張文麗,李志慧,董國(guó)福,魏麗亞,王長(zhǎng)振

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002;2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850)

微波屬電磁輻射,廣泛應(yīng)用于國(guó)防、通信和醫(yī)療科技等領(lǐng)域,給人們帶來(lái)便利的同時(shí),也使人們暴露于電磁污染中[1].長(zhǎng)期處于一定強(qiáng)度的電磁輻射環(huán)境下,可能使人產(chǎn)生失眠、抑郁,甚至誘發(fā)癌癥等[2-4].X波段微波指頻率在8～12 GHz的無(wú)線電波,在現(xiàn)代雷達(dá)、制導(dǎo)武器、通信系統(tǒng)等方面得到了長(zhǎng)足的發(fā)展[5].X波段電磁輻射對(duì)CD1孕鼠子代神經(jīng)系統(tǒng)功能有明顯影響,可導(dǎo)致子代雌鼠和雄鼠的焦慮癥狀,不導(dǎo)致抑郁癥狀;可致孕鼠子代雄鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,但對(duì)雌鼠學(xué)習(xí)記憶能力并無(wú)明顯影響[6].Yin等[7]研究結(jié)果顯示: S和X波段微波暴露導(dǎo)致大鼠心臟異常電傳導(dǎo)的機(jī)制可能與微波暴露后Cx43表達(dá)減少和分布紊亂相關(guān).9.375 GHz屬于X波段微波,可應(yīng)用于X 波段雷達(dá)頻率源的設(shè)計(jì)[8],該頻率源雷達(dá)對(duì)氣象目標(biāo)探測(cè)物有非常靈敏的探測(cè)能力[9].

目前有關(guān)X波段長(zhǎng)期持續(xù)低功率微波輻射對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生影響的報(bào)道較少. 秀麗線蟲(chóng)作為生物探測(cè)器在電磁環(huán)境研究中發(fā)揮了重要作用.可用來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)環(huán)境刺激敏感程度的指標(biāo)有:致死率、壽命、細(xì)胞凋亡、生殖、運(yùn)動(dòng)行為、學(xué)習(xí)行為、突變體和基因表達(dá)模式等[10].本實(shí)驗(yàn)以秀麗線蟲(chóng)壽命為研究終點(diǎn),秀麗線蟲(chóng)衰老的速度與壽命具有很強(qiáng)的相關(guān)性.目前對(duì)生物機(jī)體衰老相關(guān)的自由基衰老假說(shuō)[11]認(rèn)為,衰老是由于自由基特別是活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)對(duì)細(xì)胞、組織等的氧化損傷造成的;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是生物體防御氧化損傷的重要抗氧化酶,其活性反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,與體內(nèi)自由基的變化呈負(fù)相關(guān)[12].本研究以野生型株系(N2)和sod-3基因突變株系(gk235)秀麗線蟲(chóng)為研究對(duì)象,觀察長(zhǎng)期持續(xù)低功率9.375 GHz頻段微波輻射對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)卵率和壽命的影響,為深入研究微波輻射對(duì)機(jī)體的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 秀麗線蟲(chóng)的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的野生型株系(N2)和sod-3基因突變株系(gk235)秀麗線蟲(chóng)均由美國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center,CGC)惠贈(zèng).實(shí)驗(yàn)時(shí)將同步發(fā)育至L1期的秀麗線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含有E.coilOP50的9 cm秀麗線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)中,置20 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng).

1.2 輻射條件

將同步化后發(fā)育至L1期的秀麗線蟲(chóng)(每皿(1 000±100)只)接種到NGM培養(yǎng)基中,輻射組置于頻率為9.375 GHz,SAR值為4 W/kg的條件下進(jìn)行長(zhǎng)期不間斷輻射(24 h/d);對(duì)照組置于屏蔽網(wǎng)中進(jìn)行假輻射,微波輻射裝置見(jiàn)圖1.輻射開(kāi)始當(dāng)天,記為第0天.輻射至第10天時(shí),隨機(jī)挑出100只秀麗線蟲(chóng)繼續(xù)輻射,直至秀麗線蟲(chóng)全部死亡為止.

