楊義 周洵 張軍 李波 王新星 羅弦 葛正行

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)（貴陽 550025）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院2呼吸內(nèi)科，3科研教學(xué)部（貴陽 550003）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統(tǒng)常見病，以氣流受限不完全可逆為特征的肺部疾?。?］。COPD 病理變化有慢性支氣管炎、氣道重建、肺動(dòng)脈重建、肺氣腫等，而以慢性支管炎和肺氣腫為主要病理改變，在COPD 病程進(jìn)展中，氣道重建是關(guān)鍵，氣道重建實(shí)質(zhì)是小氣道成纖維細(xì)胞的增生，目前研究［2-4］顯示MMP-9、PDGF、TGF-β1 等細(xì)胞因子是COPD 氣道重建的主要參與因子。HSG基因Mitofusin 2，對細(xì)胞增殖有抑制作用，研究［5-6］發(fā)現(xiàn)HSG在正常細(xì)胞呈高表達(dá)，在增殖細(xì)胞中呈低表達(dá)。Wnt 信號通路影響著機(jī)體的應(yīng)激、免疫、細(xì)胞的分化、調(diào)亡等生理病理過程［7-8］。研究［9-11］表明Wnt信號通路與肺纖維化、特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺間質(zhì)性疾病等疾病的機(jī)制有重要聯(lián)系，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、調(diào)亡、癌變及機(jī)體應(yīng)激、免疫等生理病理過程。而在呼吸系統(tǒng)，Wnt 信號通路異常激活也與慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、間質(zhì)性肺疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。而TPA能夠通過增強(qiáng)CK1激酶活性而上調(diào)Wnt信號通路［13］。Wnt信號通路還和MAPK信號通路間有著相互影響［14］。MAPK/ERK 信號通路也是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖的信號通路，影響著肺部發(fā)育，也有研究［15-17］報(bào)道其與肺部腫瘤和肺炎密切相關(guān)。而EGF 作為生長因子，也是經(jīng)典的MAPK通過的激活因子［18］。HSG 基因?qū)nt、MAPK 的交叉作用研究較少，推測其在COPD 中起重要作用，本研究構(gòu)建HSG 過表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染COPD 氣道成纖維細(xì)胞并利用TPA 處理細(xì)胞而上調(diào)Wnt 信號通路，利用EGF 處理細(xì)胞而上調(diào)MAPK 信號通路，研究相關(guān)基因表達(dá)情況的變化，為尋找有效的控制和預(yù)防COPD 發(fā)展的方法提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD 大鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002） 。

1.2 主要試劑DMEM（gibco 10566-016）；TPA（425KO21，Solarbio）；rEGF （L1450411， Cyagen）；Lipofectamine?3000（invitrogen， 18882752）；OPTIMEM?I （gibco 331985-062）；Rat TGF-β1 試劑盒（MM-0181R1，上海酶聯(lián)）；Rat MMP-9 試劑盒（MM-20918R1，上海酶聯(lián)）；Rat PDGF試劑盒（MM-0076R1，上海酶聯(lián)）；Anti-Vimentin antibody （ab92547，abcam）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2000）；Rabbit Polyclonal Anti-Mitofusin 2（別名：HSG） （ab124773，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-β-catenin （ab32572，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-RhoA （ab187026，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-Wnt5a （bs-1948R，Bioss）；Rabbit Polyclonal Anti-ERK1/2 （D13.14.4E，Cell Signaling）。

1.3 COPD 模型建立在備皮區(qū)域用碘伏消毒；用手術(shù)剪刀沿著頸部中間剪開表皮和肌肉，使暴露出氣管；將吸取好的木瓜蛋白酶溶液（2 mg/mL）按照給藥量為0.1 mL/100 g 沿著氣管自上而下注射入氣管內(nèi)使其到達(dá)肺部，而后將大鼠拿起旋轉(zhuǎn)一周，使其充分進(jìn)入肺部；縫合傷口后放置于電熱毯上待其蘇醒后回籠正常飼養(yǎng)8 d。

1.4 COPD 模型大鼠氣道成纖維細(xì)胞原代分離麻醉處死大鼠，無菌條件下開胸，將切除的新鮮的COPD 大鼠氣道組織標(biāo)本，在無菌工作臺里對組織標(biāo)本反復(fù)用加入雙抗的PBS沖洗5遍。無菌手術(shù)刀刮去氣道周圍組織和氣道內(nèi)膜，用消毒好的眼科剪將組織塊剪成2 mm × 2 mm 大小。將剪好的組織塊貼到培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待其完全貼壁后，在培養(yǎng)板中加入新配制的DMEM + 20% FBS + 雙抗培養(yǎng)液，再將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況再進(jìn)行常規(guī)處理。棄去組織塊及上清液，加入新配制的DMEM + 20% FBS + 雙抗培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中。

1.5 免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用4%的多聚甲醛固定15 min，再用0.5% Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min。清洗后，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。吸掉封閉液，不洗，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗Vimentin（1∶250），37 ℃孵育3 h。清洗后，吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1：200），37 ℃孵育30 min；清洗后，滴加DAPI 避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，之后洗去多余的DAPI；用50%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6 過表達(dá)HSG載體的構(gòu)建NCBI查找HSG基因序列（NM_130894），引入酶切位點(diǎn)（HindIII/XhoI）生物合成基因片段克隆至pCDNA3.1（+）載體上。

1.7 熒光定量PCR取各組進(jìn)行RNA 的提取，提取RNA 后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，算出各組細(xì)胞中HSG、β-catenin、Wnt5a、ERK2 和RhoA 的相對表達(dá)量。引物如下：HSG F primer：AACTCCATCGTCACCGTCAA；HSG R primer：CAACCCGCAGGAAGCAA；RhoA F primer：AGAGTTGGCTTTATGGGACAC；RhoA R primer：GATGATGGGCACATTTGGA；Wnt5a F primer：GCTTCAACTCCCCAACCA；Wnt5a R primer：CTCGCAGCCGTCCATC；ERK2 F primer：CAAGCCTTCCAACCTCCTG；ERK2 R primer：TGTTCCACGGCACCTTATTT；β -catenin F primer：TTATGAGTGGGAGCAAGGC；βcatenin R primer：ACAACGGGCTGTTTCTACG；GAPDH F primer：GCAAGTTCAACGGCACAG；GAPDH R primer：CGCCAGTAGACTCCACGAC。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組空白組（Normal）；空載組（Blank）；HSG 過表達(dá)載體（HSG-oe）；空白+TPA；空載+TAP；HSG 過表達(dá)載體+TPA；空白+EGF；空載+EGF；HSG 過表達(dá)載體+EGF。TPA：10 nmol/L；rEGF：50 ng/mL，需轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的分組在轉(zhuǎn)染48 h 后再加藥作用24 h。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種細(xì)胞至80%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染，前1 d接種或換液，取出DNA或RNA離心3 000 r/min，5 min；使用Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3000 試劑-充分混勻，避光室溫孵育5 min。在每管已稀釋的Lipofectamine?3000 試劑中加入稀釋的DNA 或RNA 中混勻，室溫避光孵育45 min。按照上述分組，加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物中或RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h。

1.10 流式凋亡檢測收集1 × 106～ 3 × 106個(gè)細(xì)胞，離心去上清，加1 mL PBS 洗滌一遍1 500 r/min離心，5 min，棄上清。用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer。取300 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式儀檢測。

