陳霞霞，張 祎，項德勝，胡 詩，陳雪昌，張小軍,*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；3.浙江大洋興和食品有限公司，浙江 舟山 316014）

呋喃西林是一種價格低廉的抗生素，由于其具有潛在的致畸性、誘變性、致癌性[1-3]，目前已被列為三類致癌物，禁止在水產(chǎn)領域使用[4]。而氨基脲是呋喃西林的代謝殘留標志物，在進入代謝后極易與蛋白質結合形成穩(wěn)定的產(chǎn)物殘留在體內(nèi)[5-6]。目前歐盟、美國和我國均以氨基脲作為標志殘留物，對呋喃西林進行殘留檢測和監(jiān)控[3,7-8]。2003年，歐盟通過了2003/181/EC委員會決議，建立了水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物氨基脲的各種檢測方法，并規(guī)定檢測限為1 μg/kg[9]。然而據(jù)報道，大量未使用抗生素的貿(mào)易產(chǎn)品中也檢測到氨基脲[10-12]，這使各研究對氨基脲的來源重新進行探索，目前大多數(shù)學者認為部分水產(chǎn)品中有內(nèi)源性氨基脲的存在，尤其是甲殼類水產(chǎn)品[13-14]。2001年，Christof等[15]得出羅氏沼蝦中確實存在內(nèi)源性氨基脲，后續(xù)又對不同種類甲殼類動物進行實驗研究，證實了甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源性氨基脲的存在。

基于氨基脲對甲殼類水產(chǎn)品的毒理作用，必須從不同角度去探討氨基脲的產(chǎn)生來源。而代謝組學在近年來顯示出巨大的潛力，其為生物標志物的鑒定、毒理學機制和疾病的治療提供了新的技術手段[19]。Gu Chenhui等[20]通過非靶向代謝組學技術對大鼠進行研究，揭示藥物二丸妙方對高尿酸血癥的作用機制。Amoah等[21]通過非靶向代謝組學技術鑒定了蓖麻粕誘導幼年雜交石斑魚體內(nèi)腸炎的潛在生物標志物。Muhammad等[22]通過非靶向代謝組學技術研究了氟化物對人體的潛在危害，通過分析氟化物在人血清中的代謝，發(fā)現(xiàn)氟化物代謝的相關途徑及代謝物質?？梢姡x組學已在食品藥品領域被廣泛應用，借助該技術有助于探究氨基脲在甲殼類水產(chǎn)品中的產(chǎn)生及代謝途徑。

目前關于甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲的產(chǎn)生機制及轉化途徑方面的研究仍較少，雖然多數(shù)研究均將氨基脲指向精氨酸，但仍缺乏直接相關的體內(nèi)轉化途徑，并且氨基脲在甲殼類水產(chǎn)品中的代謝機制也尚未被闡明。因此，本研究以呋喃西林作為目標脅迫污染物，克氏原螯蝦為脅迫主體，開展外源污染物呋喃西林及其代謝產(chǎn)物氨基脲的蓄積實驗及代謝組學研究，以期為氨基脲后續(xù)研究提供可能的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活克氏原螯蝦于2022年7月一批次購買于浙江舟山豐茂菜場。從中挑選出附肢完整，大小一致的克氏原螯蝦150 只，分別暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖箱中。實驗前對養(yǎng)殖水體及飼料進行呋喃西林原藥及氨基脲檢測，確保實驗過程無呋喃西林及氨基脲干擾。在20～25 ℃室溫養(yǎng)殖1 周，養(yǎng)殖期間持續(xù)充氧。整個實驗過程采用淡水養(yǎng)殖，每日于8:00、17:00統(tǒng)一進行喂食，實驗開展前禁食2 d，并去除死蝦。

