李亞芹,劉毅,王瀟偉,崔紅根,康世鑫,徐占穩(wěn)

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河北 保定 071000)

心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展到嚴(yán)重階段或晚期的一種臨床綜合征,心衰患者由于需要反復(fù)住院,增加了患者及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命.如何提高患者生活質(zhì)量,延緩心衰的進(jìn)展是心衰治療的關(guān)鍵問題.心力衰竭的病理基礎(chǔ)是各種原因?qū)е碌男氖抑貥?gòu),發(fā)生機制為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)的長期過度激活,同時炎癥因子的過度分泌以及心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加是加重心衰的主要原因[1].沙庫巴曲纈沙坦鈉(LCZ696)是由血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑及腦啡肽酶抑制劑前體以 1∶1 (物質(zhì)的量比)組成,兩者協(xié)同發(fā)揮作用,明顯降低心衰住院率[2-3],LCZ696于 2015 年 7 月獲美國 FDA 批準(zhǔn)上市,2018年應(yīng)用于中國,目前對LCZ696的研究多為臨床上改善心衰癥狀方面,對其抑制心室重構(gòu)的分子機制尚不明確,基于此,本研究通過給予心衰大鼠LCZ696治療,與纈沙坦對比,觀察對心衰大鼠心功能及心臟結(jié)構(gòu)的影響,探討其改善心室重構(gòu)、治療心衰的作用機制,為其臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性sprague dawley(SD) 大鼠30 只,6 周齡,SPF級,體質(zhì)量200 g左右,由北京斯貝福生物科技有限公司提供【合格證號SCXK(京)2019-0010】,飼養(yǎng)在河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級動物室,適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實驗,嚴(yán)格遵守實驗動物保護(hù)條例,實驗操作均已經(jīng)過河北大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn).

1.2 材料與儀器

注射用鹽酸阿霉素(10 mg/支)(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);沙庫巴曲纈沙坦鈉(100 mg/片)(諾華制藥);纈沙坦(80 mg/片)(諾華制藥);BNP ELISA 試劑盒(江蘇晶美生物科技公司);RIPA裂解液(北京索來寶公司);一抗Bax(武漢三鷹公司);Cleaved-caspase-3(英國Affinity公司);內(nèi)參(中杉金橋公司);二抗Bax(中杉金橋公司);PVDF膜(法國Millipore公司);X射線膠片(加拿大Carestream公司);蛋白濃度定量儀(德國Eppendorf公司);電泳儀(北京君意公司);石蠟切片機(德國Leica公司);光學(xué)顯微鏡(日本OlymPus公司);COBAS6000型全自動生化儀(德國羅氏診斷公司);小動物超聲儀(飛利浦公司);無創(chuàng)血壓檢測儀(美國Kent公司).

1.3 動物模型的構(gòu)建及實驗分組

6周齡的SD大鼠30只,首先在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周,然后隨機取5只做為空白組(Control),另外25只用于構(gòu)建心衰模型:將鹽酸阿霉素用生理鹽水配成1.0 mg/mL的溶液,大鼠稱體質(zhì)量,按總劑量15.0 mg/kg,將鹽酸阿霉素溶液分6次進(jìn)行大鼠腹腔注射,每周2次,共3周.Control組大鼠注射等量的生理鹽水.給藥期間觀察大鼠進(jìn)食活動情況及死亡情況,末次給藥2周后,用小動物超聲儀對大鼠進(jìn)行心臟超聲檢查,評估Control組和心衰模型組大鼠的心功能和結(jié)構(gòu)情況,結(jié)果顯示:20只大鼠左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)顯著高于Control組,短軸縮短率(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)顯著低于對照組(P<0.05),模型構(gòu)建成功[4-6],另外3只未達(dá)此標(biāo)準(zhǔn),死亡2只.將建模成功的20只大鼠隨機分為心衰組(HF)、纈沙坦組(Val)和LCZ696低劑量組(LCZ-L)、LCZ696高劑量組(LCZ-H),每組 5 只.Control組大鼠給予生理鹽水灌胃(2 mL/次,2次/日),Val組(按標(biāo)準(zhǔn)服用方法)以8.4 mg/kg溶于 2 mL 生理鹽水中灌胃(1次/d); LCZ-L組、LCZ-H組使用LCZ696分別按10 mg/kg和20 mg /kg溶于 2 mL 生理鹽水中灌胃( 2 次/d),給藥8周后檢測相關(guān)指標(biāo).