1.11 ELISA 檢測分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.12 Western blot（WB）取各組細(xì)胞加入相應(yīng)的裂解液，4 ℃裂解30 min，在10 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清，即得總蛋白。利用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1 ～ 2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30 ～ 50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1 ～ 2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.13 流式周期檢測收集各組細(xì)胞用EP 管分裝好后向每管中加入1 mL PBS 溶液2 000 r/min 離心2 min，棄上清，重復(fù)3 次。離心收集1 ～ 5 × 105個(gè)細(xì)胞。加入1 mL 冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定12 h。按照說明書混合染色緩沖液、碘化丙啶和RNAse A，配制碘化丙啶染色液。每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。之后用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm 波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況并進(jìn)行細(xì)胞DNA 含量分析和光散射分析，根據(jù)結(jié)果擬合得出細(xì)胞周期情況。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD 模型的組織學(xué)鑒定見圖1，正常對照組大鼠肺組織病理切片光鏡下見肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整，無肺泡腔病理性擴(kuò)張及融合，支氣管管壁未見增厚。氣道粘膜上皮光滑，纖毛排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸澗，氣管腔內(nèi)無明顯炎性滲出。COPD 模型組大鼠肺組織HE 染色出現(xiàn)肺氣腫病理變化，肺泡出現(xiàn)擴(kuò)張，肺泡壁變薄，并逐步斷裂融合成肺大皰，肺泡數(shù)目顯著減少。氣道粘膜纖毛出現(xiàn)粘連、變性和壞死，甚至脫落。支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，有大量的炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤管腔，小氣道管腔狹窄同時(shí)伴小氣道壁纖維結(jié)締組織増生。

圖1 肺組織HE 染色結(jié)果Fig.1 HE staining of lung tissue

2.2 成纖維細(xì)胞鑒定見圖2，紅色的是蛋白Vimentin，藍(lán)色是細(xì)胞核，分離培養(yǎng)所得的細(xì)胞中都大量表達(dá)了Vimentin，可以判斷細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。

圖2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果（100 ×）Fig.2 Results of cellular immunofluorescence （100 ×）

2.3 qPCR 檢測各組實(shí)驗(yàn)HSG 和Wnt 信號通路基因表達(dá)情況見圖3，qPCR檢測顯示過表達(dá)HSG能抑制基因Wnt5a 和ERK1/2 的表達(dá)。受TPA 處理后，Wnt5a 表達(dá)上調(diào)而HSG 表達(dá)受抑制；受EGF處理后，ERK2 表達(dá)上調(diào)而HSG 表達(dá)受抑制。

圖3 PCR 檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results

2.4 WB 檢測各組實(shí)驗(yàn)HSG 和Wnt 信號通路基因表達(dá)情況見圖4，WB 檢測顯示過表達(dá)HSG 能抑制基因Wnt5a 和ERK1/2 的表達(dá)。受TPA 處理后，Wnt5a 表達(dá)上調(diào)而HSG 表達(dá)受抑制；受EGF 處理后，ERK2 表達(dá)上調(diào)而HSG 表達(dá)受抑制。

圖4 蛋白質(zhì)表達(dá)的WB 檢測結(jié)果Fig.4 Western blot （WB） detection results of protein expression

2.5 ELISA 檢測各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞上清中TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量見圖5，ELISA 檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)HSG 能降低TGF-β1、PDGF、MMP-9的含量，受相應(yīng)激動(dòng)劑處理后TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量上升，而過表達(dá)HSG 依然有抑制效果。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量Fig.5 Contents of TGF-β1， PDGF， and MMP-9 in the cell culture supernatant

2.6 細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡見圖6，各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示過表達(dá)HSG 會明顯上調(diào)細(xì)胞凋亡率，而相應(yīng)的激動(dòng)劑處理會降低過表達(dá)HSG 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。

圖6 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果Fig.6 Results of cell apoptosis rate detection