呋喃西林（純度＞98.5%）南昌白云藥業(yè)有限公司；同位素標記的氨基脲（SEM·HCl-13C-15N2）標準品、鹽酸氨基脲標準品、2-硝基苯甲醛 德國Dr.Ehrenstorfer公司；醋酸銨（優(yōu)級純）、無水磷酸氫二鉀、偏磷酸、鹽酸、甲酸、牛磺酸、次?；撬帷⑻於彼?、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜級）、乙酸乙酯 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

N-EVAP-11634氮氣吹干儀 美國Organomation公司；Heraeus Fresco17離心機、UltiMate 3000超高液相色譜儀、Q-Exactive高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW電子天平 德國Sartorius公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱、HLB固相萃取柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 脅迫實驗

因甲殼類動物的特殊性，通過口服、注射等方式難以達到預期的給藥效果，實驗采取浸泡法測定短時間內(nèi)原藥及其代謝物在克氏原螯蝦體內(nèi)的變化情況。實驗前將已禁食的克氏原螯蝦隨機均分為6 組，每組20 只，隨機設定為對照組和實驗組。對照組不添加呋喃西林，實驗組采用10 mg/L的呋喃西林溶液浸泡克氏原螯蝦。實驗組分別于藥物浸泡4、8、16、24、48 h采集樣品，每次隨機采集12 只，用水沖洗干凈體表，取非表皮的腹部肌肉。樣品分成2 份，一份迅速放入液氮中保存，用于代謝組學分析。另一份放入－60 ℃冷凍保存，用于測定呋喃西林和其代謝物氨基脲濃度變化。

1.3.2 呋喃西林原藥檢測

參照DB37/T 1779—2011《水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類原藥殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》。色譜條件：色譜柱ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL；流速0.2 mL/min；流動相A為含體積分數(shù)0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇。質譜條件：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負離子模式，電離電壓2 500 kV，霧化溫度350 ℃，霧化氣流速700 L/h；碰撞能量10 eV，掃描模式：多反應監(jiān)測；m/z197.1＞80.1，m/z197.1＞124.112 4。

1.3.3 代謝物氨基脲檢測

參照農(nóng)業(yè)部783號公告—1—2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》。樣品水解及衍生化：分別稱取2 g蝦肉于50 mL離心管中，加入0.05 mL SEM·HCl-13C-15N2內(nèi)標工作溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s后，在恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。樣品的提?。杭尤? mol/L磷酸氫二鉀將混合物pH值調整至7～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，均勻混合。6 000 r/min離心10 min，吸取上清液，為充分提取再次重復上述操作，合并上清液在40 ℃氮吹，加入2 mmol/L乙酸銨溶液（含體積分數(shù)0.1%甲酸）復溶，過0.45 μm濾膜待測。

色譜條件：色譜柱采用ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣體積5 μL；樣品室溫度10 ℃；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；流動相A為含體積分數(shù)0.1%甲酸的2 mmoL/L乙酸銨溶液，B為甲醇。質譜條件：電離模式為ESI＋，噴霧電壓4 100 V，輔助氣流量3 L/min，離子傳輸毛細管溫度350 ℃；掃描模式：選擇反應監(jiān)測，同位素標記的氨基脲衍生物為m/z212.1＞192.1（碰撞能量10 eV）；氨基脲衍生物為m/z209.1＞192.1（碰撞能量12 eV）；m/z209.1＞166.1（碰撞能量12 eV）。

1.3.4 代謝組學檢測

1.3.4.1 樣品前處理

將脅迫0、4、24 h的肌肉樣品置于冰上解凍，取20 mg樣品加入120 μL 50%甲醇溶液，渦旋1 min后，在室溫孵育10 min；然后將提取混合物在－20 ℃保存過夜。4 000 r/min離心20 min，將上清液轉移到96 孔板中，－80 ℃保存待測。

1.3.4.2 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive-MS）檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min，流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液，B為含體積分數(shù)0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫條件：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～7 min，95%～0% A、5%～100% B；7～8 min，0% A、100% B；8～8.1 min，0%～95% A、100%～5% B；8.1～10 min，95% A、5% B。每個樣品的注射量為4 μL。

