmol/L硼砂緩沖液(pH 10.1);檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;運(yùn)行電壓:10 kV;進(jìn)樣量:重力進(jìn)樣15 cm×20 s;柱溫:室溫.

2.2 YPF-P的提純

利用不同相對(duì)分子質(zhì)量糖類成分在一定溶劑中溶解度不同的原理,比較不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀得到Y(jié)PF-P,同時(shí)去除玉屏風(fēng)口服液輔料蔗糖的效果,發(fā)現(xiàn)采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇沉淀多糖得率高且可有效去除蔗糖的影響.具體操作如下:取玉屏風(fēng)口服液2.0 mL,體積分?jǐn)?shù)70%醇沉,4 ℃靜置過夜,4 000 r/min離心5 min,沉淀加適量水復(fù)溶,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,定容,搖勻,得YPF-P溶液.

2.3 YPF-P部分降解條件優(yōu)化

取上述YPF-P溶液2.0 mL,加入相應(yīng)濃度的鹽酸溶液2 mL,使反應(yīng)體系中的鹽酸達(dá)到目標(biāo)濃度,密封,在一定的溫度中降解一定時(shí)間,放冷,中和,加入5 mg/mL硫脲(內(nèi)標(biāo))溶液0.4 mL,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加水定容,搖勻,得YPF-P部分降解液.

取YPF-P部分降解液0.2 mL,置1.5 mL離心管中,加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液0.1 mL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液0.1 mL,混勻,70 ℃水浴30 min,放冷,加入0.3 mol/L鹽酸溶液0.1 mL中和,加入三氯甲烷1 mL,渦旋1 min,靜置1 min,12 000 r/min離心3 min,取上清液,按2.1項(xiàng)下電泳條件進(jìn)行測(cè)定,得樣品YPF-P特征降解譜.

2.4 模擬YPF-P特征降解譜的建立

玉屏風(fēng)口服液生產(chǎn)廠家眾多,3種原料藥材的來源往往不同.為考察相關(guān)差異和生成對(duì)照譜圖,取不同來源的黃芪、白術(shù)(炒)和防風(fēng)藥材各3批,設(shè)置為3個(gè)水平,見表3.借助正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組合的代表性,按L9(34)得到9種藥材組合,參考藥典工藝[4]制備模擬玉屏風(fēng)口服液,見表4.取各模擬口服液樣品2.0 mL,依照上述條件進(jìn)行YPF-P的提純、部分降解、衍生和測(cè)定,得到模擬樣品YPF-P特征降解譜.

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.5 YPF-P特征降解譜的應(yīng)用

測(cè)定樣品S1～S16的YPF-P特征降解譜并對(duì)其進(jìn)行聚類分析.

3 結(jié)果

3.1 YPF-P部分降解條件

部分降解條件單因素考察結(jié)果見圖1.由圖1可知,以峰數(shù)目和峰面積比(寡糖總峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比)為考察指標(biāo),鹽酸溶液濃度、溫度和時(shí)間對(duì)多糖部分降解的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),說明條件過弱使多糖降解不充分;條件過強(qiáng)時(shí)降解過于劇烈,得到寡糖較少.最佳降解條件為體系中鹽酸溶液濃度0.5 mol/L時(shí)80 ℃降解4 h.

圖1 鹽酸溶液濃度(a)、溫度(b)和時(shí)間(c)對(duì)多糖部分降解的影響Fig.1 Effects of hydrochloric acid concentration (a), temperature (b) and time (c) on partial degradation of polysaccharides

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 精密度

取模擬玉屏風(fēng)口服液(編號(hào)9),按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下電泳條件連續(xù)測(cè)定5次,以內(nèi)標(biāo)峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD.各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間的RSD為0.8%～2.6%,相對(duì)峰面積的RSD為1.2%～3.4%.

3.2.2 重復(fù)性

取模擬玉屏風(fēng)口服液(編號(hào)9),按2.4項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液,按2.1項(xiàng)下電泳條件測(cè)定,以內(nèi)標(biāo)峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD.各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間的RSD為0.5%～2.9%,相對(duì)峰面積的RSD為1.5%～4.2%.

3.2.3 穩(wěn)定性

取模擬玉屏風(fēng)口服液(編號(hào)9),按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下電泳條件,分別于0、2、4、8、16、24 h測(cè)定,以內(nèi)標(biāo)峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD.各共有峰相對(duì)遷移時(shí)間的RSD為1.1%～3.9%,相對(duì)峰面積的RSD為1.8%～4.7%.

方法學(xué)考察結(jié)果表明:該方法的精密度、重復(fù)性均良好,且供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

3.3 模擬樣品YPF-P特征降解譜的測(cè)定

用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)模擬樣品YPF-P特征降解譜進(jìn)行分析,以編號(hào)9對(duì)應(yīng)的圖譜為參照,多點(diǎn)匹配后得到特征降解譜及對(duì)照?qǐng)D譜R見圖2.由圖2可知,9批樣品除內(nèi)標(biāo)和PMP峰外共19個(gè)共有峰,1～13號(hào)為寡糖峰,14～19號(hào)為單糖峰,通過添加單一單糖對(duì)照品確定14～19分別為Glu、Rib、Rha、Man、Gal和GalA,Ara的遷移時(shí)間與14號(hào)峰Glu相近且二者含量均較高,未能被很好地分離.模擬樣品特征降解譜提示,不同來源藥材組合所得YPF-P特征降解譜的基本輪廓不盡相同,提示在工藝穩(wěn)定的情況下,由不同來源藥材生產(chǎn)的玉屏風(fēng)口服液的多糖質(zhì)量很可能本身即存在顯著差異.