圖1 微波輻射裝置Fig.1 Diagram of microwave radiation installation

1.3 生殖能力的測(cè)定

輻射過(guò)程中,當(dāng)秀麗線蟲(chóng)發(fā)育至L4期時(shí),各組隨機(jī)挑取3只轉(zhuǎn)移到涂有E.coliOP50的3.5 cm NGM培養(yǎng)基中,每天統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵量并更換新培養(yǎng)基,直到產(chǎn)卵結(jié)束,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.4 運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定

在秀麗線蟲(chóng)連續(xù)輻射至第7天和第10天時(shí),每組隨機(jī)選取10只分別測(cè)定其頭部擺動(dòng)、身體彎曲和咽部震動(dòng)次數(shù),每只觀察記錄時(shí)長(zhǎng)均為30 s.

1.4.1 頭部擺動(dòng)次數(shù)的測(cè)定

將秀麗線蟲(chóng)轉(zhuǎn)入沒(méi)有食物的NGM培養(yǎng)基上,使其自由活動(dòng)2 min 以適應(yīng)環(huán)境,于體視顯微鏡下觀察,同時(shí)用錄像軟件記錄每只秀麗線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)情況,以秀麗線蟲(chóng)身體彎曲至體長(zhǎng)一半計(jì)為完成1次頭部擺動(dòng).

1.4.2 身體彎曲次數(shù)的測(cè)定

將秀麗線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至不含食物的NGM培養(yǎng)基上,使其自由活動(dòng)適應(yīng)2 min,記錄身體彎曲次數(shù),以秀麗線蟲(chóng)向前爬行時(shí)完成一個(gè)S形運(yùn)動(dòng)計(jì)為1次身體彎曲.

1.4.3 咽部震動(dòng)次數(shù)的測(cè)定

將秀麗線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含有食物的NGM培養(yǎng)基上適應(yīng)1 h,通過(guò)顯微鏡及錄像軟件統(tǒng)計(jì)30 s內(nèi)秀麗線蟲(chóng)咽部的震動(dòng)次數(shù).

1.5 壽命觀察

秀麗線蟲(chóng)輻射至第10天時(shí),隨機(jī)挑出100只移至新的NGM培養(yǎng)基繼續(xù)24 h/d輻射,每日觀察并記錄各組秀麗線蟲(chóng)存活數(shù)和死亡數(shù),直至全部死亡(鉑金絲刺激秀麗線蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)者記為死亡).

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)、身體彎曲和咽部震動(dòng)次數(shù)數(shù)據(jù)的比較均采用兩因素方差分析;前3天產(chǎn)卵數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析,產(chǎn)卵總數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).使用Kaplan-Meier法估計(jì)生存率,生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn).P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與制圖.

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期低功率微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)的影響

輻射第7天和第10天時(shí),N2株系秀麗線蟲(chóng)對(duì)照組與輻射組頭部擺動(dòng)次數(shù)每30 s分別為(4.50±1.20)、(3.80±0.86),(3.05±0.50)、(2.30±0.54)次.與對(duì)照組相比,第7天時(shí),輻射組秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)呈下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第10天時(shí)顯著減少(P<0.05).秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)隨年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),結(jié)果見(jiàn)圖2a.

a.N2株系;b.sod-3基因突變株系圖為30 s內(nèi)秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù);與對(duì)照組比較,* P<0.05,**P<0.01圖2 微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)的影響(n=10)Fig.2 Effect of microwave radiation on the number of head swing of Caenorhabditis elegans(n=10)

sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)輻射第7天和第10天時(shí),對(duì)照組與輻射組頭部擺動(dòng)次數(shù)每30 s分別為(6.90 ±1.52)、(3.80±1.03),(4.50±1.18)、(2.30±0.82)次.與對(duì)照組相比,第7天和第10天時(shí)輻射組秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)均顯著減少(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)圖2b.