質譜條件：ESI＋，采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式掃描，掃描范圍m/z70～1 050，以分辨率70 000收集前體光譜，最大注入時間100 ms；以分辨率17 500收集碎片光譜，最大進樣時間80 ms。

1.3.5 模擬氨基酸代謝途徑下氨基脲檢測

采用H2O2、VC、FeCl3組成的模擬氧化體系[23]，結合尿素模擬蝦體內(nèi)氨基酸代謝。分別配制0.1 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L VC和100 mmol/L H2O2的溶液于容量瓶中備用。分別稱取0.4 g?；撬帷⒋闻；撬帷⑻於彼?、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺于50 mL離心管中，分別加入0.4 g尿素，用10 mL水充分溶解，然后分別加入200 μL 0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L VC溶液，100 μL 100 mmol/L H2O2溶液氧化3 h。氧化結束后，分別加入0.05 mL SEM·HCl-13C-15N2內(nèi)標工作溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s后，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。后續(xù)操作同1.3.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用人類代謝數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進行代謝物注釋，解釋代謝物的物理化學性質、生物功能。利用metaX軟件對代謝物進行定量和差異代謝物篩選。采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）代謝物的變化。基于t檢驗檢測2 個表型之間代謝物水平的差異顯著性。通過metaX進行監(jiān)督PLS-DA，以區(qū)分組間的不同變量。差異代謝物的篩選設定閾值為變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1.0、P＜0.05，隨后將差異代謝物數(shù)據(jù)導入MetaboAnalyst 5.0進行代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 呋喃西林及氨基脲在克氏原螯蝦肌肉組織中的質量濃度變化

如圖1所示，由于呋喃西林在進入蝦體內(nèi)后代謝十分迅速，隨著呋喃西林脅迫時間的延長，氨基脲在克氏原螯蝦肌肉中的殘留量逐漸增加，氨基脲質量濃度從（6.91±1.25）ng/mL上升到（214.98±4.59）ng/mL。但呋喃西林的含量則呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢。4 h后，呋喃西林質量濃度為（159.35±28.96）ng/mL，這一變化可能是由于4 h時呋喃西林進入蝦體內(nèi)，隨后呋喃西林開始轉化成氨基脲，導致8 h時呋喃西林含量降低而氨基脲含量升高，至16 h時氨基脲和呋喃西林之間的轉化趨于穩(wěn)定，24 h時同步積累。徐英江等[24]對櫛孔扇貝體內(nèi)氨基脲的生物富集進行研究，發(fā)現(xiàn)隨海水中氨基脲濃度的增加，扇貝體內(nèi)氨基脲的積蓄量也逐漸增加，且各組織中氨基脲含量與曝污濃度呈正相關。任憲云[25]研究多環(huán)芳烴苯并芘對凡納濱對蝦體內(nèi)積蓄毒性效應發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦各組織中苯并芘的積累量隨海水中苯并芘濃度以及曝露時間的變化而變化，脅迫1 d的鰓和肝胰腺中苯并芘的檢出量增多，在3 d時呈現(xiàn)下降趨勢，后續(xù)又呈現(xiàn)增長趨勢。這一趨勢與本研究中克氏原螯蝦經(jīng)呋喃西林脅迫后的積蓄趨勢一致，均呈現(xiàn)先增后減再升高的趨勢。對此，猜測是由于呋喃西林在甲殼類水產(chǎn)品中的代謝十分迅速，進入蝦肌肉組織4 h后就開始轉化生成氨基脲，隨后氨基脲的檢測量呈現(xiàn)上升趨勢。因此，4 h可能是呋喃西林在蝦體內(nèi)代謝旺盛的一個重要時間點，基于此，后續(xù)的代謝組學分析選取0、4 h及24 h的肌肉組織樣品進行研究。

圖1 呋喃西林原藥及代謝物氨基脲不同時間在克氏原螯蝦肌肉組織中的積蓄情況Fig.1 Accumulation of nitrofurazone and semicarbazide in muscle tissue of Procambarus clarkii at different time points

