劉廣興,韓曉利,李昳晴,王庭欣

(河北大學(xué) 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院,計(jì)量?jī)x器與系統(tǒng)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,河北省能源計(jì)量與安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌),河北 保定 071002)

2-(三氟甲基)吩噻嗪(2- (trifluoromethyl) phenothiazine,TFPTZ),又名三氟拉嗪主環(huán),是一種人工合成的吩噻嗪類(lèi)鎮(zhèn)靜劑,在常溫下為淡黃色粉末,分子式為C13H8F3NS,相對(duì)分子質(zhì)量為267.27,TFPTZ通常用于治療精神疾病,也可作為三氟拉嗪、氟奮乃靜的中間體.對(duì)動(dòng)物具有鎮(zhèn)靜催眠、消除狂躁不安的作用.在飼料或飲用水中違法添加TFPTZ可以使禽畜快速增重、縮短出欄時(shí)間[1].在動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中使用TFPTZ還可以減少體重下降和防止肉品質(zhì)降低,但殘留在動(dòng)物源食品中的TFPTZ及其代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響,嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康.根據(jù)文獻(xiàn)[2]要求,氯丙嗪、地西泮等僅允許治療使用,動(dòng)物源食品中不得檢出.國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟、澳大利亞等國(guó)家和組織均對(duì)鎮(zhèn)靜劑的最高限量值作出了規(guī)定.目前禽畜養(yǎng)殖行業(yè)中仍有一些不法分子使用TFPTZ獲取利益,為確保動(dòng)物源食品安全,亟需開(kāi)發(fā)一種快速定量分析動(dòng)物源食品中TFPTZ殘留量的檢測(cè)方法.

目前鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)通常采用色譜分析方法,如朱礫等[3]建立了反相高效液相色譜法測(cè)定血液中氯丙嗪的濃度,cerkvenik-flajs[4]建立了豬腎臟組織中哌氟苯丁酮?dú)埩舻囊合嗌V檢測(cè)方法,馮靜等[5]建立了牛肉中16種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,譚貴良等[6]采用氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定臘腸中7種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留.上述儀器檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確度較高,但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻,樣品處理也比較煩瑣,不適合大量樣本的快速篩查.基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的酶聯(lián)免疫分析方法效率高、特異性好、成本低,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品藥品的快速檢測(cè)[7].本研究設(shè)計(jì)合成了TFPTZ完全抗原,通過(guò)免疫新西蘭大耳白兔獲得了多克隆抗體,建立了快速檢測(cè)豬肉中TFPTZ的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法(Ic-ELISA),該方法操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高,滿(mǎn)足現(xiàn)行的鎮(zhèn)靜劑殘留分析要求,為動(dòng)物源性食品中的TFPTZ殘留檢測(cè)提供了一種新方法.

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大耳白兔(保定全友養(yǎng)兔廠);生鮮豬肉(保定惠友超市);2-(三氟甲基)吩噻嗪、氯丙嗪、美喹他嗪、奮乃靜、甲硫達(dá)嗪、三氟拉嗪(分析純,上海源葉生物科技有限公司);卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich);酶標(biāo)二抗(CW0103S)(康為世紀(jì)生物科技有限公司);對(duì)氨基苯甲酸、1,4-二氧六環(huán)、N,N-二甲基甲酰胺(分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司);亞硝酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三乙胺、氯甲酸異丁酯(分析純,天津匯杭化工科技有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司).

1.2 儀器

Model 680酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司,美國(guó));1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,美國(guó));T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);FC5718R冷凍離心機(jī)(Chaus公司,德國(guó));Molatom 18100純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器).

1.3 方法

1.3.1 半抗原的合成

稱(chēng)取對(duì)氨基苯甲酸13.7 mg于10 mL離心管內(nèi),加1 mL超純水,用1.2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,冰浴10 min,振蕩3 min使其溶解,緩慢滴加1 mol/L的亞硝酸鈉溶液100 μL,溶液顏色由無(wú)色變?yōu)榈S色,4 ℃靜止30 min.加入26.73 mg TFPTZ,溶液由淡黃色變?yōu)樯罴t色,25 ℃ 1 800 r/min振蕩12 h,得到紅褐色液體為半抗原(TFPTZ)[8],合成過(guò)程見(jiàn)圖1.