1.4 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食及活動情況的監(jiān)測及觀察

每周稱量大鼠體質(zhì)量,同時觀察各組大鼠進(jìn)食及活動情況.

1.5 大鼠血壓及心臟功能的檢測

分別在藥物灌胃治療后第2、4、6、8周運用無創(chuàng)尾套動脈血壓測試法測量血壓:首先加熱測試箱的溫度至35 ℃,然后對尾部加熱 5～10 min后,固定脈搏換能器,實驗對象安靜后,打開脈搏換能器,等待脈搏波的出現(xiàn)并穩(wěn)定后開始測試,每次測試間隔 2 min,每只大鼠測6～8次,取平均值.通過配套軟件在電腦上獲取收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動脈壓(MAP)及心率(HR)數(shù)據(jù).

藥物灌胃治療8周后用小動物超聲儀對大鼠心臟功能進(jìn)行檢查.首先用10 g/L戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位將大鼠固定于超聲檢測板上,將大鼠心前區(qū)毛發(fā)脫凈,使用M 型超聲探頭連續(xù)測量5 個心動周期.記錄各組大鼠LVEDD、LVEF、FS數(shù)值.

1.6 血清生化指標(biāo)分析

大鼠麻醉后眼球取血,離心取血清,全自動生化儀檢測血清中CK-MB、CK、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量;ELISA法檢測大鼠血清BNP水平(按檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行).

1.7 心臟外觀、心臟質(zhì)量指數(shù)和心肌HE染色、心肌細(xì)胞Tunel染色

處死大鼠,取出心臟,分離后稱其質(zhì)量,計算心臟質(zhì)量指數(shù)(心臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量),并進(jìn)行各組心臟標(biāo)本比較;取大鼠左心室部位心肌組織,經(jīng)福爾馬林溶液固定、石蠟包埋后切片,常規(guī)HE染色后,顯微鏡下觀察組織病理及纖維化程度.將各組大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行Tunel染色,觀察心肌細(xì)胞凋亡情況.

1.8 Western blot 檢測大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

將大鼠麻醉后處死,迅速取出心臟,取左心室心肌組織處理后過夜裂解,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液備用,測定蛋白濃度,制備SDS-PAGE凝膠,根據(jù)蛋白定量結(jié)果,加入緩沖液,輕輕混合,95 ℃變性10 min后進(jìn)行電泳,凝膠電泳結(jié)束后,將凝膠上分離到的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至固相支持物上,然后分別用一抗及二抗對其進(jìn)行孵育、檢測,用PBST 洗膜3次,洗去游離二抗,混合液均勻鋪在PVDF膜表面,適當(dāng)曝光,經(jīng)顯影定影液顯色,然后進(jìn)行二次曝光,將膠片掃描后,用Tanon Gis軟件測定條帶灰度值.

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間均采用單因素方差分析進(jìn)行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 小動物超聲檢測大鼠心功能的變化

喂養(yǎng)過程中LCZ-H組及HF組大鼠分別死亡1只.

藥物灌胃治療8周后實驗結(jié)束,隨即進(jìn)行小動物超聲檢測:與Control組相比,HF組大鼠左心功能指標(biāo)LVEDD增加,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LVEF及FS顯著降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與HF組大鼠相比,Val組及LCZ-L組LVEDD下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義,LCZ-H組LVEDD下降,有統(tǒng)計學(xué)意義;與HF組相比,Val組、LCZ-L組、LCZ-H組LVEF升高,有統(tǒng)計學(xué)意義;與HF組相比,Val組 FS升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義,LCZ-L組、LCZ-H組FS升高,有統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果見圖 1.