2.2 PLS-DA

PLS-DA是通過偏最小二乘回歸建立的代謝物表達量與樣本類別之間的關系模型，在有監(jiān)督模式下進行樣本分析，實現(xiàn)樣本間更有效地分離[26]。在構建的PLS-DA模型中，=0.781、=0.93、Q2=0.487和R2=0.878，表現(xiàn)出良好的擬合和預測能力（圖2）。所有組間在進行200 次交叉驗證下表現(xiàn)出Q2＜0，說明模型不存在過擬合的情況，差異代謝物分析比較準確。

圖2 正離子模式下PLS-DA得分圖（A～C）及置換檢驗圖（D～F）Fig.2 PLS-DA score plot (A-C) and permutation test (D-F) in the positive ion mode

2.3 代謝差異物質鑒定

為研究呋喃西林組與對照組的差異，通PLS-DA并結合t檢驗篩選差異表達的代謝物。找到同時滿足P＜0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于2或小于0.5，且VIP＞1的特征代謝物，即是呋喃西林誘導代謝紊亂和毒性機制的相關標志物。4 h組與對照（0 h）組相比，在肌肉組織中共發(fā)現(xiàn)166 種代謝物發(fā)生顯著變化（P＜0.05），F(xiàn)C為0.18～24.61，其中99 種代謝物上調。4 h組與24 h組相比，肌肉組織中共存在249 種差異代謝物（P＜0.05），F(xiàn)C為0.03～53.08，其中109 種代謝物上調。24 h組與0 h組相比，差異代謝物數(shù)量明顯較少，共55 種（P＜0.05），其中22 種代謝物上調。蔣原等[27]研究硝基呋喃類藥物在克氏原螯蝦組織中的消除規(guī)律發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL呋喃西林給藥1 h后即可檢測到400 μg/kg以上的代謝物氨基脲，說明克氏原螯蝦在脅迫狀態(tài)下1 h內(nèi)就發(fā)生了代謝轉化。此外，尤宏爭等[28]對珍珠龍膽石斑魚進行短途運輸脅迫實驗，發(fā)現(xiàn)脅迫對其生理機能不會產(chǎn)生持久性影響，在受到脅迫后168 h血清部分生理指標即趨于脅迫前水平，說明水產(chǎn)品在受到外界脅迫后會首先發(fā)生應激反應，此后在一定時間內(nèi)會恢復到正常。因此，0 h vs.4 h和4 vs.24 h差異代謝物數(shù)量較多的原因可能是呋喃西林在進入蝦體內(nèi)后迅速代謝，短時間內(nèi)體內(nèi)積蓄的代謝物增多，但至24 h，呋喃西林與其代謝物之間的轉化趨于動態(tài)平衡，蝦中部分循環(huán)機制已適應當前生存環(huán)境開始趨于穩(wěn)定，但與未受呋喃西林脅迫的0 h樣品相比體內(nèi)代謝物質已發(fā)生轉化，因此仍存在一定差異物質。通過HMDB數(shù)據(jù)庫在0 h vs.4 h和4 h vs.24 h這兩組中共注釋到52 種差異代謝物質。0 h vs.4 h中鑒定到23 種代謝物，其中14 種物質上調，9 種下調；4 h vs.24 h中有39 種代謝物，其中22 種物質上調，17 種下調。這些代謝物分別屬于脂質和類脂質分子、有機酸及其衍生物、核苷、核苷酸和類似物、有機雜環(huán)化合物、有機氧化合物、苯類、均相非金屬化合物及苯丙烷和聚酮化合物。圖3直觀地表達了不同時間樣品中代謝物的差異，圖中每個點代表一種代謝物?？梢园l(fā)現(xiàn)4～24 h的差異代謝物最多，其中表達上調的差異代謝物有22 種，包括精氨琥珀酸、L-谷氨酸、甘氨酰亮氨酸等，表達下調的有17 種，包括1-酮糖、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、牛磺酸、次?；撬岬?。