圖1 半抗原合成路線(xiàn)Fig.1 Hapten synthesis route

1.3.2 完全抗原的合成與鑒定

溶液A:半抗原中加入1 mL 1,4-二氧六環(huán)和1 mLN,N-二甲基甲酰胺,振蕩2 min,加入26.5 μL三乙胺,冰浴10 min,加入16 μL氯甲酸異丁酯,25 ℃振蕩30 min.溶液B:量取2 mL 0.01 mol/L的硼酸鹽溶液,加入12 mg OVA或BSA.將溶液A、B混合,4 ℃振蕩12 h.將產(chǎn)物在0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中透析72 h,每12 h更換1次PBS,透析完成后得到偶聯(lián)產(chǎn)物[9](完全抗原),合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2.將偶聯(lián)原料與偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行紫外吸收光譜掃描鑒定和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,-20 ℃下分裝保存.

圖2 完全抗原合成路線(xiàn)Fig.2 Complete antigen synthesis route

1.3.3 Ic-ELISA方法的建立

抗原包被:用包被液(0.01 mol/L碳酸鹽緩沖溶液)將完全抗原稀釋后包被到酶標(biāo)板上,每孔150 μL,37 ℃ 孵育1 h,包被液傾出,每孔加入200 μL PBST洗液,靜止1 min,傾去洗液,拍干,重復(fù)洗板3次.封閉:每孔加入150 μL封閉液,37 ℃ 孵育1 h,洗板3次.競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng):每孔加入75 μL用PBS稀釋16 000倍的多克隆抗體和75 μL稀釋后的TFPTZ標(biāo)準(zhǔn)品,37 ℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1 h,傾去酶標(biāo)板中的液體,洗板3次.每孔加入150 μL稀釋2 000倍的酶標(biāo)二抗,37 ℃ 孵育1 h,洗板3次[10].顯色:每孔加入150 μL TMB單組分顯色劑,37 ℃ 反應(yīng)20 min.加入終止液(體積分?jǐn)?shù)10% 硫酸)50 μL,上機(jī)測(cè)定OD450[11].

1.3.4 Ic-ELISA工作條件的優(yōu)化

采用方陣法確定最佳的包被抗原質(zhì)量濃度和多克隆抗體稀釋倍數(shù),再根據(jù)陰性孔OD450、半抑制濃度(IC50)和OD450/IC50分別對(duì)包被條件、封閉液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[12],參照表1采取單一變量原則,按照1.3.3方法進(jìn)行.

表1 優(yōu)化項(xiàng)目及設(shè)定值

1.3.5 Ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

按1.3.3優(yōu)化條件,將TFPTZ標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(10.00,5.00,2.50,1.00,0.50,0.25,0.10 μg/L),每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次.以O(shè)D450為縱坐標(biāo),以TFPTZ質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),用Origin軟件進(jìn)行線(xiàn)性擬合,計(jì)算TFPTZ的IC50、線(xiàn)性范圍(IC20～I(xiàn)C80)和最低檢測(cè)限(IC10)[13].

1.3.6 方法特異性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

選擇5種吩噻嗪類(lèi)鎮(zhèn)靜劑進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn),分別繪制每種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到5種藥品的IC50并計(jì)算出與TFPTZ的交叉反應(yīng)率[14]:

設(shè)置6個(gè)TFPTZ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(1.0,2.5,5.0,10.0,20.0,40.0 μg/L),在不同的時(shí)間里進(jìn)行6次完全相同的重復(fù)測(cè)定,計(jì)算變異系數(shù),評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性.

1.3.7 實(shí)際樣品檢測(cè)及高效液相色譜(HPLC)驗(yàn)證

鮮豬肉去脂肪后做成肉糜,分別取20 g,加入4 mL不同質(zhì)量濃度(5.0,12.5,25.0,50.0 ng/mL)的TFPTZ標(biāo)準(zhǔn)品,加入20 mL乙腈和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% 氫氧化鈉溶液,振蕩2 min,超聲10 min,4 000 r/min離心5 min,吸取2 mL上清液,氮?dú)獯蹈?用PBS稀釋至1 mL,按步驟1.3.3將樣品的檢出值乘以稀釋倍數(shù),即為Ic-ELISA方法測(cè)得的豬肉樣品中TFPTZ含量.HPLC驗(yàn)證在安捷倫1260系統(tǒng)上進(jìn)行,選用安捷倫ZORBAX SB-C18分析色譜柱,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.2%的甲酸水溶液,洗脫液體積比為9∶1,25 ℃下流速為0.2 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原的鑒定

