趙文巧 朱柏俊 劉宇峰 曹明欣 鄧凱 吳心欣 吳華英

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410013)

心血管疾病是全世界成人死亡的主要原因[1]。血管平滑肌功能失調(diào)是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同特點(diǎn)。肌球蛋白磷酸化靶向亞基(myosin phosphatase targeting subunit,MYPT)作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)的靶向亞基,可通過磷酸化調(diào)控MLCP活性而影響肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(myosin regulatory light chain,MLC)的磷酸化,影響細(xì)胞功能,參與對(duì)血管平滑肌收縮與舒張過程的調(diào)節(jié)[2]。已有研究表明MYPT家族參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展,如心臟肥大、心力衰竭、原發(fā)性高血壓、冠心病、腦卒中等。了解MYPT家族在心血管疾病中的研究現(xiàn)狀,有助于闡明疾病的發(fā)生機(jī)制,并為其治療提供新思路。

1 MYPT家族成員結(jié)構(gòu)

MYPT家族包括5個(gè)成員,分別是MYPT1(PPP1R12A)、MYPT2(PPP1R12B)、MYPT3(PPP1R16A)、MBS85(PPP1R12C)、TIMAP(PPP1R16B)。有研究[3-4]比較了MYPT家族5個(gè)成員的序列,發(fā)現(xiàn)MYPT家族成員共享幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,包括位于N端附近用于與蛋白磷酸酶1催化亞基(protein phosphatase 1 catalytic subunit,PP1c)結(jié)合的RVxF基序,以及緊隨其后的幾個(gè)錨蛋白重復(fù)序列。錨蛋白重復(fù)序列形成了一個(gè)與多種蛋白質(zhì)結(jié)合的交互平臺(tái),包括底物磷酸化肌球蛋白。此外,還發(fā)現(xiàn)MYPT1、MYPT2和MBS85含有C-末端亮氨酸拉鏈(leucine zipper,LZ)結(jié)構(gòu)域,LZ結(jié)構(gòu)域在NO/cGMP/PKG通路對(duì)MLCP活性的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。MYPT3和TIMAP缺乏LZ結(jié)構(gòu)域,但它們含有1個(gè)C-末端CAAX盒,可將蛋白靶向到質(zhì)膜上[3]。MYPT家族成員受各種蛋白激酶在多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)Rho相關(guān)激酶(Rho-related kinase,ROCK)通過催化Thr696和Thr853位點(diǎn)的磷酸化來調(diào)節(jié)MYPT1[6],這兩個(gè)位點(diǎn)在MYPT2中是保守的,而在MBS85中只有Thr696對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)保守,在TIMAP和MYPT3中則沒有發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)[3]。

盡管MYPT家族成員之間有很多相似性,但它們的組織分布卻有著一定的差異。MYPT1主要在平滑肌中表達(dá),而MYPT2主要在腦和橫紋肌中表達(dá)。MBS85是一種普遍表達(dá)的蛋白,它是強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)Cdc42結(jié)合激酶-α的底物,介導(dǎo)了由Cdc42誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重組[7]。MYPT3在心臟、大腦和腎等多個(gè)器官中表達(dá),與其他成員不同的是,MYPT3與PP1c結(jié)合會(huì)抑制后者對(duì)MLC的催化活性[8]。TIMAP是MYPT家族的內(nèi)皮特異性成員,主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜上,并通過與非整合蛋白層粘連蛋白受體1和埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin proteins,ERM蛋白)等的相互作用發(fā)揮廣泛的生理功能[9]。

2 MYPT家族成員與細(xì)胞功能

2.1 細(xì)胞收縮

細(xì)胞收縮裝置主要由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白組成,此裝置既依賴于Ca2+又依賴于磷酸化,基礎(chǔ)Ca2+水平或MLC磷酸化狀態(tài)的恢復(fù)會(huì)使收縮的肌肉恢復(fù)到非收縮狀態(tài)。平滑肌收縮取決于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的增加,Ca2+可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合,進(jìn)而激活鈣調(diào)蛋白依賴性肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK),使其磷酸化MLC的Ser19或Thr18,磷酸化的MLC與肌動(dòng)蛋白相互作用,從而導(dǎo)致平滑肌收縮[10]。橫紋肌收縮也涉及此機(jī)制,但不是其主導(dǎo)機(jī)制[10]。