圖2 模擬玉屏風(fēng)口服液多糖特征降解譜Fig.2 Characteristic degradation profiles of polysaccharides in simulated Yupingfeng oral liquids

以內(nèi)標(biāo)峰為參照,計(jì)算9批口服液樣品中各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為35.6%～87.9%,波動(dòng)較大.各模擬樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度計(jì)算結(jié)果見表5,相似度為0.287～0.986.綜上表明:各模擬口服液中多糖含量和組成差異較大.

表5 相似度計(jì)算數(shù)據(jù)

相似度計(jì)算結(jié)果表明:對(duì)照?qǐng)D譜與各樣品的相似度整體上高于樣品之間的相似度,表明對(duì)照?qǐng)D譜具有較高的代表性,可用于市售口服液樣品YPF-P成分的質(zhì)量控制.

3.4 玉屏風(fēng)口服液YPF-P特征降解譜的測(cè)定

不同廠家玉屏風(fēng)口服液代表性YPF-P特征降解譜如圖3所示(省略3個(gè)批次).由圖3a可知,同一廠家不同批次YPF-P特征降解譜基本相同,表明同一廠家的生產(chǎn)工藝和原藥材選取較為穩(wěn)定.由圖3b可知,不同廠家口服液樣品譜峰差異明顯,表明產(chǎn)品質(zhì)量從多糖角度評(píng)價(jià)差異較大,推測(cè)原因可能主要是不同廠家使用的原料藥材來源不同.此外,玉屏風(fēng)口服液的生產(chǎn)工藝中并未標(biāo)明具體的醇沉濃度,只規(guī)定了“加適量乙醇使沉淀”,因此推測(cè)不同廠家也可能在生產(chǎn)中使用了不同的醇沉濃度,有關(guān)情況尚待探討.

圖3 2個(gè)廠家不同批次(a)和不同廠家(b)YPF-P特征降解譜Fig.3 Characteristic degradation profiles of YPF-P from different batches of the same manufacturer (a) and different manufacturers (b)

3.5 聚類分析

采用SPSS 26.0軟件,以樣品YPF-P特征降解譜中相應(yīng)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為變量,選用組間連接和夾角余弦法進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖4.由圖4可知,S1～S6、S7～S11兩個(gè)廠家的產(chǎn)品可以很好地各自聚為一類,表明其各批次產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定.總體來看,所有樣品聚為2大類,S1～S6、S7～S11和S17(對(duì)照?qǐng)D譜)聚為一類,其余樣品聚為一類.結(jié)合圖3發(fā)現(xiàn),S1～S6、S7～S11和S17的多糖特征降解譜中各峰較為明顯,而S12～S16的寡糖和一些單糖的含量均很低,提示該口服液的生產(chǎn)中,應(yīng)對(duì)原料藥材的選取和生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定給予足夠重視.

圖4 玉屏風(fēng)口服液聚類分析Fig.4 Cluster analysis of Yupingfeng oral liquids

4 討論

本文在其他條件一致的情況下,發(fā)現(xiàn)酸種類對(duì)YPF-P的部分降解效果有顯著影響.通過對(duì)硫酸、鹽酸、三氟乙酸和甲酸進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)使用鹽酸時(shí)得到的多糖部分降解峰更豐富,譜圖特征性更強(qiáng),操作方便,可控性好,故最終選擇鹽酸.

同一中藥因來源、炮制和生產(chǎn)工藝等因素的差異,使其質(zhì)量一致性和臨床療效的穩(wěn)定性受到影響.鑒于玉屏風(fēng)口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)其多糖成分進(jìn)行控制,且發(fā)現(xiàn)多批次實(shí)際樣品中多糖成分含量差異顯著,標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖生成采用樣品特征降解譜圖的合理性欠佳.本文嘗試采用正交設(shè)計(jì)原理,組合不同來源藥材制備模擬玉屏風(fēng)口服液樣品,最終得到Y(jié)PF-P特征降解對(duì)照譜圖用于樣品質(zhì)量分析,并基于YPF-P特征降解譜建立了一種該藥品的專屬性鑒別方法,結(jié)合聚類分析,從多糖角度為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考,有助于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善.

針對(duì)不同來源藥材所含成分不同的客觀現(xiàn)象,制劑生產(chǎn)中可以采用“勾兌”的辦法來保證終產(chǎn)品質(zhì)量的一致性,該技術(shù)在銀杏葉制劑金納多的生產(chǎn)中已有成功應(yīng)用,但應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑保證其質(zhì)量一致性會(huì)面臨更多挑戰(zhàn)[17].如何科學(xué)地獲取和應(yīng)用中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑開展中藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)工作,將是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥傳承和發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵.