王 昱，王家樂，袁晶晶，李 可，栗俊廣，趙慧娟，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；4.河南鏈多多供應(yīng)鏈管理有限公司，河南 鶴壁 456750）

凝膠類肉制品（包括糜類制品、乳化型制品、碎肉制品等），因其具有食用方便，口感鮮美，營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，深受消費者的喜愛，成為我國肉制品發(fā)展的主要趨勢[1-2]。在凝膠類肉制品的生產(chǎn)加工中，需要較高含量（2%～3%）的食鹽（NaCl）萃取肌原纖維蛋白，使其在加熱過程中能互相交聯(lián)、聚集，形成黏彈性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)固的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而提高產(chǎn)品的保水性（water holding capacity，WHC）和質(zhì)構(gòu)特性[3-4]。據(jù)報道，目前我國人均食鹽攝入量約為10 g/d，遠高于世界衛(wèi)生組織和《中國居民膳食指南（2022）》的推薦攝入量（5 g/d）[5-6]。鈉鹽的過量攝入，會導(dǎo)致血壓升高，進而增加心血管疾病的發(fā)生風險。肉制品約貢獻每日食鹽總攝入量的16%～25%[7]，因此，低鹽肉制品的開發(fā)是促進健康飲食的重要途徑。由于NaCl發(fā)揮眾多的功能作用，直接降低凝膠類肉制品中的NaCl含量，會使產(chǎn)品出現(xiàn)質(zhì)量劣變，如WHC降低、質(zhì)構(gòu)松散、風味喪失等[8]。如何有效避免減鹽帶來肉制品品質(zhì)下降，是肉品研究領(lǐng)域需要解決的一個難題。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）是一種小分子單體蛋白質(zhì)，能催化肉蛋白發(fā)生?-(γ-谷氨?；?-賴氨酸共價交聯(lián)反應(yīng)，起到促進肉蛋白凝膠形成的作用，進而對肉制品的乳化穩(wěn)定性、質(zhì)地、流變學(xué)特性等產(chǎn)生積極影響，在肉制品中應(yīng)用廣泛[9-12]。但是，TGase對肉制品WHC結(jié)果并不一致。如Cando等[11]報道，TGase能提高肉糜制品的WHC，而Lesiow等[12]發(fā)現(xiàn)，TGase增加了豬肉糜凝膠的水分流失。另外，在低鹽條件下，肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)較緊湊，難以暴露足夠數(shù)量的谷氨酰胺和賴氨酸殘基作為TGase反應(yīng)底物，從而不利于TGase催化交聯(lián)反應(yīng)的進行[13]。因此，為更好利用TGase改善低鹽肉制品品質(zhì)，有必要將TGase與其他技術(shù)手段進行聯(lián)合。

L-賴氨酸作為一種堿性氨基酸（等電點＞7.0），可作為食品增香劑、發(fā)色劑及營養(yǎng)強化劑用于食品加工，不會引入有害物質(zhì)，因此是一種綠色的改性策略。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定，L-賴氨酸可作為食品用天然香精香料，且未作限量要求。近年來，L-賴氨酸在肉制品加工中的應(yīng)用日益受到研究人員的關(guān)注。研究顯示，L-賴氨酸能提高肉體系pH值，改變?nèi)獾鞍讟?gòu)象，提高肉蛋白分子柔性，從而改善肉蛋白的溶解性、乳化性、凝膠性等加工特性，提升肉制品的功能特性[14-16]。由于L-賴氨酸引起的蛋白質(zhì)分子的解折疊會促進蛋白質(zhì)活性基團的暴露[17]，因此，L-賴氨酸具有增強TGase與肉蛋白之間交聯(lián)反應(yīng)的潛力。然而，L-賴氨酸與TGase聯(lián)合處理對低鹽凝膠類肉制品品質(zhì)的影響，還鮮見報道。

本研究以低鹽（含質(zhì)量分數(shù)1% NaCl）雞肉糜（lowsalt chicken meat batter，LCMB）為對象，考察不同質(zhì)量分數(shù)（0.25%、0.5%、0.75%、1%）L-賴氨酸結(jié)合TGase（0.5%質(zhì)量分數(shù)）處理對LCMB凝膠WHC、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，闡明L-賴氨酸和TGase協(xié)同處理對LCMB凝膠品質(zhì)的影響規(guī)律及機制，旨在為高品質(zhì)低鹽凝膠肉制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞胸肉購于鄭州大張超市，去除雞胸肉表面的脂肪及筋膜，然后切成小塊，用絞肉機絞碎，進行真空包裝并貯存于－20 ℃。

NaCl（食品級）河南明瑞食品添加劑有限公司；L-賴氨酸（99.5%，食品級）上海金源生物技術(shù)有限公司；TGase（100 U/g，食品級）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HM740絞肉機 青島漢尚電器有限公司；GM200斬拌機 德國Restch公司；CR-GIII高速冷凍離心機、Regulus 8100冷場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；Lab-1-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Renishaw/in Via激光顯微共聚焦拉曼光譜儀 英國雷尼紹公司；NMI20低場核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCMB的制備

冷凍貯藏的雞胸肉置于4 ℃環(huán)境中解凍過夜[18]；然后放入斬拌機，2 000 r/min斬拌60 s；隨后加入食鹽和1/2冰水，2 000 r/min斬拌60 s；根據(jù)不同配方組成（表1），各組依次加入相同質(zhì)量分數(shù)TGase（占肉糜總質(zhì)量0.5%）及不同質(zhì)量分數(shù)L-賴氨酸（占肉糜總質(zhì)量的0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%），2 000 r/min斬拌60 s；最后加入剩下的1/2冰水，2 000 r/min斬拌60 s，即得到LCMB。其中，L-賴氨酸及TGase質(zhì)量分數(shù)的選取參考預(yù)實驗結(jié)果及相關(guān)文獻[12]確定。

表1 添加L-賴氨酸和TGase的LCMB配方Table 1 Formulation of low-salt chicken meat batter added with L-lysine and TGase %

1.3.2 LCMB熱誘導(dǎo)凝膠的制備

稱取1.3.1節(jié)制得的肉糜置于50 mL聚丙烯離心管中，每管肉糜質(zhì)量約35 g。將肉糜在4 ℃條件下，500×g離心3 min，去除肉糜中的氣泡，然后于80 ℃水浴鍋中加熱30 min，得到LCMB凝膠。將LCMB凝膠取出后快速放入冰中冷卻10 min，隨后轉(zhuǎn)移至0～4 ℃冰箱，靜置過夜，用于WHC、質(zhì)構(gòu)、水分流動性和分布、微觀結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)構(gòu)象的測定。

1.3.3 WHC測定

參考Guo Xiuxia等[19]的方法，用濾紙吸收雞肉糜凝膠表面水分，取約5 g凝膠樣品（質(zhì)量記為m1），用濾紙包裹置于50 mL離心管中，1 000×g、4 ℃離心5 min，記錄離心后剩余樣品質(zhì)量m2。按照下式計算WHC：

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性測定

參考Wang Yu等[20]的方法，用平行刀片將雞肉糜凝膠切成高度為2 cm、底面直徑為2.5 cm的圓柱體，使用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀進行質(zhì)構(gòu)特性分析。測試參數(shù)設(shè)置為：P/36R探頭；測試前速率2.0 mm/s；測試速率2.0 mm/s；測試后速率5.0 mm/s；壓縮比50%；自動觸發(fā)5.0 g；間隔時間5.0 s。

1.3.5 水分特性測定

參考Zhang Daojiu等[21]的方法，通過NMI20低場核磁共振成像分析儀分析肉糜凝膠內(nèi)部水分分布特性。將約2 g肉糜凝膠樣品放入直徑15 mm核磁管中，使用CPMG序列進行測試。測試參數(shù)如下：測試溫度32 ℃，質(zhì)子共振頻率22 MHz，90°脈沖和180°脈沖間隔時間200 μs，重復(fù)掃描32 次，兩次掃描之間的間隔時間5.0 s，回波數(shù)18 000。得到指數(shù)衰減圖形，通過SIRT算法反演擬合得到T2譜圖。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)測定

