楚秉泉, 李成峰, 丁 黎, 郭正彥, 王世宇, 孫偉杰, 金唯一, 何 勇

1. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 杭州 310023 2. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058 3. 杭州方回春堂集團(tuán)有限公司, 浙江 杭州 311500

引 言

微藻是一種水生光養(yǎng)型單細(xì)胞微生物, 具有易于培養(yǎng)、 生長(zhǎng)周期短、 單位面積產(chǎn)量大和不占用農(nóng)業(yè)用地等特點(diǎn), 在添加劑、 生物固碳、 可再生生物能源等多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。 較高的培養(yǎng)成本始終是限制微藻商業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸之一[1]。 在養(yǎng)殖過程中諸多因素如光照、 溫度、 培養(yǎng)基、 磁場(chǎng)等都會(huì)影響微藻生長(zhǎng)及胞內(nèi)物質(zhì)合成。 因此, 開發(fā)快速、 簡(jiǎn)單、 有效的無損檢測(cè)方法, 實(shí)現(xiàn)微藻生長(zhǎng)過程代謝信息的實(shí)時(shí)獲取, 并據(jù)此及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件, 對(duì)保障微藻高效優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)、 降低養(yǎng)殖成本至關(guān)重要。 傳統(tǒng)檢測(cè)微藻生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物(如碳水化合物、 蛋白質(zhì)等)的方法雖具有很高的靈敏度和特異性, 但高昂的設(shè)備及專業(yè)操作人員不僅增加了微藻養(yǎng)殖成本, 同時(shí)也費(fèi)時(shí)費(fèi)力且無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模實(shí)時(shí)無損檢測(cè)。

在微藻商業(yè)化養(yǎng)殖過程中, 應(yīng)用智慧農(nóng)業(yè), 可以帶來新的技術(shù)力量和科學(xué)的管理方法, 實(shí)現(xiàn)智能化養(yǎng)殖, 精準(zhǔn)化管理, 提高微藻產(chǎn)量, 降低培養(yǎng)成本。 智慧農(nóng)業(yè)是指利用物聯(lián)網(wǎng)技術(shù), 采集農(nóng)業(yè)數(shù)據(jù), 并通過云計(jì)算、 人工智能、 大數(shù)據(jù)等技術(shù)傳輸分析并建立決策模型, 對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行智能化管理的新興技術(shù)手段。 在智慧農(nóng)業(yè)中, 如何方便、 快速、 準(zhǔn)確地獲取作物信息, 是其關(guān)鍵問題之一[2]。 高光譜成像(hyperspectral imaging, HSI)技術(shù)作為一種綜合技術(shù), 集精密光學(xué)機(jī)械、 信號(hào)探測(cè)、 信息處理和計(jì)算機(jī)技術(shù)等于一體, 能同時(shí)表征像元光譜信息和空間物理特性, 目前已有許多研究致力于將其引入農(nóng)業(yè)生產(chǎn), 助力智慧農(nóng)業(yè)。 例如, 農(nóng)作物生化特性檢測(cè)、 營(yíng)養(yǎng)狀況監(jiān)測(cè)以及物種分類判別等。 HSI具有快速、 高效、 無損、 低價(jià)等特點(diǎn), 近些年也有相關(guān)研究將其應(yīng)用在微藻生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)中。 例如, Xu等[3]采用透射光譜對(duì)棕囊藻(phaeocystis)生長(zhǎng)階段進(jìn)行監(jiān)測(cè); Lian等[4]基于高光譜熒光成像技術(shù)分析藍(lán)藻色素的分布和濃度; Lorenzo等[5]利用高光譜成像技術(shù)檢測(cè)集胞藻(Synechocystissp.)中聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrates)的累積情況。 前期文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn), 將HSI應(yīng)用于微藻生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)方面研究多集中在油脂及其特性、 色素等方面, 對(duì)于同作為微藻胞內(nèi)重要營(yíng)養(yǎng)成分的碳水化合物、 蛋白質(zhì)等的HSI研究則尚未見報(bào)到, 以往研究中所涉及的預(yù)處理方法、 特征選擇方法和建模算法相對(duì)較單一, 模型優(yōu)化有待進(jìn)一步完善[6]。

斜生四鏈藻(Tetradesmusobliquus)是一種在淡水中生長(zhǎng)、 適合大規(guī)模養(yǎng)殖的微藻, 富含油脂、 碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分, 具有很大的商業(yè)應(yīng)用潛力。 碳水化合物、 蛋白質(zhì)和油脂是微藻細(xì)胞內(nèi)碳存在的主要形式, 各自合成代謝存在相互影響、 共同競(jìng)爭(zhēng)碳源底物現(xiàn)象。 即通過理解碳水化合物、 蛋白質(zhì)和油脂在微藻中的代謝分配規(guī)律及機(jī)制, 進(jìn)而采取合理手段進(jìn)行干預(yù)誘導(dǎo), 是提高微藻生產(chǎn)效率、 降低養(yǎng)殖成本的重要途徑。 要實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo), 首先需要實(shí)現(xiàn)斜生四鏈藻培養(yǎng)過程中碳水化合物、 蛋白質(zhì)和油脂的快速、 無損和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。 前期利用可見/近紅外(visible/near infrared, VIS/NIR)HSI對(duì)斜生四鏈藻油脂及脂肪酸不飽和度進(jìn)行了建模分析及可視化研究, 取得了較好的效果[7]。 鑒于碳水化合物和蛋白質(zhì)較油脂具有完全不同的特性和化學(xué)基團(tuán), 國(guó)內(nèi)外未有相關(guān)報(bào)道, 故十分有必要對(duì)這兩種成分進(jìn)行HSI分析研究。

本研究以斜生四鏈藻為對(duì)象, 采用VIS/NIR HSI技術(shù)結(jié)合12種光譜預(yù)處理方式、 3種特征選擇算法和4種建模方法, 對(duì)HSI應(yīng)用于斜生四鏈藻生長(zhǎng)代謝信息實(shí)時(shí)無損獲取的可行性進(jìn)行了探究, 并對(duì)藻液中生物量、 碳水化合物和蛋白質(zhì)的空間分布和豐度進(jìn)行可視化展示。 以期為斜生四鏈藻規(guī)?；囵B(yǎng)過程的優(yōu)化控制提供實(shí)時(shí)、 快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

斜生四鏈藻(T.obliquus)購置于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(FACHB), 采用BG11培養(yǎng)基(配方由FACHB提供)置于條件為溫度25 ℃、 濕度60%、 光強(qiáng)(100±10) μmol·m-2·s-1、 光照時(shí)間12 h·d-1的人工智能氣候箱中培養(yǎng), 培養(yǎng)期間每天早、 中、 晚各搖微藻1次。 穩(wěn)定培養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

由于前期研究發(fā)現(xiàn)30 mT的磁場(chǎng)結(jié)合100 μmol·m-2·s-1環(huán)繞式LED綠光對(duì)斜生四鏈藻生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用[8], 故本實(shí)驗(yàn)采用此條件培養(yǎng)微藻, 重復(fù)25組。 其他條件與穩(wěn)定培養(yǎng)期相同。

1.2 光譜數(shù)據(jù)獲取

準(zhǔn)確量取45 mL混勻的藻液, 倒于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中, 立即采用ImSpector V10E可見光(VIS)高光譜成像(HSI)系統(tǒng)(Spectral Imaging Ltd., Specim, Finland, 380～1 030 nm, 512 wavebands)進(jìn)行掃描獲得VIS光譜數(shù)據(jù)。 考慮到NIR光譜需要更高的反射率, 故將藻液濃縮10倍后于35 mm培養(yǎng)皿, 采用ImSpector N17ENIR HSI(Spectral Imaging Ltd., Specim, Finland, 870～1 730 nm, 256 wavebands)獲得樣本NIR數(shù)據(jù)[7]。 每隔1 d(即培養(yǎng)的第1、 3、 5、 7、 9、 11、 13和15天)進(jìn)行取樣HSI掃描, 即一共采集25組×8次=200個(gè)樣本數(shù)據(jù)。

圖1為斜生四鏈藻VIS(a)和NIR(b)掃描圖像及感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)選取示意圖(紅色框)。 采用ENVI軟件(ITT Visual Information Solutions, United States)截取可見光譜40 000個(gè)像素點(diǎn)作為ROI并得到ROI的平均光譜; 截取近紅外光譜400個(gè)像素點(diǎn)作為ROI并得到ROI的平均光譜。