MLC去磷酸化由MLCP介導(dǎo)。MLCP是一個(gè)異源三聚體,由PP1c、MYPT和M20組成[11]。PP1c是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶,是MLCP發(fā)揮作用的核心酶。MYPT通過RVxF基序與PP1c結(jié)合,并將其特異性導(dǎo)向MLC,從而賦予MLCP特異性[2]。MYPT的磷酸化會(huì)影響PP1c與MLC結(jié)合,從而調(diào)節(jié)MLC磷酸化水平,改變平滑肌舒縮狀態(tài)。

2.2 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中最關(guān)鍵且必需的事件之一是MLC的循環(huán)磷酸化和激活[12]。MLCK或ROCK催化MLC磷酸化,從而激活肌球蛋白,使肌球蛋白能結(jié)合肌動(dòng)蛋白并利用ATP產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。相反,MLCP對(duì)MLC的去磷酸化則降低了肌球蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白的親和力。MYPT通過調(diào)節(jié)MLCP活性影響MLC的磷酸化,從而參與調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程。

2.3 胞質(zhì)分裂

收縮環(huán)是胞質(zhì)分裂的重要結(jié)構(gòu),主要由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白Ⅱ裝配而成。有研究[13]通過比較過表達(dá)不可磷酸化的MLC(T18A/S19A)細(xì)胞和野生型MLC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)前者收縮環(huán)排列受阻,胞質(zhì)分裂不完全,而野生型MLC細(xì)胞收縮環(huán)排列和胞質(zhì)分裂均正常。這揭示MLC Thr18/Ser19的磷酸化對(duì)收縮環(huán)的正常排列是重要的。MYPT對(duì)MLCP活性的調(diào)節(jié)可影響MLC磷酸化,從而參與調(diào)控胞質(zhì)分裂過程。

2.4 細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架參與細(xì)胞分裂和收縮等多種細(xì)胞功能。有研究[14]通過測(cè)定一個(gè)網(wǎng)柄菌肌球蛋白缺陷突變體的細(xì)胞骨架組織和生理反應(yīng),發(fā)現(xiàn)其微管網(wǎng)絡(luò)形態(tài)和分布異常,且細(xì)胞分裂等功能也存在異常。由此推測(cè)肌球蛋白可能與細(xì)胞骨架存在某種聯(lián)系。隨后有研究[15]發(fā)現(xiàn)肌球蛋白Ⅱ參與細(xì)胞骨架的組裝,并在細(xì)胞骨架中與F-肌動(dòng)蛋白緊密結(jié)合,并通過MLC Thr18/Ser19的磷酸化來調(diào)節(jié)其功能。MYPT可影響MLC的磷酸化,從而參與調(diào)控細(xì)胞骨架的組裝和功能。

ERM蛋白為跨膜蛋白和底層細(xì)胞骨架之間的接頭,特殊位點(diǎn)的磷酸化可使其活化而發(fā)揮功能[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)MLCP可通過介導(dǎo)ERM蛋白的去磷酸化在細(xì)胞骨架中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外,MYPT與微管相關(guān)蛋白Tau和微管相關(guān)蛋白2存在相互作用關(guān)系,提示MYPT可能調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)[18]。

2.5 細(xì)胞黏附

研究[19]發(fā)現(xiàn),p-MYPT/MYPT比值的增加會(huì)促進(jìn)單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附,這表明MYPT可通過磷酸化調(diào)控單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附。此外,肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可調(diào)節(jié)鈣黏蛋白之間的相互作用,后者在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用[20]。肌球蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架至關(guān)重要,MYPT通過調(diào)節(jié)MLC的磷酸化而影響其功能,從而影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的正常形成及功能,并借此調(diào)節(jié)鈣黏蛋白的相互作用而影響細(xì)胞-細(xì)胞黏附。

3 MYPT家族成員與信號(hào)通路

3.1 Rho/ROCK信號(hào)通路

Rho家族是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白R(shí)AS超家族的組成部分,RhoA是該家族中研究最多的一個(gè)。RhoA及其下游靶標(biāo)ROCK在細(xì)胞收縮、遷移等廣泛的生理過程和Rho/ROCK信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[21]。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,有兩種亞型,ROCK1和ROCK2[22]。它們?cè)隗w內(nèi)普遍表達(dá),ROCK1在肝、脾、腎等非神經(jīng)性組織中表達(dá)水平較高,而ROCK2主要在腦、肌肉和心臟中表達(dá)[23]。RhoA/ROCK通路的上游信號(hào)之一是血管緊張素Ⅱ或其他多肽,如內(nèi)皮素-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合[24],然后通過其受體G偶聯(lián)蛋白來動(dòng)員Gq蛋白的G-α亞單位(Gαq),從而激活Rho-鳥嘌呤交換因子,以鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)取代鳥苷二磷酸[25]。隨后GTP-Rho通過與ROCK結(jié)構(gòu)中的Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用使ROCK激活[26]。

