凍梓杰，黃陽(yáng)陽(yáng)，周偉濤，黃忠民,2,3，艾志錄,2,3，鄭 琦，王曉杰,2，索 標(biāo),2,3,*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.國(guó)家速凍米面制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，速凍面米及調(diào)制食品河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

食源性致病菌是導(dǎo)致食物中毒的最主要原因[1]，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，世界上近十分之一的人在食用受污染的食物后患病，每年有數(shù)十萬(wàn)人直接或間接死于食源性疾病[2]，因此，由食源性致病菌引起的食源性疾病已成為全球關(guān)注的重要問(wèn)題[3]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是常見的食源性致病菌且廣泛存在于環(huán)境中，大多數(shù)感染金黃色葡萄球菌的人在感染后6～48 h會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心、腹部絞痛等癥狀[4]。前人研究表明，金黃色葡萄球菌廣泛分布于米面制品中[5]。糯米面團(tuán)主要由糯米粉制成，是我國(guó)傳統(tǒng)米面食品的主要原料之一，隨著糯米產(chǎn)品品種的不斷多樣化及其工業(yè)化生產(chǎn)的加速發(fā)展，其食用的安全性越來(lái)越引起人們的關(guān)注[6]，糯米面團(tuán)的高水分活度是引起微生物增殖的重要原因之一[7]，因此在糯米面團(tuán)加工制作、貯藏過(guò)程中加強(qiáng)致病菌的防控具有重要意義。

微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型可以用來(lái)描述在不同環(huán)節(jié)如食品的加工、運(yùn)輸以及銷售等過(guò)程中環(huán)境條件變化對(duì)微生物生長(zhǎng)數(shù)量的影響[8]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)食品的貨架期、HACCP體系建立以及食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等[9]。Huang Zhongmin等[10]揭示在4～45 ℃條件下，不同金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)擬合模型具有較大差異。Park等[11]研究了3～37 ℃條件下蛋黃中金黃色葡萄球菌混合菌懸液的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，證明采用Baranyi一級(jí)模型和Ratkowsky平方根模型可較好地模擬金黃色葡萄球菌在此環(huán)境下的生長(zhǎng)。Hwang等[12]采用一步動(dòng)力學(xué)分析法構(gòu)建微生物三級(jí)預(yù)測(cè)模型，描述了蠟樣芽孢桿菌在炒飯中的生長(zhǎng)和存活情況。然而，目前有關(guān)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)模型尚未建立。

本研究通過(guò)一級(jí)和二級(jí)模型描述4～37 ℃條件下金黃色葡萄球菌在糯米面團(tuán)中的生長(zhǎng)規(guī)律，并建立其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，以期為糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米粉 益海嘉里食品工業(yè)有限公司；BP瓊脂平板基礎(chǔ)、肉膏蛋白胨肉湯LB、酵母浸粉（yeast extract，YE）、亞碲酸鉀卵黃增菌液 北京路橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉（分析純）天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；無(wú)菌均質(zhì)袋 青島海博生物技術(shù)有限公司。

金黃色葡萄球菌ATCC 8095來(lái)源于美國(guó)典型菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌NCTC 8325來(lái)源于英國(guó)典型菌種保藏中心；菌株均保存于－70 ℃甘油管中。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化有限公司；WS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海比朗儀器有限公司；SCIENTZ-09無(wú)菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HZQ-A恒溫恒濕搖床 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；5430R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MDF-U5412醫(yī)用低溫冰箱 無(wú)錫久平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

參照Ellouze 等[13]的方法，將金黃色葡萄球菌ATCC 8095和NCTC 8325菌株接種到LB-YE肉湯中，在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)至指數(shù)后期，并采用0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水清洗3 次，將兩種金黃色葡萄球菌等體積混合制備混合母液，得到約108CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.2 糯米面團(tuán)的制備、細(xì)菌接種與計(jì)數(shù)

將糯米粉置于紫外燈下30 min以滅活背景菌群，將糯米粉與無(wú)菌水按質(zhì)量比5∶4混合揉制均勻制成約5 g的糯米面團(tuán)，并分裝在無(wú)菌均質(zhì)袋中，制作全程在無(wú)菌操作臺(tái)下進(jìn)行。將菌懸液用0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水稀釋至約4（lg（CFU/mL）），吸取100 μL稀釋后菌液均勻接種至糯米面團(tuán)表面并密封采樣袋。