圖2(a, b)展示了斜生四鏈藻在生長(zhǎng)周期內(nèi)不同時(shí)間獲得的200個(gè)樣本的VIS(a)和NIR(b)平均光譜。 由于光譜首尾存在噪聲(圖中陰影部分), 因此截取VIS區(qū)392～1 023 nm 共500個(gè)波段和NIRS區(qū)931.40～1 645.82 nm共213個(gè)波段, 作為光譜建模波段。 VIS/NIRS光譜主要反映含氫基團(tuán)(如C-H、 O-H、 N-H等)振動(dòng)的倍頻與合頻吸收, 可通過光譜數(shù)據(jù)處理及建模分析獲取樣本中豐富的結(jié)構(gòu)和組成信息。 例如, 屬于色素吸收波段的430和680 nm以及屬于水分子吸收波段的980 nm處有明顯的反射波谷[5]; 1 159 nm 附近的反射波谷則與O-H、 C-H有關(guān)[9]; 位于1 490～1 600 nm歸屬于N-H吸收譜帶[10], 也出現(xiàn)反射率降低。

圖2 斜生四鏈藻藻液的VIS(a)與NIRS(b)均值光譜圖Fig.2 VIS (a) and NIRS (b) average spectral data of T. obliquus liquid

1.3 理化測(cè)定與分析

樣本的光譜數(shù)據(jù)采集后, 立刻采用相應(yīng)方法對(duì)樣本中生物量、 碳水化合物和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析, 具體方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 數(shù)據(jù)校正

由于數(shù)據(jù)采集過程中設(shè)備存在一定的暗電流且不同波段下光源的分布不均勻會(huì)產(chǎn)生較大的噪聲, 因此需要對(duì)高光譜圖像進(jìn)行黑白校正, 校正公式如式(1)

(1)

式(1)中:R0為原始高光譜圖像,Rd為反射率0%的黑板高光譜圖像,Rw為反射率100%的白板高光譜圖像,R為校正后的高光圖圖像。

1.5 光譜預(yù)處理

光譜采集過程中難免會(huì)受到環(huán)境、 設(shè)備等各種條件的影響, 使得光譜出現(xiàn)基線漂移、 噪聲、 散射等問題。 因此需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理, 從中選擇合適的預(yù)處理方法提高模型的預(yù)測(cè)能力。

本研究采用12種較為常用的預(yù)處理方法[10], 包括原始光譜(raw)、 標(biāo)準(zhǔn)化(autosacling)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化(standard normal variate transform, SNV)、 均值中心化(mean centering, MC)、 最大最小歸一化(min-max)、 矢量歸一化(vector normalization, VN)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 S-G(Savitzky-Golay smoothing)變換、 滑動(dòng)平均濾波(moving average filter, MAF)、 小波變換(wavelet transform, WT)、 一階差分(first difference, FD)和二階差分(second difference, SD)。

1.6 特征波長(zhǎng)選取

特征波長(zhǎng)的選取可以大大降低樣本的維度, 簡(jiǎn)化模型; 同時(shí)可以剔除不相關(guān)或冗余信息, 提升模型預(yù)測(cè)能力和穩(wěn)健性。 本研究采用競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)采樣算法(competitive adaptive reweighted sampling, CARS)、 區(qū)間隨機(jī)蛙跳算法(interval Random Frog, iRF)和模擬退火算法(simulated annealing, SA)進(jìn)行特征波長(zhǎng)選取。

1.7 校正建模

采用了多元線性回歸(multiple linear regression, MLR)、 偏最小二乘(partial least squares, PLS)、 支持向量機(jī)回歸(support vector regression, SVR)以及隨機(jī)森林回歸(random forest regression, RFR), 用于構(gòu)建光譜信息與目標(biāo)組分之間的分析模型。

1.8 模型評(píng)估

2 結(jié)果與討論

2.1 生物量的高光譜分析

2.1.1 高光譜采集及預(yù)處理

將每次采集的25份斜生四鏈藻(T.obliquus)藻液樣本的高光譜數(shù)據(jù)按18∶7分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集, 即200個(gè)光譜數(shù)據(jù)中隨機(jī)選擇144個(gè)作為訓(xùn)練集, 56個(gè)作為預(yù)測(cè)集。 同時(shí), 采用偏最小二乘(PLS)進(jìn)行全波段建模, 評(píng)估不同預(yù)處理方法的優(yōu)劣, 最終選定較為良好的預(yù)處理方法。 表1為200個(gè)藻液樣本生物量范圍, 表2為不同光譜預(yù)處理方法處理后的建模效果。

表1 斜生四鏈藻藻液樣本中生物量范圍(mg·L-1)Table 1 Biomass range of T. obliquus liquid samples

2.1.2 光譜特征選擇

圖3 不同預(yù)處理方式下藻液中生物量CARS特征選擇建模結(jié)果評(píng)估Fig.3 Evaluation of microalgal liquid biomass model by CARS feature selection under different preprocessing methods

2.1.3 光譜建模

根據(jù)特征波段分析結(jié)果, 最終選擇VN預(yù)處理光譜數(shù)據(jù), 然后采用CARS選擇特征波段建立CARS-PLS、 CARS-MLR模型和CARS-SVM模型。 其結(jié)果見表3。

表3 經(jīng)不同算法處理的藻液中生物量建模評(píng)估結(jié)果Table 3 Evaluation results of biomass model by different modeling algorithms

由表3可知, CARS-PLS和CARS-MLR預(yù)測(cè)精度, 泛化能力都很好, 較全波段建模, 整體模型預(yù)測(cè)能力有較大提升, 而CARS-SVR模型效果較差。 綜合考量, 本實(shí)驗(yàn)最終選擇VN光譜預(yù)處理方式結(jié)合CARS-MLR進(jìn)行建模。 其模型公式如下

y=-41.096 6-21 806.072 34X452.35 nm+

16 779.819 6X487.46 nm+126 600.494 1X536.53 nm-

89 997.815 2X537.76 nm-165 549.437X593.75 nm+

83 791.885 7X610.06 nm-399 601.426 1X654.22 nm+

380 768.452 4X655.49 nm+214 234.526 9X714.04 nm-

188 444.272 9X715.32 nm-33 342.143 5X940.81 nm

(1)

式(1)中,Xi為波段第i個(gè)波段經(jīng)過VN處理后的光譜值。 所選波段中452.35、 487.46、 536.53、 537.76和593.75 nm波段與色素有關(guān); 610.06、 654.22、 655.49、 714.04和715.32 nm波段屬于C-H基團(tuán)振動(dòng)譜帶[7]; 940 nm屬于水的吸收范圍[9]; 生物量特征波段選擇與前人研究一致[12]。 圖4為光譜數(shù)據(jù)經(jīng)VN預(yù)處理后基于CARS-MLR模型的斜生四鏈藻藻液生物量的預(yù)測(cè)結(jié)果。

圖4 基于CARS-MLR模型的斜生四鏈藻藻液生物量的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction result of biomass of T. obliquus liquid based on CARS-MLR model

2.1.4 光譜成像

高光譜圖像不僅能夠?qū)ι锪繚舛茸龀鰷?zhǔn)確預(yù)測(cè), 還可將模型應(yīng)用于圖像的每個(gè)像素點(diǎn)。 通過對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)的生物量濃度進(jìn)行預(yù)測(cè), 從而得到生物量在高光譜圖像中的分布圖。 圖5(a-h)為CARS-MLR模型預(yù)測(cè)斜生四鏈藻藻液樣本中生物量的高光譜圖像反演熱力圖。 可以看出, 從培養(yǎng)第9天起[圖5(a-e)], 斜生四鏈藻生長(zhǎng)速率顯著增加, 分析認(rèn)為培養(yǎng)前期(D1-D9)微藻以適應(yīng)環(huán)境為主(調(diào)整期), 生物量增長(zhǎng)較為滯緩, 而從D9起進(jìn)入生長(zhǎng)指數(shù)期。

圖5 磁場(chǎng)和綠光培養(yǎng)下斜生四鏈藻藻液中生物量分布的化學(xué)成像圖Fig.5 Chemical imaging of biomass distribution in liquid suspense of T. obliquus under MF and green LED exposure

2.2 碳水化合物的高光譜分析

2.2.1 光譜預(yù)處理

按同“2.1.1”的方式將藻液樣本分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集。 斜生四鏈藻藻液中碳水化合物濃度范圍如表4所示。

表4 斜生四鏈藻藻液樣本中碳水化合物含量范圍(mg·L-1)Table 4 Carbohydrate range of T. obliquus liquid samples (mg·L-1)

表5 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)藻液中碳水化合物含量建模結(jié)果評(píng)估Table 5 Evaluation of carbohydrate model using different spectral preprocessing methods

2.2.2 光譜特征選擇

在光譜預(yù)處理的基礎(chǔ)之上, 選擇raw光譜、 autoscaling、 MC、 S-G變換、 MAF, WT這6種效果相對(duì)好的預(yù)處理方式結(jié)合區(qū)間隨機(jī)蛙跳(iRF)的方法進(jìn)行光譜特征選擇, 利用PLS算法建模, 其評(píng)估結(jié)果見圖6。

2.2.3 光譜建模

表6 經(jīng)不同算法處理的藻液中碳水化合物含量建模評(píng)估結(jié)果Table 6 Evaluation results of carbohydrate model of different modeling algorithms

圖7 基于iRF-RFR模型的斜生四鏈藻藻液中碳水化合物含量的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Prediction result of carbohydrate of T. obliquus liquid based on iRF-RFR model

2.2.4 光譜成像

采用iRF-RFR模型, 對(duì)斜生四鏈藻選定的藻液ROI區(qū)域的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行反演, 得到每個(gè)像素點(diǎn)碳水化合物的濃度值, 形成其在藻液ROI區(qū)域的空間分布圖。 圖8為采用30 mT的磁場(chǎng)結(jié)合100 μmol·m-2·s-1環(huán)繞式LED綠光連續(xù)培養(yǎng)15 d的斜生四鏈藻藻液中碳水化合物的豐度變化。 可以看出, 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), 藻液中碳水化合物濃度逐漸增大, 尤其是從培養(yǎng)第11天起, 碳水化合物的累積效率明顯增加。 但相對(duì)于生物量的增長(zhǎng)有一定的滯后性, 可能的解釋是隨著微藻密度的增加, 藻液透光性明顯降低, 反過來抑制了微藻的光合作用, 從而導(dǎo)致光合作用的主要產(chǎn)物--碳水化合物合成的減緩[15]。

圖8 磁場(chǎng)和綠光培養(yǎng)下斜生四鏈藻藻液中碳水化合物分布的化學(xué)成像圖Fig.8 Chemical imaging of carbohydrate distribution in liquid suspense of T. obliquus under MF and green LED exposure

2.3 蛋白質(zhì)的高光譜分析

2.3.1 光譜預(yù)處理

按同“2.1.1”的方式將200個(gè)斜生四鏈藻藻液光譜數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集。 藻液中蛋白質(zhì)的濃度范圍見表7。 對(duì)比分析12種光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法的效果, 表明raw光譜、 autoscaling、 MC、 S-G變換、 MAF和WT效果相對(duì)較好(表8)。

表7 斜生四鏈藻藻液樣本中蛋白質(zhì)含量范圍(mg·L-1)Table 7 Protein range of T. obliquus liquid samples

表8 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)藻液中蛋白質(zhì)含量建模結(jié)果評(píng)估Table 8 Evaluation of protein model using different spectral preprocessing methods

2.3.2 光譜特征選擇

圖9 不同預(yù)處理方式下藻液中蛋白質(zhì)含量SA特征選擇建模結(jié)果評(píng)估Fig.9 Evaluation of microalgal liquid protein model by SA feature selection under different pretreatment methods

2.3.3 光譜建模

在前期SA-MLR的基礎(chǔ)上, 對(duì)選擇的特征波段采用PLS、 SVR以及隨機(jī)森林回歸(RFR)算法進(jìn)行建模, 并比較這幾種方法的建模效果。 結(jié)果如表9所示, 總體以SA-RFR建模效果最佳。 圖10為光譜數(shù)據(jù)經(jīng)WT預(yù)處理后基于SA-RFR模型的斜生四鏈藻藻液中蛋白質(zhì)含量的預(yù)測(cè)結(jié)果。

表9 經(jīng)不同算法處理的藻液中蛋白質(zhì)含量建模評(píng)估結(jié)果Table 9 Evaluation results of protein model by different modeling algorithms

圖10 基于SA-RFR模型的斜生四鏈藻藻液中蛋白質(zhì)含量的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.10 Prediction result of protein of T. obliquus liquid based on SA-RFR model

2.3.4 光譜成像

采用前期優(yōu)化篩選的SA-RFR模型對(duì)斜生四鏈藻藻液中的ROI區(qū)域的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行反演, 得到每個(gè)像素點(diǎn)的蛋白質(zhì)濃度值, 進(jìn)而描繪出蛋白質(zhì)在ROI區(qū)域上的豐度分布圖(圖11)。 從圖可以看出, 培養(yǎng)前7天, 藻液中蛋白質(zhì)含量增加速率較緩慢, 但從培養(yǎng)D9起, 蛋白質(zhì)累積效率顯著增高, 與生物量的變化較為同步, 可能是本研究采用的培養(yǎng)條件對(duì)斜生四鏈藻中蛋白質(zhì)含量占比影響較小[8]。

圖11 磁場(chǎng)和綠光培養(yǎng)下斜生四鏈藻藻液中蛋白質(zhì)分布的化學(xué)成像圖Fig.11 Chemical imaging of protein distribution in liquid suspense of T. obliquus under MF and green LED exposure

3 結(jié) 論