TFPTZ、OVA和偶聯(lián)產(chǎn)物(OVA-TFPTZ)的紫外吸收光譜如圖3所示.由圖3可知,OVA和TFPTZ的最大吸收峰分別在280 nm和322 nm,OVA-TFPTZ的最大吸收峰則出現(xiàn)在286 nm,而且在330 nm也存在吸收峰,其光譜曲線(xiàn)明顯區(qū)別于TFPTZ和OVA.在聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定實(shí)驗(yàn)中,蛋白質(zhì)的遷移速率取決于相對(duì)分子質(zhì)量.如圖4所示:偶聯(lián)產(chǎn)物(BSA-TFPTZ)的移動(dòng)距離小于BSA,且有明顯的拖尾現(xiàn)象,推斷BSA-TFPTZ分子質(zhì)量比BSA大.由以上兩點(diǎn)可以判定藥物小分子與載體蛋白偶聯(lián)成功.

圖3 OVA、TFPTZ、OVA-TFPTZ的紫外光譜Fig.3 UV spectrum of OVA、TFPTZ and OVA-TFPTZ

圖4 BSA、BSA-TFPTZ的電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic map of BSA、BSA-TFPTZ

2.2 Ic-ELISA工作條件的優(yōu)化

方陣法測(cè)定OD450結(jié)果見(jiàn)表2,由表2可知:當(dāng)包被抗原質(zhì)量濃度較低時(shí),多克隆抗體稀釋倍數(shù)變化對(duì)OD450影響不大,此時(shí)靈敏度不高.在保證實(shí)驗(yàn)性能和節(jié)約藥品的原則下應(yīng)選擇OD450為0.994時(shí)所對(duì)應(yīng)的包被抗原質(zhì)量濃度和多克隆抗體稀釋倍數(shù),故最佳的包被抗原質(zhì)量濃度為1.250 μg/mL,多克隆抗體稀釋16 000倍.

表2 方陣法測(cè)定結(jié)果

包被條件、封閉液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果如圖5～8所示,當(dāng)IC50越小、OD450/IC50越大時(shí)靈敏度越高,方法的性能越好.故包被條件為37 ℃、3 h,封閉液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的BSA,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含體積分?jǐn)?shù)10% DMSO的PBS,競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為60 min.

圖5 不同包被條件的OD450、IC50和OD450/IC50Fig.5 OD450、IC50 and OD450/IC50 for different coating conditions

圖6 不同封閉液的OD450、IC50和OD450/IC50Fig.6 OD450、IC50 and OD450/IC50 of different sealing fluids

PBS甲醇和PBSDMSO分別表示含體積分?jǐn)?shù)10%甲醇和體積分?jǐn)?shù)10%DMSO的PBS圖7 不同標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的OD450、IC50和OD450/IC50Fig.7 OD450、IC50 and OD450/IC50 of different standard diluents

圖8 不同競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間下的OD450、IC50和OD450/IC50Fig.8 OD450、IC50 and OD450/IC50 under different competitive response times

2.3 Ic-ELISA方法的建立

2.3.1 建立Ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖9,以lg[ρ(TFPTZ)/(μg·mL-1)]為自變量X,以O(shè)D450為因變量Y建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程Y=0.594 83-0.496 49X,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1,IC50為1.500 2 μg/L,IC10為0.284 1 μg/L,IC20～I(xiàn)C80為0.430 7～5.225 2 μg/L.

圖9 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.9 Indirect competition ELISA standard curve

2.3.2 特異性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

多克隆抗體對(duì)5種吩噻嗪類(lèi)鎮(zhèn)靜劑的交叉反應(yīng)率如表3,與氯丙嗪的交叉反應(yīng)率為1.20%,奮乃靜為0.61%,其余3種藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.1%,說(shuō)明制備的多克隆抗體特異性強(qiáng).穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如表4,批內(nèi)變異系數(shù)為1.477%～5.679%,批間變異系數(shù)為2.573%～12.476%,顯示本方法精密度良好.

表3 特異性評(píng)價(jià)

2.3.3 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)及HPLC驗(yàn)證

HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖10,以峰面積為縱坐標(biāo)Y,以TFPTZ質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X,擬合方程為Y=79.722X-192.842,R2為0.994 7,可用于驗(yàn)證Ic-ELISA方法的準(zhǔn)確性.Ic-ELISA法和HPLC法對(duì)豬肉中添加TFPTZ的回收率結(jié)果如表5, 2種方法檢測(cè)結(jié)果的Pearson相關(guān)性分析為0.995 9,說(shuō)明Ic-ELISA法與HPLC法的檢測(cè)結(jié)果高度一致,建立的快速檢測(cè)豬肉中TFPTZ的Ic-ELISA方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠.