分別將接種后的糯米面團(tuán)放置于4、11、18、25、32 ℃和37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。4 ℃和11 ℃條件下每間隔24 h、18 ℃條件下每間隔12 h、25 ℃條件下每間隔6 h、32 ℃和37 ℃條件下每間隔3 h取出一組進(jìn)行金黃色葡萄球菌濃度測(cè)定，不同溫度下測(cè)定終止時(shí)間以生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定后期為準(zhǔn)。每個(gè)樣品在無(wú)菌條件下加入45 mL的0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器以12 次/s拍打2 min。取100 μL梯度稀釋液涂布至BP平板，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)處理至少3 個(gè)平行。

1.3.3 糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌一級(jí)生長(zhǎng)模型的建立

分別采用Huang[14]、Baranyi[15]和修正的Gompertz模型[16]作為一級(jí)生長(zhǎng)模型擬合各溫度下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線。其中Huang模型如式（1）、（2）所示，Baranyi模型如式（3）、（4）所示，修正的Gompertz模型如式（5）所示：

式中：Y（t）為t時(shí)刻金黃色葡萄球菌的數(shù)量（lg（CFU/g））；Y0、Ymax為初始菌數(shù)量和穩(wěn)定期菌數(shù)量（lg（CFU/g））；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h－1；t為培養(yǎng)時(shí)間/h；λ為延滯時(shí)間/h；h0為反應(yīng)細(xì)菌所處的生理狀態(tài)[17]，h0＝λμmax；α為常數(shù)（α=4）。

1.3.4 二級(jí)模型的建立

分別使用Ratkowsky平方根模型[18]和Huang平方根模型[19]構(gòu)建二級(jí)模型，用以評(píng)價(jià)溫度對(duì)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率的影響，Ratkowsky和Huang模型計(jì)算如式（6）、（7）所示：

式中：Tmin和Tmax分別為微生物最低、最高生長(zhǎng)溫度/℃；T0為最低生長(zhǎng)溫度/℃；T為培養(yǎng)溫度/℃；μmax為生長(zhǎng)速率/h－1。

1.3.5 模型的外部驗(yàn)證

金黃色葡萄球菌在20 ℃左右時(shí)生長(zhǎng)較為平緩，且糯米制品在加工過(guò)程中環(huán)境溫度大約為20 ℃，可較好地作為生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型外部驗(yàn)證的驗(yàn)證溫度[20]，因此本研究額外開展20 ℃恒溫條件下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，收集生長(zhǎng)數(shù)據(jù)；并將實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較以確認(rèn)模型的擬合度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，采用預(yù)測(cè)微生物學(xué)軟件IPMP 2013和Origin 2019作圖并分析，對(duì)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理。利用Origin 2019軟件，繪制一、二級(jí)模型并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌一級(jí)生長(zhǎng)模型的建立

為研究溫度對(duì)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響，選用4、11、18、25、32 ℃和37 ℃溫度節(jié)點(diǎn)，分別使用Huang模型、Baranyi模型、修正的Gompertz模型方程進(jìn)行非線性擬合，這3 種模型也是目前常用的描述致病菌生物生長(zhǎng)的一級(jí)模型[21]。各溫度下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)擬合曲線如圖1所示，金黃色葡萄球菌初始濃度為3.9～4.3（lg（CFU/g）），隨著貯藏溫度的升高，相同時(shí)間下細(xì)菌濃度逐漸增加。在4 ℃時(shí)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率緩慢，恒溫培養(yǎng)7 d（168 h）后，其細(xì)菌濃度為4.5（lg（CFU/g）），增加約0.5（lg（CFU/g）），未觀察到明顯的生長(zhǎng)，不能進(jìn)行一級(jí)生長(zhǎng)模型的有效擬合（圖2）。在11～37 ℃溫度區(qū)間時(shí)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌均能正常生長(zhǎng)且進(jìn)行模型擬合，因此本研究選取此溫度階段下生長(zhǎng)數(shù)據(jù)用于數(shù)據(jù)分析。

圖1 不同溫度下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的一級(jí)生長(zhǎng)模型Fig.1 Primary models for S.aureus growth prediction in glutinous rice dough at different temperatures

圖2 4℃條件下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of S.aureus in glutinous rice dough at 4℃