參考潘杰等[22]的方法，將肉糜凝膠切成2 mm×2 mm×2 mm的立方體，用體積分數(shù)4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）固定2 h；用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；用乙醇溶液（30%～100%）和丙酮（100%）溶液脫水，每次各15 min，冷風除去易揮發(fā)的有機溶劑；真空冷凍干燥15 h，噴金，用Regulus 8100冷場發(fā)射掃描電鏡觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓3 kV，放大倍數(shù)2 000。

1.3.7 蛋白質(zhì)構(gòu)象測定

參考康壯麗等[23]的方法，取適量雞肉糜凝膠樣品，置于載玻片上，通過激光顯微共聚焦拉曼光譜儀檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。使用以下參數(shù)進行測試：激光波長785 nm，焦距鏡頭50 倍，采集次數(shù)10 次，曝光時間10 s，光譜波長范圍 400～3 500 cm－1，分辨率2 cm－1。使用Labspec version 5.0軟件對光譜進行基線校正和平滑處理，根據(jù)苯丙氨酸1 003 cm－1的譜帶進行光譜的歸一化處理（此峰強度不隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化而變化）[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠WHC的影響

WHC大小代表蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)捕獲水的能力高低，直接影響肉和肉制品的質(zhì)量好壞。如圖1所示，對照組（C0）的WHC僅為75%，表明低鹽條件不利于雞肉糜凝膠對水分的保持，這是因為鹽溶性肌原纖維蛋白的溶出較少，難以在加熱過程中產(chǎn)生充分的交聯(lián)反應(yīng)，形成的凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，進而增加了水分的流失[20]。TGase對LCMB凝膠的WHC無顯著影響（P＞0.05），這與Shang Yongbiao等[25]的結(jié)果一致。TGase對肉制品WHC的影響存在矛盾的結(jié)果，其增加/降低豬肉糜凝膠WHC的結(jié)果均有報道[11-12]。這些不一致的結(jié)果可能與肉的來源、TGase添加量及其作用條件（反應(yīng)溫度和時間）、肉糜體系其他存在的成分等有關(guān)[12]。在添加TGase的情況下，隨著L-賴氨酸添加量由0%增至1%，LCMB凝膠的WHC從75%增至88%。與C0組相比，T3～T5組的WHC顯著增加（P＜0.05），且T3～T5組之間的WHC無顯著差異（P＞0.05）。L-賴氨酸能增強肌原纖維蛋白的溶解，促進肉蛋白結(jié)構(gòu)的展開、變性和聚集，誘導(dǎo)形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高肉制品的WHC[26-27]。此外，L-賴氨酸還可提高肉體系的pH值，增強蛋白質(zhì)之間的靜電斥力，提高蛋白質(zhì)凝膠對水分的束縛能力[15]。Zhu Xiaoxu等[27]在探究L-賴氨酸對乳化雞肉腸WHC的影響時也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。綜上，本實驗結(jié)果表明，0.5% TGase結(jié)合L-賴氨酸（質(zhì)量分數(shù)≥0.5%）處理能有效改善LCMB凝膠的WHC，具有改善低鹽肉制品持水特性的潛力。

圖1 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠WHC的影響Fig.1 Effect of combined treatment of L-lysine nad TGase on the WHC of LCMB gels