ROCK可磷酸化MYPT1,抑制MLCP的活性,使MLC持續(xù)磷酸化,從而參與調(diào)控肌球蛋白基礎(chǔ)上的細(xì)胞收縮、黏附等一系列細(xì)胞功能[27]。研究發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK通路在許多病理生理過程中發(fā)揮重要作用,如心力衰竭[28]和動(dòng)脈粥樣硬化[29]等。

3.2 NO/cGMP/PKG通路

一氧化氮(nitric oxide,NO)是重要的血管內(nèi)皮舒張因子,其舒張血管作用主要是通過增加環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)的產(chǎn)生,進(jìn)而激活cGMP依賴性蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)而實(shí)現(xiàn)。PKG如何實(shí)現(xiàn)對(duì)血管的調(diào)控?研究[30]發(fā)現(xiàn),PKG通過與MYPT1結(jié)合介導(dǎo)MLCP活化,從而導(dǎo)致Ca2+脫敏和血管舒張。MYPT1亞基可通過3’端31bp外顯子的選擇性剪接,生成不同的C-末端LZ陽(yáng)性(LZ+)或LZ陰性(LZ-)結(jié)構(gòu)域[31]。NO/cGMP/PKG通路誘導(dǎo)的血管舒張與MYPT-LZ+/LZ-有關(guān)。當(dāng)缺乏LZ結(jié)構(gòu)域時(shí),PKG可與MYPT1-LZ-結(jié)合,但磷酸化和Ca2+脫敏不會(huì)發(fā)生。當(dāng)LZ表達(dá)時(shí),NO下游的cGMP、PKG和MLCP活性增加[5]。這種效應(yīng)需要PKG1α磷酸化MYPT1[30]。PKG1α在MYPT1上的磷酸化位點(diǎn)主要是Ser695,此位點(diǎn)的磷酸化會(huì)干擾相鄰Thr696的磷酸化,從而消除磷酸化Thr696對(duì)MLCP的抑制,重新激活MLCP并導(dǎo)致Ca2+脫敏,進(jìn)而誘導(dǎo)平滑肌松弛[32](見圖1)。

注:AngⅡ,血管緊張素Ⅱ;ET-1,內(nèi)皮素-1;FGF,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;TGF-β,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β;RhoGEF,Rho-鳥嘌呤交換因子;GDP,鳥苷二磷酸;sGC,可溶性鳥苷酸環(huán)化酶;PKG,蛋白激酶G。

4 MYPT家族成員與心血管疾病

4.1 心臟肥大

心臟肥大多由主動(dòng)脈狹窄和高血壓等應(yīng)激引起,最初是一種保護(hù)性的代償機(jī)制,但持續(xù)和過度應(yīng)激誘導(dǎo)的病理性心臟肥大是不利的,并最終可能導(dǎo)致心力衰竭等嚴(yán)重后果。

研究[33]表明MLC磷酸化可抑制心臟肥大。MLCK家族由MLCK-1、MLCK-2、MLCK-3和MLCK-4組成[34]。心肌MLC的磷酸化主要由MLCK-3即cMLCK調(diào)控,cMLCK在心房和心室中高度且等水平表達(dá),且對(duì)培養(yǎng)物中分離的心肌細(xì)胞發(fā)揮正性肌力作用[35]。此外,MLCK-4也在心肌中表達(dá)[36]。故心肌MLC磷酸化可由兩種蛋白激酶來調(diào)節(jié)。

在心臟中,MYPT1和MYPT2都表達(dá),但MYPT2比MYPT1表達(dá)更豐富[37]。MYPT2可調(diào)節(jié)MLCP活性,影響MLC的去磷酸化,從而調(diào)控心肌MLC的磷酸化水平,影響心臟肥大的發(fā)生發(fā)展。

4.2 心力衰竭

心力衰竭是由心排血量減少不能滿足機(jī)體需要而導(dǎo)致的一種臨床綜合征。研究[38]表明心肌MLC磷酸化的變化在心力衰竭進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。MYPT2作為心臟MLCP的靶向亞基,可影響心肌MLC去磷酸化從而參與對(duì)心力衰竭的調(diào)控。