與Control組比較,*P<0.05; 與HF組比較,#P<0.05,##P< 0.01圖1 大鼠心臟功能指標(biāo)的超聲結(jié)果Fig.1 Ultrasound results of cardiac function indicators in rats

2.2 大鼠體質(zhì)量、平均動脈血壓、心率的變化

與Control相比,HF組大鼠體質(zhì)量下降,HR顯著升高,MAP下降,這些數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).治療后,與HF組相比,Val組及LCZ-L組 MAP變化無統(tǒng)計學(xué)意義,HR有所下降,大鼠體質(zhì)量增加,但均無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與HF組相比,LCZ-H組 MAP 有所升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),HR明顯下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與HF大鼠相比,LCZ-L、LCZ-H組體質(zhì)量有所增加,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖2).

與Control組比較,*P<0.05; 與HF組比較,#P<0.05圖2 大鼠平均動脈壓、體質(zhì)量及心率變化Fig.2 Changes of MAP、weight and HR in rats

2.3 大鼠血清生化指標(biāo)及BNP、CK-MB的變化

Control組血清中CK-MB、CK、ALT、AST、BNP的含量均低于HF組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與HF相比,Val組和LCZ-L、LCZ-H組上述各指標(biāo)均下降,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).其中LCZ-H組降低最明顯(P<0.01),Val組與LCZ-L組之間上述指標(biāo)數(shù)值無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3).

比如按國家計劃，某部委安排某央企從事一項業(yè)務(wù)，但該業(yè)務(wù)在國資委確定的企業(yè)主業(yè)以外，這個央企該不該做？重大事件發(fā)生時，國家責(zé)令某交通企業(yè)派飛機執(zhí)行任務(wù)，但這影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，國資委年底考核時企業(yè)分?jǐn)?shù)下降，企業(yè)該怎么辦？類似的矛盾幾乎每年都發(fā)生。還有一些沖突，原因是國資委本身的角色上它既是企業(yè)股東大會，又是國家任命來監(jiān)管企業(yè)的行政機關(guān)。比如派遣工，股東大會為央企著想，當(dāng)然是各類成本越低越好，派遣工肯定能降低人力成本啊，但問題要是提上國家議事日程，國資委得搖身一變，成為負(fù)責(zé)解決問題的主管部門。

與Control組比較,*P<0.05;與HF組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 大鼠血清生化指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of serum biochemical parameters in rats

2.4 大鼠心肌組織HE病理分析結(jié)果

大鼠心肌組織HE染色,細(xì)胞核為藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)、纖維結(jié)締組織為粉紅色;Control組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊;HF組大鼠心肌細(xì)胞破壞,細(xì)胞核排列紊亂、大小不一,大量心肌細(xì)胞被破壞,可見較多膠原纖維增生;Val組大鼠心肌組織排列較HF組稍顯規(guī)整,其間伴少量膠原纖維組織增生;LCZ-L、LCZ-H組心肌細(xì)胞排列規(guī)整,膠原纖維組織明顯減少,且LCZ-H膠原纖維增生較LCZ-L有所減輕(圖4).

圖4 大鼠心肌損傷的組織病理學(xué)分析(400×)Fig.4 Histopathological analysis of myocardial injury in rats(400×)

2.5 大鼠心肌細(xì)胞Tunel染色觀察

正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)黑色,凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光,可見Control組心肌凋亡細(xì)胞罕見,與Control組相比,HF組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,治療后,Val組和LCZ-L、LCZ-H組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較HF組減少,且LCZ-L、LCZ-H組減少程度較Val組明顯,LCZ-H組最明顯,400倍顯微鏡下隨機取5個視野,計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)(圖5).凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100% .

與HF組比較,****P<0.001;與Val組比較,###P<0.005圖5 心肌細(xì)胞凋亡分析(400×)Fig.5 Analysis of myocardial cell apoptosis(400×)

2.6 Western blot 法檢測大鼠心肌組織蛋白物質(zhì)的表達(dá)

圖6結(jié)果顯示,與Control組相比,HF組大鼠心肌組織 Bax、caspase-3 水平顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),P-AKT下降,有統(tǒng)計學(xué)意義; 與HF相比,Val組Bax、caspase-3 水平降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ,P-AKT升高,有統(tǒng)計學(xué)意義; LCZ-L、LCZ-H組Bax、caspase-3水平明顯降低(P<0.05) ,其中LCZ-H組下降更明顯(P<0.01),P-AKT明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).