3 討論

本文的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在檢驗(yàn)過表達(dá)HSG 基因能否抑制COPD 模型大鼠氣道中的成纖維細(xì)胞生長，從而抑制相關(guān)的肺部纖維化，并研究此效果與Wnt 信號通路和MAPK 信號通路的相關(guān)性。Wnt信號通路和MAPK 信號通路功能上有著相似性，而且兩個(gè)信號通路間也有著相互促進(jìn)的作用［19-20］。MAPK 信號通路中的成分例如ERK1/2、p38 和JNK 能夠促進(jìn)LRP6 蛋白質(zhì)磷酸化，從而上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路［21］。Wnt5a 則能夠促進(jìn)ERK1/2蛋白質(zhì)磷酸化［14，22］。TGF-β1 是Wnt 信號通路的一個(gè)靶基因，廣泛分布于氣管支氣管內(nèi)，在COPD 發(fā)病過程中其主要來源于肺部局部浸潤的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及氣道壁成纖維細(xì)胞，它是最重要的致纖維化細(xì)胞因子，并且能反向調(diào)節(jié)刺激成纖維細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道纖維增生［23-25］。MMP-9 則是另一個(gè)受Wnt 信號通路調(diào)節(jié)的基因，在COPD 的發(fā)病機(jī)制上主要是通過對肺泡基質(zhì)成分的破壞，加重?cái)U(kuò)大肺泡腔，導(dǎo)致其彈性下降，回縮力降低；另一方面，通過破壞上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞而參與氣道組織重建［26-28］。而PDGF是對間質(zhì)細(xì)胞有著顯著影響的生長因子，能刺激小氣道成纖維細(xì)胞趨化和增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成，是引起氣道重建機(jī)制之一，而其受體屬于酪氨酸激酶受體，可以激活MAPK 信號通路和Wnt 信號通路［29-31］。Wnt 信號通路可通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）介導(dǎo)的磷酸化和抑制細(xì)胞質(zhì)中β-連環(huán)素的降解來誘導(dǎo)EMT［32］。TGF-β 可通過MAPK 信號通路（如p38，Erk1/2）刺激細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和積累從而誘導(dǎo)EMT［33］。進(jìn)一步證實(shí)差異基因可能通過影響EMT/MET 平衡從而參與細(xì)胞纖維化進(jìn)程進(jìn)而改善或加劇COPD 癥狀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)HSG 會大大提高成纖維細(xì)胞凋亡率，降低成纖維細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞分泌TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量，可以推測過表達(dá)HSG 能抑制肺部纖維化。而且過表達(dá)HSG會抑制Wnt5a 和ERK1/2 的表達(dá)，說明Wnt 信號通路和MAPK 信號通路都受到了抑制。用Wnt 信號通路激動(dòng)劑TPA 或者M(jìn)APK 信號通路激動(dòng)劑EGF處理成纖維細(xì)胞之后，相應(yīng)的Wnt5a 和ERK1/2 的表達(dá)上升，但是HSG 過表達(dá)組的Wnt5a 和ERK1/2的表達(dá)水平是明顯低于受對應(yīng)激動(dòng)劑處理的空載組的，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HSG 拮抗Wnt 信號通路和MAPK 信號通路。值得注意的是，在激動(dòng)劑處理成纖維細(xì)胞之后，正常對照組和空載組HSG 表達(dá)水平下降，同時(shí)HSG 過表達(dá)組的HSG 表達(dá)水平也明顯下降，約為受激動(dòng)劑處理前HSG 表達(dá)水平的三分之一。這說明Wnt 信號通路和MAPK 信號通路上調(diào)不僅調(diào)控抑制成纖維細(xì)胞本身的HSG 表達(dá)，也同樣調(diào)控抑制外源轉(zhuǎn)染的HSG 表達(dá)，由此可以推測Wnt 信號通路和MAPK 信號通路可以直接調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中HSG 的mRNA 水平，Wnt 信號通路和MAPK信號通路或能夠促進(jìn)HSG的mRNA降解，這也許涉及到受Wnt 信號通路和MAPK 信號通路誘導(dǎo)的microRNA。

綜上所述，HSG 基因通過拮抗Wnt 信號通路和MAPK 信號通路可以達(dá)到抑制肺部纖維化的效果。然而，研究并沒有對介導(dǎo)HSG 基因的上游通路及EMT 途徑影響纖維化進(jìn)行分析。在未來的研究中，將進(jìn)一步探索HSG 如何調(diào)節(jié)COPD 的纖維化，旨在明確HSG 在COPD 發(fā)展中的臨床價(jià)值和潛在機(jī)制。

【Author contributions】GE Zhengxing participated in project design and manuscript modification， YANG Yi participated in project design， experiments， and manuscript writing. ZHOU Xun， ZHANG Jun， LI Bo， WANG Xinxing， and LUO Xian all participated in the experiments. All authors have read and agreed to submit the final manuscript.