充血性心力衰竭是心力衰竭的一種常見類型,其特征是血管收縮異常和對(duì)NO介導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)受損[39]。MYPT1-LZ+亞型是NO發(fā)揮血管舒張效應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)[3]。研究[39]表明,心力衰竭患者對(duì)NO介導(dǎo)的血管舒張敏感性降低可部分歸因于MYPT1-LZ+亞型表達(dá)水平的降低。故臨床上可使用調(diào)節(jié)MYPT-LZ+亞型表達(dá)的藥物,如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑在治療心力衰竭上效果較好[3]。

4.3 高血壓

高血壓是最常見的心血管疾病,也是導(dǎo)致腦卒中、冠心病等疾病的重要危險(xiǎn)因素。高血壓的一個(gè)重要特征是血管阻力增加,血管收縮增強(qiáng)。MYPT可影響MLC的磷酸化水平,從而調(diào)控血管舒縮。

平滑肌的主要MYPT亞型是MYPT1。ROCK可磷酸化MYPT1的Thr696、Thr853位點(diǎn)而抑制MLCP活性,使MLC磷酸化水平增高。此外,ROCK還可使蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17 (C-kinase-potentiated protein phosphatase 1 inhibitor of 17 kDa,CPI-17)磷酸化[40],磷酸化的CPI-17通過與PP1c結(jié)合來抑制MLCP活性[41]。使用Y27632(ROCK抑制劑)阻斷ROCK活性對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠均具有降血壓作用[42]。阻斷ROCK活性可能成為高血壓治療的重要靶點(diǎn)。

4.4 冠心病

冠狀動(dòng)脈痙攣在多種缺血性心臟病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,而痙攣的中心機(jī)制是血管平滑肌的過度收縮[43]。MYPT1可通過影響MLC磷酸化而參與調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮狀態(tài),在冠狀動(dòng)脈痙攣中發(fā)揮重要作用。

急性冠脈綜合征是冠心病的一種嚴(yán)重類型,多由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂伴血栓形成引起。研究[44]表明,血小板活化并形成血栓是急性冠脈綜合征發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。血小板形態(tài)變化是血小板活化的早期事件,MLC磷酸化以及與細(xì)胞骨架結(jié)合是觸發(fā)血小板形態(tài)變化的主要原因[45]。血小板中的MYPT亞型主要是MYPT1。MYPT1可影響MLC的磷酸化,調(diào)控血小板活化。

Rho/ROCK通路在血小板活化過程中發(fā)揮重要作用[46],此外,還參與內(nèi)皮功能障礙的調(diào)節(jié)、炎癥等,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29]。另有研究[47]發(fā)現(xiàn),ROCK的抑制顯著限制了喂食無膽酸鹽高脂肪飲食的低密度脂蛋白受體敲除小鼠的早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。這表明抑制ROCK是治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。

4.5 腦卒中

缺血性腦卒中由大腦缺血缺氧而引起。小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[48]。研究發(fā)現(xiàn),ROCK抑制劑Fasudil可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子[49],且ROCK在T細(xì)胞的活化及跨內(nèi)皮遷移等過程中發(fā)揮重要作用[50]。此外,血小板ROCK2對(duì)血栓形成和穩(wěn)定至關(guān)重要,是血栓栓塞性腦卒中的重要致病介質(zhì)[51]。MYPT作為Rho/ROCK通路的主要下游靶標(biāo),參與T細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移[50]、血小板活化等多個(gè)過程的調(diào)控,在腦卒中的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)語

MYPT家族成員在結(jié)構(gòu)上存在相似性,但在組織分布上具有差異,MYPT對(duì)MLC磷酸化在參與細(xì)胞收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用,參與Rho/ROCK通路與NO/cGMP/PKG通路的調(diào)控。MYPT1作為ROCK的主要下游靶標(biāo),是目前MYPT家族研究最為廣泛的,參與許多心血管疾病如心臟肥大、心力衰竭及高血壓等的發(fā)生發(fā)展,家族其他成員如TIMAP與心血管疾病的聯(lián)系也有報(bào)道,但家族成員之間是否存在相互作用影響疾病的發(fā)生發(fā)展值得探討?？傊?MYPT家族在心血管疾病中的功能表現(xiàn),有望成為疾病防治的潛在靶標(biāo)。