圖3 不同時間克氏原螯蝦肌肉組織中呋喃西林差異代謝物火山圖Fig.3 Volcanic map of differential metabolites from nitrofurazone in muscle tissue of P.clarkii at different time points

2.4 代謝通路分析

為進一步確定呋喃西林脅迫下蝦體內(nèi)相關代謝通路的變化，結合差異物質分析及生物體實驗得出的數(shù)據(jù)，使用MetaboAnalyst 5.0對4 h vs.24 h差異代謝物進行代謝通路分析。根據(jù)VIP＞1、P＜0.05進行篩選，與KEGG數(shù)據(jù)庫進行搜索比對，發(fā)現(xiàn)這些代謝差異物質主要富集在23 條代謝通路中（圖4）。

圖4 4 h vs.24 h克氏原螯蝦肌肉組織中呋喃西林代謝通路富集分析Fig.4 Metabolite pathway enrichment analysis of nitrofurazone in muscle tissue of P.clarkii at 4 vs.24 hours

如圖5和表1所示，依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，以－lgP＞0.5且影響因子大于0.05為篩選標準，發(fā)現(xiàn)主要有4 條代謝通路受影響，分別為?；撬岷痛闻；撬岽x（影響因子0.714 3），精氨酸生物合成（影響因子0.233 5），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（影響因子0.218 8）及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（影響因子0.5）。

表1 代謝通路分析結果Table 1 Results of metabolic pathway analysis

圖5 呋喃西林在克氏原螯蝦體內(nèi)的代謝通路拓撲分析氣泡圖Fig.5 Topological analysis of metabolic pathways significantly enriched with differential metabolites of nitrofurazone

如表2所示，呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織中?；撬峒按闻；撬岬暮匡@著下降。?；撬崾且环N具有多種細胞保護活性的β-氨基酸，屬于巰基氨基酸和半胱氨酸的衍生物，廣泛分布于海洋動物的組織和細胞中，是一種條件必需氨基酸[29]。研究表明?；撬嵩诩毎麅?nèi)發(fā)揮抗氧化保護機制，并且具有抗炎作用。次?；撬崾桥；撬岷蛠喤；撬岽x途徑中半胱胺雙加氧酶的產(chǎn)物，在生物系統(tǒng)中次?；撬嵬瑯幽軌虬l(fā)揮抗氧化作用[30-31]。本研究中?；撬岷痛闻；撬岷烤档?，說明蝦在受到呋喃西林脅迫后機體產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化應激，導致機體自身的抗氧化活性下降。Tian Xiuhui等[32]研究表明日本刺參暴露于氨基脲后會發(fā)生氧化應激反應，肌肉及腸道組織中的超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性發(fā)生變化，均呈現(xiàn)先增后減的趨勢。?；撬峥梢苑乐箍寡趸傅膿p傷從而抑制氧化應激反應，本研究結果顯示?；撬嵩谠撏分惺艿揭种?，提示蝦在受到脅迫后產(chǎn)生氧化應激損傷。

表2 4 h vs.24 h差異代謝物鑒定結果Table 2 Identification of differential metabolites at 4 vs.24 hours

在本研究中，呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織中精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑發(fā)生變化。研究表明，生物體在應對外界脅迫時，可通過提高自身氨基酸水平從而為機體供能[33-34]。呋喃西林脅迫誘導調節(jié)谷氨酸、精氨琥珀酸、5-羥基-L-色氨酸、甘氨酰亮氨酸、丙氨酰絲氨酸及酪氨酰酪氨酸及其代謝物的水平，說明呋喃西林脅迫下蝦肌肉組織的能量代謝發(fā)生紊亂。在精氨酸生物合成途徑中，L-谷氨酸及精氨琥珀酸顯著上調，谷氨酸是動物神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的快速興奮性神經(jīng)遞質，說明在短時脅迫條件下，蝦體內(nèi)釋放大量神經(jīng)遞質調節(jié)機體代謝。內(nèi)源性氨基脲與精氨酸有一定關聯(lián)性，Yu Wenlong等[17]對凡納濱對蝦全生長周期中的氨基酸進行研究，發(fā)現(xiàn)與氨基脲相關性最強的氨基酸為精氨酸。精氨琥珀酸作為精氨酸的前體物質，在受到呋喃西林脅迫后其量顯著上升，進一步影響尿素循環(huán)中其他代謝物。