2.2 長(zhǎng)期低功率微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)的影響

輻射第7天和第10天時(shí),N2株系秀麗線蟲(chóng)對(duì)照組與輻射組身體彎曲次數(shù)每30 s分別為(4.00±0.85)、(3.55±0.80),(2.65±0.47)、(2.10± 0.70)次.與對(duì)照組相比,輻射組秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)呈下降趨勢(shì),但無(wú)顯著差異.秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)隨著年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),結(jié)果見(jiàn)圖3a.

a.N2 株系;b.sod-3基因突變株系圖為30 s內(nèi)秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù);與對(duì)照組比較,**P<0.01圖3 微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)的影響(n=10)Fig.3 Effect of microwave radiation on the number of body bends of Caenorhabditis elegans(n=10)

sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)輻射第7天和第10天時(shí),對(duì)照組與輻射組身體彎曲次數(shù)每30 s分別為(6.30±1.25)、(3.70± 1.05),(4.20±1.03)、(2.30±0.82)次.與對(duì)照組相比,第7天和第10天時(shí)輻射組秀麗線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)均顯著減少(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)圖3b.

2.3 長(zhǎng)期低功率微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)咽部震動(dòng)次數(shù)的影響

輻射第7天和第10天時(shí),N2株系秀麗線蟲(chóng)對(duì)照組與輻射組咽部震動(dòng)次數(shù)每30 s分別為(90.20±8.08),(75.90±12.81)、(39.60±17.91)、(30.80±22.24)次.與對(duì)照組相比,輻射組秀麗線蟲(chóng)咽部震動(dòng)次數(shù)呈下降趨勢(shì),但無(wú)顯著差異.秀麗線蟲(chóng)咽部震動(dòng)次數(shù)隨著年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),結(jié)果見(jiàn)圖4a.

sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)輻射第7天和第10天時(shí),對(duì)照組與輻射組咽部震動(dòng)次數(shù)每30 s分別為(97.50±7.66)、(89.10±8.95),(66.90±8.94)、(60.30±11.64)次.與對(duì)照組相比,第7天和第10天時(shí)輻射組秀麗線蟲(chóng)咽部震動(dòng)次數(shù)呈下降趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果見(jiàn)圖4b.

2.4 長(zhǎng)期低功率微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)生殖能力的影響

N2株系秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量在第2天達(dá)到最大值,與對(duì)照組相比,輻射組總產(chǎn)卵量略低于對(duì)照組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量與N2株系秀麗線蟲(chóng)相似.輻射對(duì)N2和sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)的產(chǎn)卵總數(shù)均無(wú)影響,結(jié)果見(jiàn)圖5.

a.N2 株系;b.sod-3基因突變株系圖5 微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Fig.5 Effect of microwave radiation on the egg production of Caenorhabditis elegans

2.5 長(zhǎng)期低功率微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響

生存曲線結(jié)果(圖6)顯示,N2株系秀麗線蟲(chóng)輻射第11天出現(xiàn)死亡,第18天全部死亡;sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)輻射第11天出現(xiàn)死亡,第19天全部死亡.與對(duì)照組相比,輻射組N2和sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)的存活時(shí)間均無(wú)顯著差異(P>0.05).

a.N2 株系;b.sod-3基因突變株系圖6 微波輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響(n=100)Fig.6 Effect of microwave radiation on the lifespan of Caenorhabditis elegans(n=100)

3 討論

已有研究表明:電磁輻射可引起生物體應(yīng)激、精子異常與代謝紊亂.例如:在頻率為10 GHz,功率密度為10 mW/cm2(3 h/d,30 d)的連續(xù)波模式暴露下,會(huì)導(dǎo)致大鼠皮膚應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)志物發(fā)生顯著變化,主要包括ROS、NF-κB、iNOS/NOS2、COX-2、己糖激酶、乳酸脫氫酶和檸檬酸合酶等指標(biāo)的改變[13].albino大鼠在懷孕期間,全身暴露于頻率2.45 GHz,SAR 1.73 W/kg微波(2 h/d)下,可導(dǎo)致雄性子代睪丸結(jié)構(gòu)明顯變化,如生精小管形狀不規(guī)則和睪丸直徑顯著減小等[14].Bessho等[15]研究顯示:間歇性電磁暴露可使秀麗線蟲(chóng)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)錯(cuò)亂、發(fā)育異常、咽部震動(dòng)頻率下降等改變,但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)機(jī)體可產(chǎn)生耐受和補(bǔ)償,從而恢復(fù)到正常水平.孫永彥等[16]研究表明:50 Hz極低頻電磁波暴露可致線蟲(chóng)能量代謝增強(qiáng),引起成蟲(chóng)初期的氧化應(yīng)激反應(yīng).Pomerai等[17]研究表明:長(zhǎng)期的微波電磁輻射可增強(qiáng)熱休克蛋白的表達(dá),導(dǎo)致線蟲(chóng)的熱休克效應(yīng).綜上所述,微波輻射可造成機(jī)體不同程度的損傷,但X波段長(zhǎng)期持續(xù)低功率微波輻射損傷效應(yīng)的研究較少.秀麗線蟲(chóng)具有繁殖快和壽命短等特點(diǎn),易實(shí)驗(yàn)操作,且其運(yùn)動(dòng)能力可直接反映線蟲(chóng)抵御外界壓力的能力;咽部震動(dòng)頻率可反映機(jī)體代謝和運(yùn)動(dòng)能力;產(chǎn)卵率可直接反應(yīng)機(jī)體生殖能力.因此,本文主要利用模式生物秀麗線蟲(chóng)探究X波段長(zhǎng)期持續(xù)低功率微波輻射是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響.

秀麗線蟲(chóng)已被用作微波誘導(dǎo)應(yīng)激的生物監(jiān)測(cè)器[18].有研究表明電磁輻射暴露引起機(jī)體氧化應(yīng)激,造成ROS水平升高,過(guò)量的ROS攻擊細(xì)胞中各種生物大分子造成機(jī)體生殖系統(tǒng)損傷[19],也有研究報(bào)道了由電磁輻射引起的秀麗線蟲(chóng)行為反應(yīng)和衰老,與氧化應(yīng)激引起的行為反應(yīng)和衰老可能都是通過(guò)Ins/IGF-1信號(hào)通路作用的[20].衰老被高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路所調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)秀麗線蟲(chóng)壽命和抗逆性的2個(gè)主要信號(hào)通路是DAF-16/FOXO和SKN-1/NRF-2.ROS水平升高會(huì)激活胰島素樣信號(hào)通路中心調(diào)節(jié)因子daf-16下游多個(gè)靶基因的表達(dá),包括mtl-1,sod-3,ctl-1,gst-4等多個(gè)抗氧化酶基因的上調(diào),來(lái)抵御氧化應(yīng)激[21].sod-3作為胰島素信號(hào)通路下游基因,其表達(dá)產(chǎn)物SOD酶可以減輕氧化代謝副產(chǎn)物ROS對(duì)細(xì)胞的損傷,對(duì)壽命延長(zhǎng)起重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)輻射后sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)的下降與N2株系秀麗線蟲(chóng)各指標(biāo)的趨勢(shì)一致,但sod-3基因突變株系秀麗線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)與身體彎曲次數(shù)顯著減少,且存在時(shí)間和輻射的交互作用,推測(cè)微波輻射引起秀麗線蟲(chóng)行為的改變,可能是通過(guò)影響sod-3基因表達(dá)或產(chǎn)生ROS所致,具體機(jī)制有待深入研究.

秀麗線蟲(chóng)的早期產(chǎn)卵率、壽命和運(yùn)動(dòng)能力已被證實(shí)是輻射影響生理狀態(tài)的敏感指標(biāo)[22].Cao等[18]發(fā)現(xiàn)在SAR為3 W/kg的1 750 MHz射頻場(chǎng)中長(zhǎng)期暴露對(duì)秀麗線蟲(chóng)發(fā)育速度、繁殖和壽命沒(méi)有顯著影響,但促進(jìn)了秀麗線蟲(chóng)生長(zhǎng)速度和生殖發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),這些差異可能是由射頻輻射造成的微弱熱效應(yīng)導(dǎo)致.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期(24 h/d,N2株系18 d,sod-3突變株系19 d)輻射后,秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量和存活時(shí)間與對(duì)照組無(wú)顯著差異.結(jié)果表明,持續(xù)長(zhǎng)期低功率輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)的生殖能力和壽命并無(wú)影響.

綜上所述,長(zhǎng)期持續(xù)低功率微波輻射可降低秀麗線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力,使機(jī)體抵御外界損傷能力有所下降.本研究初步探究了低功率微波長(zhǎng)期輻射對(duì)秀麗線蟲(chóng)的影響,主要為后續(xù)深入研究X波段長(zhǎng)期持續(xù)低功率微波輻射損傷機(jī)體的作用機(jī)制提供參考.