3 討論

心肌細(xì)胞在長期高血壓、冠心病、糖尿病等疾病的影響下可逐漸出現(xiàn)細(xì)胞損傷、肥大、凋亡,導(dǎo)致心臟擴大、肥厚等心室重構(gòu),最終引起心衰,其發(fā)生機制為氧化應(yīng)激、炎癥因子激活等引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷及心室重構(gòu)[7- 9],故心衰的治療可通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放和阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌來保護(hù)心肌細(xì)胞,改善心臟功能.心衰發(fā)生時心肌細(xì)胞凋亡增加,而凋亡可由炎癥反應(yīng)誘發(fā).使用鹽酸阿霉素注射構(gòu)建慢性心衰大鼠模型,大鼠心肌組織中炎癥因子表達(dá)升高,心肌細(xì)胞凋亡加重,故抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡可改善心肌重構(gòu)[10].

心肌細(xì)胞凋亡與心肌肥厚、心肌梗死和心衰密切相關(guān),心肌細(xì)胞凋亡途徑有外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑;鹽酸阿霉素等化學(xué)藥物可造成細(xì)胞內(nèi)DNA損傷激活凋亡的線粒體通路,線粒體主要通過向細(xì)胞質(zhì)釋放能夠激活caspase的蛋白來促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生.Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡程序的關(guān)鍵調(diào)節(jié)組分,存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),由抑制蛋白、促凋亡蛋白(Bax)和死亡效應(yīng)因子組成,正常情況下線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中抑制蛋白與Bax結(jié)合,可抑制Bax的促細(xì)胞凋亡活性,而Bax被激活,可引發(fā)線粒體釋放caspase前體蛋白參與細(xì)胞凋亡過程,因此,抑制Bax基因活化是治療心衰的策略之一[10-12].caspase是一類在凋亡過程中起關(guān)鍵作用的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,在細(xì)胞凋亡過程中,Bax增強表達(dá),可損傷線粒體,進(jìn)而激活caspase-3.Okada 等[13]研究表明:caspase-3 被認(rèn)為是凋亡通路下游的關(guān)鍵水解酶,一旦caspase-3 被激活,凋亡將不可避免[14].在細(xì)胞凋亡過程中,Bax依賴的線粒體通透性受到蛋白激酶AKT的影響[15];AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,也被稱為蛋白激酶B,它調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長、心肌血管生成、葡萄糖代謝和細(xì)胞死亡[16].AKT可直接抑制促凋亡蛋白caspase-3的活性,從而促進(jìn)細(xì)胞存活,AKT的短期激活可促進(jìn)生理肥大和對心肌損傷的保護(hù)[17];激活的AKT(P-AKT)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和/或代謝,同時抑制細(xì)胞凋亡[18-19].在心衰發(fā)生時,Bax的激活可誘導(dǎo)線粒體釋放caspase前體蛋白,參與細(xì)胞凋亡.因此,抑制Bax基因的激活是治療心衰的靶點之一.

LCZ696通過抑制心室重構(gòu)從而治療心衰,作用確切,但其對心肌細(xì)胞凋亡途徑的影響尚不明確.本研究對鹽酸阿霉素誘發(fā)的心衰大鼠給予LCZ696治療,同時設(shè)HF組及Val組進(jìn)行對照研究,8周后檢測各組大鼠心室肌組織中AKT、Bax、caspase-3的水平,結(jié)果顯示Val組及LCZ-L、LCZ-H組大鼠心肌組織中Bax、caspase-3的水平明顯下降,P-AKT水平較HF組升高,均有統(tǒng)計學(xué)意義,其中LCZ-H組下降最明顯;心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行Tunel染色后顯示凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,心功能改善,得出結(jié)論,LCZ696通過抑制Bax/caspase-3通路抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌纖維化,延緩心衰的進(jìn)展.