2.5 模擬氨基酸代謝途徑下氨基脲含量變化

根據(jù)代謝組學通路分析可知，呋喃西林的代謝涉及?；撬峒按闻；撬岽x，精氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺代謝以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑。氨基酸代謝過程中包括尿素循環(huán)這一過程，并且尿素循環(huán)與氨基酸之間關系密切，如精氨酸直接參與尿素循環(huán)[35]。氨基酸的一般代謝均包括脫氨基、氮代謝過程，而尿素循環(huán)是主要通過排泄氮以維持生命活動的一種代謝方式，因此在氨基酸代謝過程中離不開尿素的參與[36]。此外，由于蝦類中還天然存在H2O2[17]，因此氧化性也是呋喃西林代謝途徑中必須考慮的因素。為確定與這些通路相關的氨基酸與代謝物氨基脲生成之間的關系，實驗通過模擬生物代謝進行驗證。如圖6所示，氨基酸與尿素結合后經(jīng)H2O2氧化體系處理，精氨酸、丙氨酸、牛磺酸、次?；撬?、天冬氨酸及D-谷氨酰胺代謝后均不同程度檢出氨基脲的存在。其中，?；撬岷捅彼岬陌被瀹a(chǎn)生量最高，分別達到（72.05±6.5）ng/mL和（59.08±0.10）ng/mL。其次是精氨酸、D-谷氨酰胺，檢測量分別為（7.73±1.55）、（7.46±0.11）ng/mL。以上結果表明，受影響代謝通路中相關的氨基酸在尿素及氧化條件下能夠產(chǎn)生氨基脲，表明氨基酸在蝦生物體循環(huán)過程中可能會轉化為氨基脲。代謝通路中?；撬帷⒈彼?、精氨酸和D-谷氨酰胺4 種物質可能是產(chǎn)生氨基脲的關鍵中間體。這一結果與代謝組學具有一致性，說明蝦體內(nèi)氨基脲的檢出與氨基酸代謝途徑關系密切。

圖6 模擬條件下與代謝組學相關氨基酸的氨基脲轉化情況Fig.6 Conversion of amino acids associated with metabolomics into semicarbazide under simulated conditions

3 結論

采用非靶向代謝組學技術對呋喃西林脅迫下克氏原螯蝦肌肉組織進行代謝組學分析，并通過體外模擬驗證實驗證實了與代謝通路相關物質和氨基脲產(chǎn)生之間的聯(lián)系。結果表明，在不同脅迫時間下，氨基脲及呋喃西林在肌肉組織中的含量具有顯著差異，呋喃西林脅迫影響克氏原螯蝦的?；撬峒按闻；撬岽x和氨基酸代謝途徑。通過驗證發(fā)現(xiàn)，精氨酸、丙氨酸、牛磺酸、次?；撬帷⑻於彼峒癉-谷氨酰胺在尿素結合下氧化后能夠產(chǎn)生氨基脲，證實了代謝組學中的結果。在應對呋喃西林抗生素時，動物機體發(fā)生氧化應激反應，產(chǎn)生大量自由基，使自身的抗氧化能力下降。與此同時，脅迫后蝦的能量代謝紊亂，氨基酸水平發(fā)生變化。本研究結果為呋喃西林代謝物氨基脲在甲殼類水產(chǎn)品中的研究提供了一定的方向及理論依據(jù)。