2.2 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表2可知，與C0組相比，T1組的硬度顯著增加（P＜0.05）。TGase能使肉蛋白形成?-(γ-谷氨?；?-賴氨酸共價交聯(lián)，增強蛋白質(zhì)分子間作用力，提高凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而促進肉制品硬度的提高[28]。另外，TGase處理可促進肉蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，利于良好凝膠結(jié)構(gòu)的形成，從而改善肉制品的質(zhì)構(gòu)特性[23]。在TGase存在的情況下，LCMB凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性隨著L-賴氨酸含量的增加呈現(xiàn)升高趨勢，當L-賴氨酸添加量為1%時，LCMB的各項質(zhì)構(gòu)參數(shù)（硬度除外）均達到最高值。可能的原因有：一方面，L-賴氨酸能促進肉蛋白分子的展開和活性基團的暴露[29]，這可能導(dǎo)致TGase可反應(yīng)底物數(shù)量增加，進而增強TGase對肉蛋白的交聯(lián)作用；另一方面，L-賴氨酸能改變?nèi)獾鞍椎臉?gòu)象，促進形成黏彈性好的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，利于質(zhì)構(gòu)特性的提高[18]。此外，有研究表明，肉制品質(zhì)構(gòu)（如硬度、咀嚼性等）與蛋白質(zhì)含量有關(guān)[30]。由于T1～T5組配方中的水分添加量均低于C0組，可起到“濃縮”蛋白質(zhì)的作用，這也可能是T1～T5組質(zhì)構(gòu)特性得到改善的原因。本實驗結(jié)果與Guo Xiuxia等[19]的研究不一致，他們發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸能抑制肌球蛋白的熱聚集，不利于三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，進而導(dǎo)致重組火腿質(zhì)構(gòu)的下降。這些不一致的現(xiàn)象可能與賴氨酸添加量、肉制品類型、肉體系的pH值和離子強度等因素有關(guān)。

表2 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on textural properties of LCMB gels

2.3 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠水分特性的影響

由圖2可知，各組LCMB凝膠均呈現(xiàn)4 個T2弛豫時間峰：0.1～1 ms為強結(jié)合水（T2a）；1～10 ms為弱結(jié)合水（T2b）；10～100 ms為不易流動水（T21）；100～10 000 ms為自由水（T22）[31]。肉糜凝膠持水性的變化能通過不同狀態(tài)水分的分布比例反映[32]。LCMB凝膠中不同狀態(tài)水分相對含量的變化如表3所示，其中，P2a、P2b、P21、P22分別代表強結(jié)合水、弱結(jié)合水、不易流動水和自由水的相對含量。由表3可知，TGase對LCMB凝膠P2a、P2b、P21、P22無顯著影響（P＞0.05）。與C0組相比，T2～T5組的P2a和P2b無顯著變化（P＞0.05），P21顯著增加（P＜0.05），而P22顯著降低（P＜0.05），表明L-賴氨酸協(xié)同TGase處理能促進LCMB凝膠中自由水向不易流動水轉(zhuǎn)化。有研究指出，P21的增加和P22的降低能提高肉糜凝膠WHC[33]，這與WHC結(jié)果一致?？赡苁且驗長-賴氨酸能提高肉體系的pH值，增加肉蛋白分子間的靜電斥力，進而增強蛋白質(zhì)-水相互作用[15]。

圖2 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠水分弛豫時間的影響Fig.2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relaxation time of water protons in LCMB gels

表3 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠不同狀態(tài)水分相對含量的影響Table 3 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relative contents of water in different states in LCMB gels %

2.4 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

肉制品的WHC和質(zhì)構(gòu)特性與其微觀結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系[18]。LCMB凝膠的微觀結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖3所示。不同處理組的LCMB凝膠微觀結(jié)構(gòu)差異明顯。C0組凝膠疏松，含有大量形狀各異的孔隙。肉糜經(jīng)過加熱后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性使吸附的水分析出，轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，在流失的過程中形成大量的“水通道”[34]。因此，這些孔隙應(yīng)該是水分流失形成的“水通道”。T1組凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)程度明顯提高，且孔隙的大小也變小。TGase能催化肉蛋白中的賴氨酸和谷氨酸交聯(lián)形成共價鍵，促進形成密實的肉糜凝膠結(jié)構(gòu)[20]。在添加TGase的基礎(chǔ)上，L-賴氨酸能進一步減小LCMB凝膠中的孔隙數(shù)量和大小，并提高了凝膠網(wǎng)絡(luò)的均勻性、有序性和致密性，這些變化可以通過T2～T4組掃描電鏡圖反映。L-賴氨酸能促進肉蛋白活性基團的暴露，增強蛋白質(zhì)分子間的相互交聯(lián)，從而改善了肉糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[15]。有研究表明，密實的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于提高肉制品的WHC和質(zhì)構(gòu)[35]。因此，L-賴氨酸協(xié)同TGase能通過減少LCMB凝膠中“水通道”的產(chǎn)生，促進形成致密、均勻、有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高了凝膠的WHC（圖1）和質(zhì)構(gòu)特性（表2）。