如圖1所示，采用上述3 種一級(jí)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合后，金黃色葡萄球菌在各溫度下（11～37 ℃）的實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值均接近相應(yīng)模型預(yù)測(cè)值，表明3 個(gè)模型均能成功描述樣品中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。各培養(yǎng)溫度下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出典型的3 個(gè)生長(zhǎng)特征階段：延滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期；且隨著溫度的升高，其延滯期總體逐漸降低，細(xì)菌生長(zhǎng)速率逐漸增加。延滯期的長(zhǎng)短取決于多種因素，環(huán)境溫度對(duì)延滯期有顯著影響，其規(guī)律一般表現(xiàn)為延滯期隨著溫度的升高而逐漸減少[22]。

2.2 一級(jí)模型的比較分析

本實(shí)驗(yàn)采用延滯時(shí)間（λ）和最大比生長(zhǎng)速率（μmax）指標(biāo)判定微生物生長(zhǎng)速率的快慢，用赤池信息準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC）、準(zhǔn)確因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方誤差（mean squared error，MSE）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）以及決定系數(shù)（R2）對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[23]。其中R2、Af和Bf越趨近于1則代表該模型在此溫度下擬合效果越好，AIC、MSE和RMSE越小代表該模型擬合精確度越高[24]。

由表1可知，在11～37 ℃時(shí)，Huang模型中金黃色葡萄球菌的μmax隨溫度的升高由0.044 h－1增加至0.651 h－1，而相對(duì)應(yīng)的λ由14.454 h降低至1.200 h；在Baranyi模型擬合下μmax隨溫度的升高由0.045 h－1增加至0.708 h－1，λ由16.933 h降低至1.607 h；修正的Gompertz模型中μmax隨溫度的升高由0.046 h－1增加至0.611 h－1，λ由16.463 h降低至1.083 h。表1中上述3 種一級(jí)生長(zhǎng)模型（Huang、Baranyi和修正的Gompertz）中AIC、MSE、RMSE和R2較為接近，R2且各模型間參數(shù)無(wú)明顯差異，說(shuō)明3 種模型對(duì)糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線均具有較好的擬合精確度。但在低溫環(huán)境下（11 ℃）和較高環(huán)境下（37 ℃）修正的Gompertz模型中AIC和RMSE明顯低于其他兩種模型、R2系數(shù)高于其他兩種模型，表明此溫度下（11 ℃和37 ℃）糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線更適合用修正的Gompertz模型進(jìn)行擬合。在較溫和的溫度區(qū)間（18、25 ℃和32 ℃）內(nèi)修正的Gompertz模型與其他兩種模型間參數(shù)無(wú)明顯差異，均能較好地模擬金黃色葡萄球菌在糯米面團(tuán)的生長(zhǎng)。

表1 不同溫度糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Growth kinetic parameters of S.aureus in glutinous rice dough at different temperatures

修正的Gompertz模型在低溫11 ℃和適宜37 ℃條件下表現(xiàn)最佳，此時(shí)一級(jí)模型參數(shù)優(yōu)于Huang和Baranyi模型，在溫和溫度（18～32 ℃）下表現(xiàn)良好，3 種一級(jí)模型差異并不顯著，這可能是因?yàn)樵摲秶ń瘘S色葡萄球菌理想生長(zhǎng)溫度[25]，使其生長(zhǎng)更具可預(yù)測(cè)性。本研究和Lu等[26]在熟制米飯中金黃色葡萄球菌的研究結(jié)果有所差異，Huang、Baranyi和修正的Gompertz模型均能較好地?cái)M合金黃色葡萄球菌在12～35 ℃條件下的生長(zhǎng)，但Huang模型在此條件下的擬合度最佳，這可能與此研究在以大米為基質(zhì)的前提下加入豬肉松且進(jìn)行了熟制有關(guān)，生長(zhǎng)基質(zhì)的不同可能是導(dǎo)致差異的主要原因。