圖10 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.10 HPLC standard curve

表5 豬肉中TFPTZ添加回收率

3 討論

目前Ic-ELISA方法已成為獸藥殘留最理想的檢測(cè)技術(shù)之一,而建立高靈敏Ic-ELISA方法的關(guān)鍵在于制備出效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗體.半抗原和完全抗原的設(shè)計(jì)及合成是關(guān)鍵的開(kāi)端,影響小分子和載體蛋白偶聯(lián)的因素有很多:小分子的結(jié)構(gòu)、中間反應(yīng)、活性基團(tuán)的引入位置、連接臂的長(zhǎng)度、載體的選擇、連接的位置等[16].TFPTZ的分子質(zhì)量小于10 ku,不具備免疫原性,也沒(méi)有可以直接與載體蛋白連接的活性基團(tuán),因此TFPTZ修飾后才可以與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原,刺激動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng).遵循不產(chǎn)生新的抗原決定簇、性質(zhì)穩(wěn)定、能刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠抗體、簡(jiǎn)單易行的原則,TFPTZ的特征基團(tuán)應(yīng)盡可能地暴露在人工抗原的表面,免疫系統(tǒng)一般對(duì)遠(yuǎn)離載體端的結(jié)構(gòu)識(shí)別能力較強(qiáng)[17].本研究采用偶氮苯甲酸法通過(guò)引入羧基作為連接臂的結(jié)合位點(diǎn)合成了免疫原和包被原,通過(guò)Ic-ELISA法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)達(dá)到了1∶16 000.

Ic-ELISA方法的性能受包被抗原質(zhì)量濃度、多抗稀釋倍數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間等多種因素的影響,優(yōu)化反應(yīng)條件是建立高靈敏度Ic-ELISA檢測(cè)方法的重要一步.廖文彬[18]報(bào)道包被抗原質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)限變高的問(wèn)題,包被抗原質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)又會(huì)出現(xiàn)靈敏度下降的弊端,這與本研究方陣法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在確保檢測(cè)限和靈敏度都較好的情況下確定了包被抗原質(zhì)量濃度為1.250 μg/mL,多克隆抗體稀釋16 000倍.包被條件優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)37 ℃包被3 h與4 ℃包被過(guò)夜的效果幾乎相同,但37 ℃包被3 h所需時(shí)間更少,適當(dāng)提高溫度可以加快抗原抗體的結(jié)合速率.標(biāo)準(zhǔn)品大多為有機(jī)化合物,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中通常會(huì)加入部分有機(jī)溶劑以增加其溶解度,這就導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液會(huì)直接影響標(biāo)準(zhǔn)品的溶解度、抗體活性以及實(shí)際樣品的提取效率等,為了減少標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的非特異性干擾,需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中的有機(jī)溶劑進(jìn)行優(yōu)化.目前常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈和乙酸乙酯等[19-20],本實(shí)驗(yàn)中甲醇的效果較差,有報(bào)道稱(chēng)甲醇會(huì)使抗體失活[21],導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行,DMSO的效果較好,推測(cè)是由于DMSO良好的助溶性和低毒性使得競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)到最優(yōu).

本研究通過(guò)優(yōu)化Ic-ELISA工作條件進(jìn)而建立了定量分析豬肉中TFPTZ的Ic-ELISA方法.該方法的IC50為1.500 2 μg/L,線(xiàn)性范圍為0.430 7～5.225 2 μg/L,最低檢測(cè)限為0.284 1 μg/L.特異性測(cè)試中與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物均無(wú)明顯交叉反應(yīng),說(shuō)明本方法發(fā)生假陽(yáng)性,錯(cuò)檢的概率較低.穩(wěn)定性測(cè)試中批內(nèi)變異系數(shù)小于6%,批間變異系數(shù)小于13%,由于樣本差異、前處理方法、操作習(xí)慣等都會(huì)影響Ic-ELISA方法的穩(wěn)定性[22],多數(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中變異系數(shù)要求在15%以?xún)?nèi)即可滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求.豬肉中添加TFPTZ標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為93.26%～109.13%,變異系數(shù)小于6%,本方法與HPLC方法的檢測(cè)結(jié)果高度一致.綜上結(jié)果說(shuō)明,本研究建立的Ic-ELSA方法準(zhǔn)確度高,特異性好,檢測(cè)限低,線(xiàn)性范圍寬,適用于豬肉中TFPTZ殘留的快速定量檢測(cè),同時(shí)也為開(kāi)發(fā)其他藥物殘留檢測(cè)方法提供了新的技術(shù)思路.