圖3 LCMB凝膠的掃描電鏡圖（×2 000）Fig.3 Scanning electron microscopic images of LCMB gels (× 2 000)

2.5 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響

為解析L-賴氨酸協(xié)同TGase對LCMB凝膠特性影響的分子機制，通過拉曼光譜分析了肉糜蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。如圖4所示，760、830 cm－1和850 cm－1的雙峰以及2 930 cm－1處的拉曼譜峰分別能反映色氨酸殘基、酪氨酸殘基以及脂肪族氨基酸殘基的微環(huán)境變化，進而提供蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化信息[33,36-37]。L-賴氨酸及TGase對上述特征拉曼譜峰的歸一化強度影響見表4，與C0組相比，T1組的760 cm－1強度輕微增加（P＞0.05）。在添加TGase的情況下，隨著L-賴氨酸含量的增加，760 cm－1強度呈現(xiàn)下降的趨勢，表明L-賴氨酸能促進肉糜蛋白質(zhì)色氨酸殘基的暴露[33]，使肉蛋白的微環(huán)境更加親水，進而有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)對水分的截留[38]，最終提高肉制品的WHC。I850/I830比值一般在0.3～2.5范圍內(nèi)。當I850/I830比值較大（＞0.9）時，表明酪氨酸殘基上的羥基主要暴露于極性水環(huán)境。I850/I830比值越高，酚羥基暴露越多，與水分子形成氫鍵；I850/I830比值越低，酚羥基埋藏越多，與相鄰的蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵[36]。各處理組中的I850/I830均大于0.9，表明肉糜蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的酚羥基暴露在極性水環(huán)境中。與C0組相比，T2～T5組I850/I830有增加的趨勢，說明L-賴氨酸協(xié)同TGase能促進酪氨酸殘基的暴露，與水分子形成氫鍵。2 930 cm－1處的拉曼譜峰，代表脂肪族氨基酸殘基CH的伸縮振動。與C0組相比，T2～T5組的I2930/I1003呈現(xiàn)升高的趨勢，表明L-賴氨酸及TGase聯(lián)合處理能促進肉蛋白結(jié)構(gòu)的展開，引起脂肪族氨基酸殘基的暴露[37]。拉曼光譜的結(jié)果表明，L-賴氨酸協(xié)同TGase能促進肉蛋白活性基團的暴露，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的分子間相互作用，從而有利于提高LCMB凝膠的品質(zhì)。

圖4 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理下LCMB凝膠的拉曼光譜（700～2 000 cm－1）Fig.4 Raman spectra of LCMB gels added with L-lysine and TGase (700-2 000 cm-1)

表4 L-賴氨酸協(xié)同TGase處理對LCMB凝膠歸一化拉曼強度的影響Table 4 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on normalized Raman intensity of LCMB gels

3 結(jié)論

L-賴氨酸協(xié)同TGase處理可促進LCMB凝膠中自由水向不易流動水轉(zhuǎn)化，減少LCMB凝膠中“水通道”的產(chǎn)生，誘導(dǎo)形成致密、均勻、有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促進肉糜蛋白質(zhì)中色氨酸殘基、酪氨酸殘基以及脂肪族氨基酸殘基的暴露，增強蛋白質(zhì)分子間相互作用，從而改善LCMB凝膠的WHC和質(zhì)構(gòu)特性。因此，L-賴氨酸與TGase聯(lián)合處理是一種有效改善低鹽肉糜凝膠特性的方式，這為高品質(zhì)低鹽凝膠類肉制品的開發(fā)提供了新的解決方案。