2.3 糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)二級(jí)模型的比較分析

本研究采用Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型對(duì)貯藏溫度與生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系進(jìn)行擬合，二級(jí)模型曲線如圖3所示。Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型的RMSE分別為0.048和0.051，且Af和Bf均接近1（表2），這表明2 種二級(jí)模型適用于描述溫度對(duì)糯米面團(tuán)樣品中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率的影響。如表3所示，由Ratkowsky平方根模型擬合金黃色葡萄球菌最低生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度分別為0.049 ℃和47.135 ℃，Huang平方根模型擬合結(jié)果分別為和4.641 ℃和47.121 ℃，本實(shí)驗(yàn)中4 ℃條件下金黃色葡萄球菌仍存在緩慢生長(zhǎng)的現(xiàn)象（圖2），在168 h內(nèi)增長(zhǎng)了約0.5（lg（CFU/g）），說(shuō)明Huang平方根模型并不適合描述低溫下金黃色葡萄球菌的實(shí)際生長(zhǎng)情況；Ratkowsky平方根模型的Af和Bf等模型擬合度參數(shù)均優(yōu)于Huang平方根模型，而且Ratkowsky平方根模型與金黃色葡萄球菌的生物學(xué)最低生長(zhǎng)溫度較為吻合，因此本研究建議將其作為糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的二級(jí)模型。Xie Zhaopeng等[27]研究表明，乳制品中金黃色葡萄球菌的最低、最佳和最高生長(zhǎng)溫度分別為5.9、42.0 ℃和49.2 ℃；Valík等[28]證明金黃色葡萄球菌在生牛乳中最低生長(zhǎng)溫度為4.56 ℃；Lu等[26]在研究中證明Huang平方根模型是擬合金黃色葡萄球菌在熟制米飯中存活的最優(yōu)二級(jí)模型（最低生長(zhǎng)溫度為7.0～7.9 ℃）；但鑒于微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的效率因生長(zhǎng)基質(zhì)、環(huán)境條件等因素而異，因此有必要對(duì)具體條件下的模型擬合情況進(jìn)行具體分析。本實(shí)驗(yàn)為了更好地模擬真實(shí)制作的流程，采用了兩株金黃色葡萄球菌進(jìn)行混合培養(yǎng)并接種，前人研究結(jié)果中最低生長(zhǎng)溫度（4～8 ℃）均高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)論（0.049 ℃），不同的生長(zhǎng)基質(zhì)和細(xì)菌菌種可能是造成最低生長(zhǎng)溫度有所差異的重要原因。

表3 糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率的二級(jí)模型參數(shù)Table 3 Parameters of secondary models for the specific growth rate of S.aureus in glutinous rice dough

圖3 2 種二級(jí)模型描述溫度對(duì)糯米面團(tuán)樣品中食源性致病菌生長(zhǎng)速率影響的擬合曲線Fig.3 Curve fitting with two secondary models of the effect of temperature on the growth of foodborne pathogens in glutinous rice dough

經(jīng)過(guò)2.2節(jié)對(duì)3 種一級(jí)生長(zhǎng)模型擬合度的對(duì)比，采用修正的Gompertz模型時(shí)，金黃色葡萄球菌λ與培養(yǎng)溫度有如圖4A所示的對(duì)數(shù)非線性關(guān)系；μmax和λ之間對(duì)數(shù)線性關(guān)系如圖4B所示，lnλ與lnμmax呈線性減少關(guān)系。

圖4 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Fig.4 Comparison of S.aureus growth kinetic parameters

2.4 模型的外部驗(yàn)證

為了從外部驗(yàn)證修正的Gompertz模型在本研究的擬合準(zhǔn)確度，在本研究中未設(shè)置的其他溫度（20 ℃）下進(jìn)行了存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行更直觀比較（圖5）。圖中點(diǎn)越接近斜線，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值越接近，即所建立模型的效果越好。經(jīng)外部模型驗(yàn)證證明，金黃色葡萄球菌在修正的Gompertz模型擬合情況下Af、Bf均小于1.15，且R2＞0.99，表示在此模型擬合下能很好地預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)規(guī)律。

圖5 外部實(shí)驗(yàn)20℃條件下實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性比較Fig.5 Correlation between observed and predicted values in external experiments at 20℃

3 結(jié)論

研究了4～37 ℃恒溫條件下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并使用不同的一級(jí)和二級(jí)模型描述金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)受貯藏溫度的影響規(guī)律。根據(jù)一級(jí)模型擬合精確度參數(shù)對(duì)比分析，修正的Gompertz模型可更好地模擬細(xì)菌生長(zhǎng)；通過(guò)對(duì)二級(jí)模型參數(shù)及實(shí)際生長(zhǎng)情況分析，Ratkowsky平方根模型描述的溫度范圍較廣，且能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)最低生長(zhǎng)溫度（0.049 ℃），因此更適合作為金黃色葡萄球菌的二級(jí)模型。修正的Gompertz模型和Ratkowsky平方根模型可用于預(yù)測(cè)恒溫貯藏條件下糯米面團(tuán)中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并評(píng)估在糯米加工、貯藏等過(guò)程中溫度濫用的情況下金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)和監(jiān)控金黃色葡萄球菌在糯米面團(tuán)的生長(zhǎng)繁殖，保證以糯米為基質(zhì)的食品安全性等方面具有參考價(jià)值。